一种抗除草剂的基因及其应用

1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体的说，本发明涉及抗除草剂的基因及其编码的蛋白质、构建的载体以及它们的应用。


背景技术：

2.随着植物直播栽培技术在农业生产中的大面积应用，植物直播生产中农田杂草问题成为影响农作物产量的重要因素。特别是稻田禾本科杂草生理、代谢过程与水稻高度相似，缺乏适当的除草剂加以防控。由于传统育种驯化进程不涉及除草剂耐受性状，自然遗传资源中的抗性资源极为罕见。利用除草剂抑制靶标基因，筛选鉴定内源抗性突变体是目前开发主粮作物抗除草剂种质资源的可行途径。例如，通过ems诱变咪唑类除草剂靶基因als，可获得抗性资源。近年来，该突变广泛应用于“金粳818”等品种中，在化学除草方面表现出显著的栽培优势。但是已知主要除草剂靶基因如epsps、accase、als、hppd等的内源抗性位点多为国外商业公司专利保护。同时，随着单一类型除草剂的反复施用，田间杂草获得性抗性快速增加。因此，发掘植物新型除草剂抗性基因并通过转基因手段表达异源代谢基因获得抗除草剂性状，对培育抗除草剂植物十分必要。
3.芳氧苯氧丙酸酯(aryloxyphenoxy propinoate，aopp)类除草剂是德国赫斯特公司在20世纪70年代开发出来的一类高活性除草剂。具有高效、广谱、低毒、低残留等优点，已被广泛应用于农业生产中。目前，商品化的aopp类除草剂约有20余种。截至2014年，全球aopp类除草剂的销售额超过121.7亿美元，是继草甘膦后世界上使用最广泛的除草剂类别之一。aopp类除草剂一般属于内吸型选择型除草剂，主要用于阔叶作物田(如油菜、花生、大豆、番茄等)以防除一年生和多年生的禾本科杂草，施药后2周杂草即可被杀死。然而该类某些除草剂(如精喹禾灵，高效氟吡甲禾灵等)对禾本科作物同样具有灭生性，并且其在生态环境中的残留会危害到后茬作物及非靶标生物。这一定程度上限制了这些除草剂的使用范围和使用时间。因此，培育具有该类除草剂抗性的禾本科农作物具有重要意义，不仅可扩展该类除草剂的使用范围而且可减少农业生产费用。
4.aopp类除草剂的作用机理主要是通过抑制乙酰辅酶a羧化酶(accase)活性使植物死亡。该酶催化atp依赖乙酰辅酶a羧化作用诱导脂肪酸与类黄酮生物合成中的一种关键代谢产物——丙二酸单酰辅酶a，这是植物中脂肪酸生物合成的首要关键步骤，然后在脂肪酸合成酶作用下形成脂肪酸。若丙二酸单酰辅酶a的合成停止，则对accase的抑制将使植物丧失这种中间产物，导致膜结构的破坏，透性增强，细胞破坏。部分禾本科作物(如小麦和水稻)的accase位点突变能降低aopp类除草剂对其的敏感性，植物表达这些突变蛋白可以抗aopp类除草剂。小麦和水稻相关位点突变的accase在植物中表达而获得抗性已被专利保护(中国专利：112410308a，109355264b)。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗除草剂基因和以此为基础的转基因抗除草剂植物。
5.谷胱甘肽-s-转移酶(gsts)能催化三肽谷胱甘肽与若干亲电、亲脂化合物偶联，形
成水溶性产物。该酶存在于从哺乳动物到昆虫和植物的广泛物种中，并且在许多有毒物质(包括致癌物、农药和除草剂)的解毒中发挥着重要作用，这引起了农药研究者们的广泛关注。在植物中，gsts主要分为phi,zeta,tau,theta,lambda和dhar六个类。虽然研究者从水稻、玉米、小麦和其他植物物种已经鉴定出具有抗除草剂能力的gst基因。但能催化精喹禾灵与谷胱甘肽偶联并导致抗性的gst的基因尚未被发现。
6.本发明首先发现了对除草剂代谢作用增强的棒头草品种，然后利用其转录组序列的信息克隆了一个gsts基因gst1，并且进一步在水稻愈伤组织中证明了gst1基因的抗除草剂能力及其在发展转基因抗除草剂农作物中的用途。而本发明涉及一种谷胱甘肽-s-转移酶基因gst1，其转基因至少能使水稻对精喹禾灵和高效氟吡甲禾灵等aopp类除草剂中一种产生抗性。


