一株具有降解氟喹诺酮类抗生素功能的克雷伯氏菌LX及其应用

一株具有降解氟喹诺酮类抗生素功能的克雷伯氏菌lx及其应用
技术领域
1.本发明属于污水生物处理技术领域。更具体地，涉及一种降解氟喹诺酮类抗生素的克雷伯氏菌及其应用。


背景技术：

2.环丙沙星(ciprofloxacin，cip)作为第三代氟喹诺酮类抗生素，由于其能够通过导致dna旋回酶或拓扑异构酶iv的突变从而抑制细菌dna复制，已广泛应用于人类保健、家畜养殖和水产养殖行业。环丙沙星的过度使用和不完全处理导致其在不同环境中积累，这使得它在土壤、地表水、地下水、废水和沿海水中被检测到。另一方面，环境中抗生素耐药基因(arg，antibiotic resistant genes)和抗生素耐药细菌(arb，antibiotic resistant bacteria)的出现和发展也被视为21世纪人类健康安全和生态系统的全球性挑战。因此，有必要研究一种高效、环保的处理废水中环丙沙星的方法。
3.控制氟喹诺酮类污染的方法有很多，包括吸附、光催化降解、高级氧化技术和微生物降解。尽管吸附、光催化剂和高级氧化技术对环丙沙星具有较高的处理效率，但同时也存在一些问题，包括工艺过程中产生的二次污染、工艺操作的高成本和复杂的工艺设计。生物降解环丙沙星的相关技术因其成本低、效率高、易于控制和环境友好等优点受到广泛关注。在众多研究者的努力下，发现了一系列可在好氧或厌氧条件下对环丙沙星进行生物降解的微生物，包括thermus sp.c419、paraclostridium sp.s2、bradyrhizobium sp.glc_01、和ochrobactrum sp.gh125等。除此之外，专利cn113308413b采用布鲁氏菌(brucella sp.wxx-3制备发酵菌剂降解堆肥产品中氟喹诺酮类抗生素，专利cn112919628a使用厌氧副梭状芽孢杆菌s2处理含氟喹诺酮抗生素废水。然而，上述报道对于环丙沙星的降解大多为共代谢模式，即除环丙沙星外，降解过程中还有葡萄糖和乙酸钠等碳源的介入，即生物修复过程中增加了处理成本，并且关于克雷伯氏菌处理废水喹诺酮抗生素污染的应用鲜有报道，所以发掘可以在好氧环境下以氟喹诺酮类抗生素为单一碳源并实现高效降解效果的菌株具有重要意义。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明提出了克雷伯氏菌lx在降解氟喹诺酮类抗生素中的应用，该菌株适用于治理环境中含典型氟喹诺酮类抗生素废水的污染，具有重要意义。
5.本发明的第一个目的在于提供一株克雷伯氏菌lx。
6.本发明的第二个目的在于提供一种克雷伯氏菌的应用。
7.本发明的第三个目的在于提供一种降解氟喹诺酮类抗生素的制剂。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明首次确定了具有降解氟喹诺酮类抗生素的克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)lx，所述克雷伯氏菌lx在msm(含50mg/l环丙沙星)平板上生长，菌落为圆形，表
面光滑，颜色为透明至白色，是革兰氏阴性菌。克雷伯氏菌lx的主要理化特性为：菌株生长温度20～40℃，ph范围6～8，兼性厌氧生长，氧化酶为阴性，并从乳糖产生酸和气体。
10.本发明克雷伯氏菌lx在降解废水中氟喹诺酮类抗生素的应用。
11.优选地，降解条件为：降解温度为20～40℃，ph为7.0～8.0，初始接菌量为od600＝0.6～0.8。更优选地，降解温度为29℃，ph为6.3，初始接菌量为od600＝0.72。
12.优选地，所述氟喹诺酮类抗生素为环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星中的一种或多种。
13.一种降解氟喹诺酮类抗生素的制剂，其中包含所述的克雷伯氏菌lx。所述制剂为降解水体中氟喹诺酮类抗生素的制剂。
14.优选地，所述氟喹诺酮类抗生素为环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星中的一种或多种。
15.本发明通过从处理环丙沙星的好氧反应器中分离出一株在好氧条件下具有降解氟喹诺酮类抗生素功能的克雷伯氏菌lx，该菌株能在单一碳源基质环境下对50mg/l环丙沙星进行有效地降解，降解效率可达95％以上。
