一种靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体及其制备方法与流程

1.本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体及其制备方法。


背景技术：

2.布奎那(brequinar)是一种二氢乳酸脱氢酶抑制剂，具有抗病毒、免疫抑制、抗炎、抗肿瘤等多种潜在药理作用。目前布奎那的抗肿瘤作用已得到广泛的研究，如治疗晚期黑色素瘤、头颈部鳞癌、结直肠癌、胃癌和胰腺癌等。但其未表现出足够抗肿瘤活性，而且引起了骨髓抑制、恶性呕吐等不良反应，限制了布奎那的临床应用。
3.线粒体是铁消耗和能量代谢的中心，与肿瘤转移和治疗抵抗有关。线粒体中还存在肿瘤相关的铁死亡防御物质，包括还原性谷胱甘肽和二氢乳清酸脱氢酶，它们维持线粒体中氧化还原平衡并保护细胞免受脂质过氧化。以肿瘤细胞线粒体作为铁死亡诱导剂的作用靶点，可以促使线粒体发生铁死亡。线粒体脂质过氧化为线粒体dna的释放创造了条件，进而激活先天性免疫，是癌症治疗的一种有效手段。然而，现在仍缺乏诱导线粒体铁死亡的有效策略。
4.因此，需开发一种靶向线粒体脂质体的制剂，来提高布奎那抗肿瘤的疗效，并降低其毒副作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体及其制备方法，提高布奎那抗肿瘤的疗效，并降低其毒副作用。
6.为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
7.一种靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备方法，采用的原料包括卵磷脂、胆固醇、dspe-mpeg2000、十六烷基三苯基溴化膦和布奎那，质量比范围为80-120∶5-15∶5∶2∶2；制备步骤如下：
8.(1)原料溶解：
9.取溶剂溶解卵磷脂、dspe-mpeg2000、胆固醇和十六烷基三苯基溴化膦，配制成混合溶液；另取溶剂溶解布奎那，配制成布奎那溶液；
10.(2)旋转蒸发：
11.将步骤(1)制备的混合溶液与布奎那溶液混合并混匀，在一定温度下旋转蒸发除去有机溶剂，在旋转蒸发器壁上形成薄膜；
12.(3)真空干燥：
13.取出薄膜，将薄膜放入真空干燥器内干燥，去除残余的有机溶剂；
14.(4)水化：
15.将真空干燥后的薄膜放入pbs缓冲液中进行水合，并用探头超声分散，采用滤器挤出过膜，即得具有靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体制剂。
16.为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
17.进一步地，步骤(1)中，溶解采用的有机溶剂均为无水乙醇；混合溶液中，卵磷脂溶液的浓度为80-120mg/ml；布奎那溶液的浓度为0.4-0.5mg/ml。
18.进一步地，步骤(2)中，旋转蒸发采用的温度为36℃-38℃。
19.进一步地，步骤(3)中，在真空干燥器内干燥的时间为3-5h，温度为室温。
20.进一步地，步骤(4)中，pbs缓冲溶液的ph为7.4，pbs缓冲溶液的与真空干燥后的薄膜的质量比例为25∶94-144。
21.作为优选的方案，步骤(4)中，探头超声功率为150-250w，超声时间为15-30min。
22.作为优选的方案，步骤(4)中，采用的滤器为0.45μm滤膜的滤器。
23.作为优选的方案，十六烷基三苯基溴化膦与卵磷脂的质量比为1:40。
24.本发明还保护所述的方法制备的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
26.本发明的布奎那脂质体主要由卵磷脂、胆固醇、dspe-mpeg2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)、布奎那及十六烷基三苯基溴化膦组成，配伍科学，该布奎那脂质体制剂所带正电荷能选择性将药物蓄积在线粒体，并通过抑制或消耗线粒体内还原性物质引起线粒体铁死亡，是线粒体靶向性制剂上的创新，开拓了肿瘤治疗的新途径。