技术实现要素：

7.本发明的首要目的是提供一种抗除草剂基因。将该抗除草剂基因导入对精喹禾灵敏感的植物，可以使这些敏感植物对于除草剂的耐受性显著增加，从而原本不能用在这些植物上来控制杂草用的除草剂，可用于导入这种抗除草剂基因的植物。
8.为了解决上述技术问题，
9.本发明提供了一种抗除草剂基因，该基因的核苷酸序列为以下任意一种：seq id no:1、seq id no:2，以及功能相同的同源性基因序列。
10.所述的除草剂为芳氧苯氧丙酸酯类，进一步包含精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精噁唑禾草灵、禾草灵、炔草酯、恶唑酰草胺、氰氟草酯中的至少一种。
11.本发明第二个方面的目的是提供所述的抗除草剂基因编码的蛋白质多肽，氨基酸序列包括：seq id no:3、seq id no:4。
12.本发明第三个方面的目的是提供一种表达抗除草剂基因的质粒，包含所述的核苷酸序列。
13.该质粒，包含核苷酸序列分子与控制表达的核苷酸序列连接而成的表达框，该核苷酸序列编码上述蛋白质多肽。
14.作为本发明的一种优选方式，谷胱甘肽-s-转移酶基因gst1基因片段与双酶切好的pet-28a(+)进行in fusion(takara，公司)试剂盒连接获得含谷胱甘肽-s-转移酶基因的pet-28a(+)重组质粒。
15.本发明第四个方面的目的是提供一种表达抗除草剂基因的重组菌株，将所述的质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)获得重组菌株e.coli bl21(de3)。
16.作为本发明的一种优选方式，构建好的含谷胱甘肽-s-转移酶基因的pet-28a(+)重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)获得重组菌株e.coli bl21(de3)。
17.本发明第五个方面的目的是提供所述的抗除草剂基因的应用，将所述的基因转入植物中，获得抗性植株。
18.进一步地，构建表达抗除草剂基因的质粒，转入植物愈伤组织中，获得抗除草剂植物愈伤组织，然后分化出抗性植株。
19.进一步地，所述植物，包括双子叶和单子叶植物。
20.更进一步地，所述植物包括禾本科作物。
21.更进一步地，所述植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。
22.本发明第六个方面的目的是提供一种体外重组表达蛋白快速检测其对除草剂解毒代谢作用的体系，包括步骤如下：
23.(1)将seq id no:1和seq id no:2所示序列重组在蛋白表达载体；
24.(2)将步骤(1)的重组表达载体转入宿主细胞；
25.(3)诱导宿主细胞表达大量目的蛋白；
26.(4)纯化目的蛋白检测其对除草剂的代谢作用。
27.本发明第七个方面的目的是提供一种体外重组表达谷胱甘肽-s-转移酶快速检测其抗氧化酶活性的体系，包括步骤如下：
28.(1)将seq id no:1和seq id no:2所示序列重组在蛋白表达载体；
29.(2)将步骤(1)的重组表达载体转入宿主细胞；
30.(3)在诱导平板培养基上检测转入谷胱甘肽-s-转移酶的宿主细胞对chp的敏感性；
31.(4)记录抑菌圈大小。
32.本发明第八个方面的目的是提供所述的抗除草剂基因在植物转基因培养中作为筛选标记的应用。
33.作为本发明的抗除草剂基因的改进：1)与seq id no:3、seq id no:4相比具有不小于80％的相同性的氨基酸序列。2)而一种植物导入这个基因以后至少能够提高对下列一种或多种除草剂的抗性：aopp类除草剂，包括但不仅限于精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精噁唑禾草灵、禾草灵、炔草酯、恶唑酰草胺、氰氟草酯等。
34.本发明提供一种gst基因或者这个基因的变异体，在植物中的表达其核苷酸序列编码的蛋白质能够导致转基因植物对至少如下一种或多种除草剂的抗性：包括但不仅限于精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精噁唑禾草灵、禾草灵、炔草酯、恶唑酰草胺、氰氟草酯等。本发明所述的基因也可以和其他的抗除草剂基因，如epsps基因共同导入到植物中，从而获得同时抗包括草甘膦在内的几种除草剂。进一步，本发明的基因也可以和抗虫基因同时导入转基因植物，从而获得同时抗除草剂和抗虫的转基因植物。
35.利用在本发明中提供的抗除草剂的gst基因，其他的同源抗除草剂基因就可以通过已经有的方法获得同源基因。例如，本领域的一般技术人员可以通过southern杂交方法或者pcr方法获得这些同源基因。进一步，本领域的技术人员可以利用现有的技术获得这个基因的变异体，例如，包括但不限于：1)利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码相同活性的蛋白质多肽；2)通过导入核苷酸序列的变异但是仍然编码具有抗除草剂能力的蛋白质的核苷酸序列。这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的点变异，还可以是插入或者缺失变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生上述变异。因此，本发明的gst基因也包括一种基因，其编码的蛋白质和seq id no:3或seq id no:4相比具有至少80％的相同性并且能够抗除草剂的基因，这些基因的抗除草剂性能可以通过转基因植物的抗除草剂能力获得验证。导入这些基因的转基因植物能够抗至少1种如下的除草剂：包括但不仅限于精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精噁唑禾草灵、禾草灵、炔草酯、恶唑酰草胺、氰氟草酯等。