16.本发明提供的克雷伯氏菌lx在以环丙沙星为单一碳源下，能有效降解典型氟喹诺酮类抗生素。
17.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18.本发明提供的克雷伯氏菌lx具有较强的降解典型氟喹诺酮类抗生素的能力，尤其是降解环丙沙星的能力，在环丙沙星的浓度为50mg/l时，好氧条件下，降解4天，降解率可达90％以上。本发明提供的克雷伯氏菌lx尤其适用于环境中治理典型氟喹诺酮类抗生素的废水污染，能够达到环境修复的目的。
19.本发明克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)lx，已于2023年2月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc m 2023096，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
附图说明
20.图1为克雷伯氏菌lx的pcr电泳产物凝胶扫描图。
21.图2为克雷伯氏菌lx在不同培养基下的生长情况，其中(a)为以环丙沙星为唯一碳源基质的固态msm培养基，(b)为菌株lx在液体nm培养基培养至对数生长期的菌液光学显微镜图。
22.图3为克雷伯氏菌lx的系统发育树。
23.图4为克雷伯氏菌lx的生长曲线。
24.图5为克雷伯氏菌lx对不同初始环丙沙星浓度的降解情况。
25.图6为克雷伯氏菌lx对环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星的降解效果。
具体实施方式
26.下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂
和材料。
27.实施例1克雷伯氏菌lx的分离和鉴定
28.1.菌种的富集与分离
29.取广东省广州市猎德污水处理厂好氧池活性污泥，过60目筛后经0.01m磷酸缓冲溶液(phosphate buffer saline，pbs)清洗3次，静置沉淀30分钟，去上清，得到沉淀污泥后转移20ml置于200ml经灭菌处理的液体基础培养基(basal medium，bm)中，培养基成分如表1所示，室温条件下，通过磁力转子转动进行搅拌爆气以保证反应器的好氧环境。反应器初始碳源为1g/l葡萄糖和15mg/l环丙沙星，随着驯化时间的增大，逐渐减少葡萄糖的浓度，增加环丙沙星的浓度，以达到富集功能菌群的目的。其中驯化各阶段碳源变化如表2所示。得到稳定运行的反应器后，进行潜在功能菌株的筛选和鉴定，取菌悬液0.1ml逐级稀释成10-1
，10-2
，10-3
和10-4
的稀释液，分别取50μl稀释液涂布到平板msm培养基上，注意培养基上仅含一种碳源为50mg/l环丙沙星，在35℃下倒置平板培养一周得到环丙沙星耐药菌若干。用1μl接菌棒选择不同形态的单一菌斑进行平板划线培养，使潜在功能菌株传代两次达到纯化的目的，后选取平板上的独立菌斑转移至液体营养培养基(nutrient medium，nm)上进行富集培养。菌株生长至对数期后离心菌悬液得到菌体沉淀，使用pbs清洗三次后转移至100ml灭菌的液体msm培养基进行环丙沙星降解实验，其中环丙沙星的初始浓度为50mg/l。实验结束后，选取降解效果最好的菌株lx进行物种鉴定。
30.表1营养液成分与含量
[0031][0032]
表2猎德污水厂污泥驯化周期及碳源变化情况
[0033][0034]
2.菌种鉴定
[0035]
按照细菌基因组dna提取试剂盒上的方法提取菌株lx的dna后，对提取出来的dna样品使用通用引物27f和1492r进行pcr扩增，引物信息如表3所示，pcr扩增体系如表4所示，然后将扩增产物进行浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。得到的marker条带组成：m从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp(顺序依次是从上到下排列)。
[0036]
表3引物信息
[0037][0038]
表4 pcr扩增反应体系和条件
[0039][0040]
将pcr产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行纯化测序，得到菌株lx的16srrna序列为seq id no:1：