27.本发明的布奎那脂质体含有dspe-mpeg2000，在肿瘤组织部位具有良好的渗透和滞留效应，能够被动的蓄积在肿瘤组织内，减少在其他组织和器官中的分布，从而降低了布奎那的毒性；其中，两亲性阳离子十六烷基三苯基溴化膦修饰在布奎那脂质体上，使其具备了线粒体靶向的能力，可通过产生活性氧消耗线粒体内还原性谷胱甘肽，联合布奎那抑制二氢乳酸脱氢酶诱导肿瘤细胞线粒体铁死亡，以此提高布奎那的治疗效果。
28.本发明的布奎那脂质体制剂还具有制备方法简单易行、载药量较高和稳定性好的特点。
附图说明
29.图1为对比例1制备的bqr@lipo和实施例1制备的bqr@mlipo的体外稳定性曲线图，图中为在各时间点下bqr@mlipo与pbs缓冲液或血浆孵育后粒径的大小。
30.图2为bqr、对比例1制备的bqr@lipo和实施例1制备的bqr@mlipo的体外药物释放曲线图。
31.图3为bqr、对比例1制备的bqr@lipo和实施例1制备的bqr@mlipo的血药浓度-时间曲线图。
32.图4为负载香豆素6的布奎那脂质体c6/bqr@lipo和c6/bqr@mlipo与mb49细胞共孵后，细胞摄取分析图(比例尺＝15μm)；从左至右四组分别为：活细胞的细胞核染色图；负载香豆素的纳米制剂(c6/bqr@lipo和c6/bqr@mlipo)的细胞摄取图；线粒体染色图；三幅图的融合图像。
33.图5为bqr、对比例1制备的bqr@lipo和实施例1制备的bqr@mlipo与mb49细胞共孵24h后细胞活力图。
34.图6为对比例1制备的bqr@lipo和实施例1制备的bqr@mlipo与mb49细胞共孵后，mitosox red(线粒体超氧化物指示剂)染色分析(比例尺＝40μm)。
35.图7为对比例1制备的bqr@lipo和实施例1制备的bqr@mlipo与mb49细胞共孵后，mitopedpp(线粒体脂质过氧化物检测试剂)染色分析(比例尺＝15μm)。
36.图8为对比例1制备的bqr@lipo和实施例1制备的bqr@mlipo对膀胱原位癌体内的药效学和安全性评估中小鼠膀胱肿瘤质量图。
37.图9为对比例1制备的bqr@lipo和实施例1制备的bqr@mlipo对膀胱原位癌体内的药效学和安全性评估中治疗期间小鼠体重变化曲线图。
具体实施方式
38.以下通过实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
39.下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
40.实施例1一种靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备：
41.原料溶解：
42.取1ml无水乙醇溶解0.08g卵磷脂、0.005g dspe-mpeg2000、0.01g胆固醇和0.002g十六烷基三苯基溴化膦，取4ml无水乙醇溶解0.002g布奎那；
43.旋转蒸发：
44.将溶解得到的溶液混合在一起，混匀，37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得到在旋转蒸发器壁形成的薄膜；
45.真空干燥：
46.取出薄膜，将薄膜放入真空干燥器内干燥4h，进一步除去有机溶剂；
47.水化：
48.将干燥后的薄膜用5ml pbs缓冲溶液(10mm，ph＝7.4)水合，再用探头超声(200w)20min，过0.45μm滤器即得具有靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体(bqr@mlipo)。
49.对比例1一种非靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体：
50.原料溶解：
51.取1ml无水乙醇溶解0.08g卵磷脂、0.005g dspe-mpeg2000和0.01g胆固醇，取4ml无水乙醇溶解0.002g布奎那；
52.旋转蒸发：
53.将步骤(1)溶解得到的溶液混合在一起，混匀，得混合液，37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得到在器壁形成的薄膜；
54.真空干燥：
55.将薄膜放入真空干燥器内干燥4h，进一步除去有机溶剂；