[0041]
ctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataatgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggcggtgaggttaataacctcatcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaat
cggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacacc
[0042]
登录ncbi网站，使用blast工具对菌株lx的序列进行比对，结果表明菌株lx为proteobacteria门；gammaproteobacteria纲；enterobacterales目；enterobacteriaceae科；klebsiella属；klebsiella pneumoniae种。将测序结果与ncbi中已有菌株的16s rrna基因序列进行同源性比较分析，运用软件mega 11构建系统发育树，菌株lx的系统发育树如图3所示。该菌株的16s rrna序列与klebsiella pneumoniae同源性高达100％，因此菌株被鉴定为克雷伯氏菌，名称为klebsiella pneumoniae lx。
[0043]
(3)菌株lx的形态特征
[0044]
菌株lx在含有50mg/l环丙沙星的msm平板培养基的形态如图2(a)所示，菌落呈现出规则的圆形，白色，菌落小而湿润，易挑取。菌株lx在液体nm培养基培养至对数生长期，使用滴管取一滴菌液于经无水乙醇清洗的载玻片上，盖上盖玻片观察菌株lx在光学显微镜下的形态如图2(b)所示，光学显微镜倍数为10(目镜)
×
40(物镜)，由图可知，菌株lx呈短杆状，正处于对数期。
[0045]
3.菌株生长曲线的测定
[0046]
采用紫外分光光度法测定菌株lx的生长曲线，将菌株lx接种到已经过灭菌处理的液体nm培养基，该液体培养基加入50mg/l环丙沙星，在培养的过程中取不同的时间点进行菌液od600的测定，以确定菌株lx的生长情况。如图4所示，菌株lx在0～10h生长速度较为缓慢，处于迟缓期；菌株lx在10～18h生长速度迅速，菌液od600值呈指数增长趋势，处于对数期；18h后，菌株lx进入稳定期，菌群基本呈饱和状态，生长速度趋于平稳。
[0047]
实施例2克雷伯氏菌lx在好氧条件下对环丙沙星(cip)的降解试验
[0048]
对实施例1分离纯化的克雷伯氏菌lx进行好氧条件下环丙沙星降解的批次实验，实验设置三组平行，实验所用营养液为经灭菌处理的100ml msm液体培养基，初始环丙沙星浓度为50mg/l，体系置于150ml锥形瓶中，恒温摇床转速为180rpm，降解时间为3天，将在液体nm培养基中培养至对数生长期的菌株lx经5000rpm离心后使用0.01m pbs溶液清洗三次后接种至反应体系，检测不同的实验操作条件下，菌株lx对环丙沙星的降解率。选取初始接菌量(od600)(0.6～0.8)、ph(6～8)和温度(20～40℃)作为环境因素，环丙沙星降解率为因变量进行响应面的设计。其中，ph不仅影响细胞表面电荷，还影响细胞膜渗透性，以及与代谢过程相关的载体蛋白质的活性。由于温度对细菌生长和酶活性的影响，因此也是一个影
响环丙沙星生物降解重要的环境参数。响应面实验基于box-behnken(bbd)设计以优化菌株lx降解环丙沙星的操作条件，响应面矩阵设计及结果如表5所示。
[0049]
表5响应面设计及结果
[0050][0051][0052]
利用design expert 10.0软件对表5进行二次多元回归拟合，得到菌株lx的环丙沙星降解率对初始ph值、温度和初始接菌量od600的二次多项回归方程：
[0053]
y＝75.30-11.76a-0.75b+4.04c+9.70ab-0.50ac+0.35bc-9.39a
2-35.25b
2-13.85c2[0054]
其中a为溶液初始ph，b为操作温度，c为初始接菌量od600。由响应面结果可知菌株lx降解cip最佳条件为ph＝6.3，温度＝29℃，od600＝0.72。
[0055]
实施例3克雷伯氏菌lx对不同浓度的环丙沙星的降解影响
[0056]
在实施例2得出的菌株lx降解环丙沙星的最佳反应条件下，进行菌株lx对于不同初始环丙沙星浓度的降解批次实验，实验结果如图5所示，由图可知，当初始环丙沙星浓度为10mg/l，20mg/l，30mg/l和50mg/l的情况下，菌株lx能在4天内快速降解环丙沙星，其降解率分别达到了78.83％，91.08％，83.37％，和89.50％，当降解时间延长至10天，其降解率分别达到了88.72％，97.33％，97.56％和98.64％，可见在环丙沙星小于50mg/l时，菌株lx对于环丙沙星的降解速率随着环丙沙星浓度的升高而升高。当环丙沙星初始浓度为70mg/l，80mg/l，110mg/l，150mg/l，180mg/l和200mg/l，降解周期为10天，菌株lx对于环丙沙星的降
解率分别达到了94.97％，85.11％，68.03％，45.04％，33.07％和32.59％，可见随着初始环丙沙星浓度的增加，其降解率有所下降，说明由于环丙沙星的毒性作用，高浓度环丙沙星可能对菌株lx的生物活性产生了抑制作用。但也同时说明，菌株lx对于环丙沙星的处理上限较高，在环丙沙星浓度高达200mg/l时，菌株lx仍具有降解环丙沙星的能力。
[0057]
实施例4克雷伯氏菌lx对不同种类氟喹诺酮类抗生素的降解效果
[0058]
在实施例2得出的菌株lx降解环丙沙星的最佳反应条件下，探究菌株lx对于不同种类氟喹诺酮类抗生素的降解效果，设置环丙沙星、诺氟沙星(norfloxacin，nor)和恩诺沙星(enrofloxacin，enr)的初始浓度均为50mg/l，实验结果如图6所示。由图可知，除环丙沙星，菌株lx也可以用于诺氟沙星和恩诺沙星的降解，其降解率在7天内分别达到了59.17％和37.38％，可见菌株lx有望应用在氟喹诺酮复合污染的环境修复工程中。
[0059]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一株具有降解氟喹诺酮类抗生素功能的克雷伯氏菌lx，其特征在于，所述菌株为克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)lx，已于2023年2月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2023096。2.权利要求1所述克雷伯氏菌lx在降解废水中氟喹诺酮类抗生素的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，降解条件为：降解温度为20～40℃，ph为7.0～8.0，初始接菌量为od600＝0.6～0.8。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述降解温度为29℃，ph为6.3，初始接菌量为od600＝0.72。5.根据权利要求2或3或4所述的应用，其特征在于，所述氟喹诺酮类抗生素为环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星中的一种或多种。6.一种降解氟喹诺酮类抗生素的制剂，其特征在于，所述制剂中包含权利要求1所述的克雷伯氏菌lx。7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述氟喹诺酮类抗生素为环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星中的一种或多种。

技术总结
本发明涉及一株具有降解氟喹诺酮类抗生素功能的克雷伯氏菌LX及其应用，所述菌株为克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)LX，已于2023年2月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2023096。所述克雷伯氏菌LX为革兰氏阴性菌，在平板培养基上呈现白色菌落，表面光滑且湿润。所述克雷伯氏菌LX可用于降解废水中氟喹诺酮类抗生素，该菌株能在单一碳源基质环境下对50mg/L环丙沙星进行有效地降解，降解效率可达95％以上，从而达到环境修复的目的。复的目的。复的目的。


技术研发人员：彭星星 张雅琦 贾晓珊 何宇哲
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.02.24
技术公布日：2023/7/20