56.水化：
57.将干燥后的薄膜用5ml pbs缓冲溶液(10mm，ph＝7.4)水合，再用探头超声(30％功率)20min，过0.45μm滤器即得非靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体(bqr@lipo)。
58.验证部分：
59.以下通过实验对实施例1制备的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体bqr@
mlipo和对比例1制备的非靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体bqr@lipo进行对比验证。
60.(1)大小、形状和表面电荷的确定：
61.采用动态光散射(dls)对冻干前后的bqr@lipo和bqr@mlipo的粒径和表面zeta电位进行测定，见表1所示。
62.(2)包封率的测定：
63.采用葡聚糖凝胶法测定包封率；具体包封率测定如下：在葡聚糖凝胶柱上方加入布奎那脂质体0.5ml，用pbs溶液洗脱，以每份1ml接取，带乳光的样品经乙醇破乳稀释，采用紫外分光光度计测定吸光度；另取载药脂质体0.1ml，加乙醇破乳并稀释至1ml，取破乳脂质体溶液测定吸光度；包封率(％)＝包封进脂质体药物量/加入的药物总量
×
100％；见表1所示。
64.表1：bqr@lipo和bqr@mlipo的理化性质(粒径、zeta电位、包封率)
[0065][0066]
(3)体外稳定性试验：
[0067]
将所制备的bqr@lipo、bqr@mlipo两组制剂与等体积的pbs缓冲液或大鼠血浆混合，于37℃恒温振荡孵育，分别测定两组制剂孵育不同时间后(0、1、2、4、8、12和24h)的粒径变化，研究脂质体的体外稳定性，见图1所示。
[0068]
(4)药物释放研究：
[0069]
分别取0.5ml bqr@lipo、bqr@mlipo、游离布喹那(用pbs缓冲液溶解的布奎那，)加入到透析袋(截留分子量3500da)内，将封端的透析袋浸于装有10ml释放介质(ph为7.4的pbs缓冲液)离心管中，将离心管垂直于恒温振荡培养箱内；于37摄氏度、转速40rpm条件下进行释放实验，在指定时间(1、2、4、8、20、24h)取1ml释放介质，并补充相同体积的释放介质，见图2所示。
[0070]
(5)药代动力学研究：
[0071]
试验方法：取9只sd大鼠，随机分成3组，每组3只，每组分别静脉注射给予布奎那注射液(生理盐水溶解的布奎那)、bqr@lipo、bqr@mlipo，给药剂量为10mg/kg；给药后按不同时间点(0.33、0.5、1、2、4、6、8、24h)从眼眶静脉取血0.5ml，用1.5ml离心管(3.2％的枸橼酸钠生理盐水溶液)，于4000rpm条件离心10min，取血浆，-20℃保存待测。
[0072]
标准曲线绘制：准确称取布奎那药物5mg置于20ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配置成400μg/ml标准溶液，按不同比例在空白血浆中加入已知浓度的布奎那标准溶液，使血浆中药物浓度分别为50、25、12.5、6.25、0.625μg/ml。将上述制备的血浆样品涡旋混匀1min，然后经12000rpm离心10min,吸取上清液20μl进样，采用hplc检测药物浓度。每个样品重复检测3次，取平均值，以药物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制布奎那标准曲线，得回归方程。
[0073]
血浆样品处理：取动物实验所得各大鼠血浆，每份样品精密吸取100μl，置于0.5ml塑料离心管中，分别加入乙腈200μl，涡旋混匀1min，然后经12000rpm离心10min，吸取上清液20μl进样，采用hplc检测药物浓度，见图3所示。
[0074]
(6)细胞摄取
[0075]
制备c6/bqr@lipo和c6/bqr@mlipo：
[0076]
c6/bqr@mlipo制备过程同实施例1，仅原料溶解不同：
[0077]
原料溶解：取1ml无水乙醇溶解0.08g卵磷脂、0.005g dspe-mpeg2000、0.01g胆固醇、0.002mg十六烷基三苯基溴化膦，取4ml无水乙醇溶解0.002g布奎那和0.02g香豆素6；
[0078]
c6/bqr@lipo制备过程同对比例1，仅原料溶解不同：
[0079]
原料溶解：取1ml无水乙醇溶解0.08g卵磷脂、0.005g dspe-mpeg2000、0.01g胆固醇，取4ml无水乙醇溶解0.002g布奎那和0.02g香豆素6；
[0080]
将mb49细胞接种于共聚焦小皿内，细胞密度为2
×
105个/孔,在37℃、5％co2培养箱中进行培养。待细胞贴壁后，加入含香豆素6(c6)的脂质体制剂(c6/bqr@lipo和c6/bqr@mlipo，c6浓度为0.4μg/ml)避光孵育4h。然后加入线粒体指示剂，于37℃孵育30min，加入细胞核染料hoechst染色10min后置于激光共聚焦显微镜下观察，获取图片如图4所示，其中蓝色荧光表示细胞核，绿色荧光表示含c6的脂质体制剂，红色荧光表示线粒体。c6/bqr@mlipo和线粒体共定位后表现出更明显的黄色荧光，研究表明c6/bqr@mlipo可以靶向肿瘤细胞内的线粒体。
[0081]
(7)细胞活力测定
[0082]
将mb49细胞接种于96孔板内，细胞密度为6
×
103个/孔，在37℃、5％co2培养箱中进行培养。待细胞贴壁后，加入药物(bqr、bqr@lipo和bqr@mlipo)。设定给药浓度梯度均为0.6、2.5、5、10μm，同一浓度设3个复孔，加药后继续孵育24h。然后弃掉含药物的培养液，然后每孔添加含10μl的cck-8溶液的新鲜培养液，孵育一定时间后取出，置于450nm波长处检测下吸光度值。空白组为空白培养基，对照组不加任何药物，按照该公式计算细胞存活率，细胞存活率＝(加药组吸光度值-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)
×
100％。各浓度下mb49细胞活性如图5所示。bqr@lipo和bqr@mlipo均显示出良好的抑制作用，同样浓度下bqr@mlipo抑制作用最强。
[0083]
(8)线粒体超氧化物和检测
[0084]
将mb49细胞接种于共聚焦小皿内，细胞密度为2
×
105个/孔，在37℃、5％co2培养箱中进行培养。待细胞贴壁后，加入药物(bqr、bqr@lipo和bqr@mlipo，bqr浓度为5μm)孵育6小时。加入含5μm mitosox工作液的新鲜培养基于37℃避光孵育10min，pbs缓冲液清洗3次，采用激光共聚焦显微镜获取图像。如图6所示，bqr@mlipo组红色荧光最强，表明bqr@mlipo可以有效的引起活性氧在线粒体内的蓄积。
[0085]
(9)线粒体脂质过氧化物检测
[0086]
将mb49细胞接种于共聚焦小皿内，细胞密度为2
×
105个/孔，在37℃、5％co2培养箱中进行培养。待细胞贴壁后，加入药物(bqr、bqr@lipo和bqr@mlipo，bqr浓度为5μm)。孵育6小时后弃掉含药物的培液，加入含0.5μm mitopedpp的新鲜培养基于37℃避光孵育30min，然后加入线粒体指示剂，于37℃孵育30min，采用激光共聚焦显微镜获取图像。如图7所示，绿色荧光表示脂质过氧化物，红色荧光表示线粒体，bqr@mlipo组绿色荧光最强，表明bqr@mlipo可以有效的引起线粒体脂质过氧化。
[0087]
(10)药效学、安全性评价
[0088]
选用8周龄c57bl/6j雌性小鼠40只，适应饲养一周后，将约1
×
106个mb49细胞接种
于小鼠膀胱肌层，建立小鼠膀胱原位肿瘤模型。接种细胞7天后，在可以触摸到小鼠膀胱肿块且见明显肉眼血尿，为模型建立成功。
[0089]
造模成功的小鼠随机分成4组，每组8只。通过尾静脉给药治疗，分别为生理盐水组，bqr组、bqr@lipo组和bqr@mlipo组(bqr剂量均为10mg/kg)。每三天给药一次，连续给药三次后，颈椎脱臼处死小鼠，剥离瘤体，并称量瘤体重量(图8)。治疗期间，每隔一天记录一次体重(图9)。
[0090]
经过多次反复试验证明，本发明的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的有合适的粒径、表面电荷、包封率及较好的体外稳定性，对诱导膀胱癌细胞线粒体铁死亡的作用明显优于布奎那，该脂质体制剂具有很好的抗肿瘤功能，可用于对肿瘤的治疗，并经实验取得了有益的效果。
[0091]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

技术特征：
1.一种靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备方法，其特征在于：采用的原料包括卵磷脂、胆固醇、dspe-mpeg2000、十六烷基三苯基溴化膦和布奎那，质量比范围为80-120∶5-15∶5∶2∶2；制备步骤如下：(1)原料溶解：取溶剂溶解卵磷脂、dspe-mpeg2000、胆固醇和十六烷基三苯基溴化膦，配制成混合溶液；另取溶剂溶解布奎那，配制成布奎那溶液；(2)旋转蒸发：将步骤(1)制备的混合溶液与布奎那溶液混合并混匀，在一定温度下旋转蒸发除去有机溶剂，在旋转蒸发器壁上形成薄膜；(3)真空干燥：取出薄膜，将薄膜放入真空干燥器内干燥，去除残余的有机溶剂；(4)水化：将真空干燥后的薄膜放入pbs缓冲液中进行水合，并用探头超声分散，采用滤器挤出过膜，即得具有靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体制剂。2.根据权利要求1所述的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，溶解采用的有机溶剂均为无水乙醇；混合溶液中，卵磷脂溶液的浓度为80-120mg/ml；布奎那溶液的浓度为0.4-0.5mg/ml。3.根据权利要求1所述的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，旋转蒸发采用的温度为36℃-38℃。4.根据权利要求1所述的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，在真空干燥器内干燥的时间为3-5h，温度为室温。5.根据权利要求1所述的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，pbs缓冲溶液的ph为7.4，pbs缓冲溶液与真空干燥后的薄膜的质量比例为25∶94-144。6.根据权利要求1所述的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，探头超声功率为150-250w，超声时间为15-30min。7.根据权利要求1所述的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，采用的滤器为0.45μm滤膜的滤器。8.根据权利要求1所述的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体的制备方法，其特征在于：十六烷基三苯基溴化膦与卵磷脂的质量比为1:40。9.权利要求1-8任一项所述的方法制备的靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体。

技术总结
本发明涉及一种靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体及其制备方法，采用的原料包括卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、布奎那以及十六烷基三苯基溴化膦；制备步骤如下：(1)原料溶解：取有机溶剂分别溶解各原料；(2)旋转蒸发：将原料溶解得到的溶液混合在一起，混匀，在一定温度下旋转蒸发除去有机溶剂，在旋转蒸发器壁上形成薄膜；(3)真空干燥：取出薄膜，将薄膜放入真空干燥器内干燥，进一步除去残余的有机溶剂；(4)水化：将真空干燥后的薄膜用PBS缓冲液中进行水合，超声分散，采用滤器挤出过膜，即得具有靶向诱导线粒体铁死亡的布奎那脂质体制剂。本发明能提高布奎那抗肿瘤的疗效，并降低其毒副作用。并降低其毒副作用。并降低其毒副作用。


技术研发人员：郭宏骞 张青 丁秋播 苏志桂 李祥龙
受保护的技术使用者：南京鼓楼医院
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/21