36.本发明还提供了一种对植物进行改造的方法：包括利用植物基因转化技术将上述
抗除草剂基因和启动子和终止子功能性地连接而构成表达框，能够在植物细胞中表达。所获得的植株具有抗除草剂能力。构建一种在植物中能够表达的表达框已经是常用的技术。植物可以是水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。
37.本发明还提供了一种体外重组表达蛋白快速检测其对除草剂解毒代谢作用的体系，将上述核苷酸序列seq id no:1和seq id no:2通过in fusion(takara，公司)试剂盒与经ecori和hindiii双酶切后的线性化的pet-28a载体同源重组。将得到的重组质粒转化到高效表达菌株大肠杆菌bl21(de3)(擎科，公司)中。重组表达的菌株bl21(de3)经过终浓度为1mm的iptg在28℃下诱导12h后，大量表达携带his
6-tag的gst1蛋白，进一步通过his标签蛋白纯化试剂盒(coolaber，公司)进行亲和层析获得纯的gst1蛋白。并确定了gst1蛋白的最佳洗脱条件。利用纯化的gst1蛋白进行酶学降解试验，发现cdnb、nbd-ci可作为gst1酶的底物，其中高浓度下nbd-ci能抑制gst1酶对cdnb的活性，此外精喹禾灵主要代谢产物喹禾灵酸能与cdnb竞争gst1酶与谷胱甘肽的偶联活性，这些特性将为用于转基因作物的培育提供可能。该体系对于快速鉴定外源基因对除草剂的代谢作用提供了基础。
38.本发明还提供了一种体外重组表达谷胱甘肽-s-转移酶快速检测其抗氧化酶活性的体系。将谷胱甘肽-s-转移酶序列通过in fusion(takara，公司)试剂盒与经ecori和hindiii双酶切后的线性化的pet-28a载体同源重组。将得到的重组质粒转化到高效表达菌株大肠杆菌bl21(de3)(擎科，公司)中。将0.2ml转化的大肠杆菌e.coli bl21(de3)(pet-gst)在lb液体培养基中培养至od600＝1，均匀涂布在含有卡那霉素(50mg l-1
)和iptg(1mmol l-1
)的lb固体培养基平板上，将平板转移到37℃的培养箱中培养1h。然后将灭菌滤片(直径5mm)分别在0、40、80、160和320mm的chp(chp干粉用丙酮溶解)中浸泡。将浸泡过的灭菌滤片置于预培养的大肠杆菌e.coli bl21(de3)(pet-gst)和pet-28a空载的lb平板表面。在37
°
c下培养48h后，记录chp抑制圈大小，判断目的蛋白的抗氧化活性。
39.本发明还提供了利用上述抗除草剂基因的核苷酸序列分子，在植物转基因细胞培养中作为筛选标记。上述能够在植物细胞中表达的抗除草剂人工基因可以与目的基因表达框构建在同一个植物转化质粒的同一个dna转化片段上。目的基因可以是任何有价值的基因。这个植物转化质粒可以通过基因枪、农杆菌方法或则其他方法导入植物组织，而含有合适浓度的除草剂(如精喹禾灵)培养基则可以选择性地杀死没有导入dna转化片段的植物细胞，从而选择了含有目的基因的植物细胞。
40.综上所述，本发明的基因可以用来在植物中表达而使植物获得至少对1种除草剂的抗性能力，从而可以利用除草剂选择性地杀灭杂草，本发明也可以运用在作物的育种、植物细胞培养的筛选。本发明还提供了一种快速检测外源基因对除草剂代谢作用的体系。
41.已知主要除草剂靶基因如epsps、accase、als、hppd等的内源抗性位点多为国外商业公司专利保护。更严峻的事实是，这些跨国公司一直通过对基因序列进行小范围改动和修饰的手段对其核心专利进行延长保护，使其变为“新”专利，从而有效规避所谓的20年专利有效期，试图达到独占这些功能基因和转化技术的目的。我国近年也获得部分accase基因专利授权(中国专利：109371000b、109082416a)，但是我们多数专利都是建立在国外核心专利的基础之上，如果想要使转基因产业化，国外掌握的“专利使用权”是一道绕不过去的坎。
42.本发明阐明了杂草对除草剂的抗性机理，发掘新的具有完全自主知识产权的除草
剂抗性基因资源谷胱甘肽-s-转移酶基因gst1，基于新功能基因培育了具有完全自主知识产权的抗除草剂作物种质材料，为我国抗除草剂转基因作物新品种的培育不受制于人提供了保障。
附图说明
43.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
44.图1是抗性(r)和敏感(s)棒头草种群在精喹禾灵相同剂量下的生长状态；
45.图2是植物表达载体的构建示意图，表达框(a)由启动子、棒头草抗除草剂基因gst1和终止子组成；
46.图3是转棒头草抗除草剂基因gst1水稻愈伤组织对精喹禾灵的耐受性检测结果；
47.图4是转棒头草抗除草剂基因gst1水稻愈伤组织对高效氟吡甲禾灵的耐受性检测结果；
48.图5是gst1蛋白重组表达载体在大肠杆菌bl21(de3)中表达的构建示意图；
49.图6是sds-page检测目的蛋白电泳图；
50.图7是gst1蛋白对底物cdnb和nbd-ci酶动力学分析以及喹禾灵酸对gst1蛋白的抑制中浓度(lc
50
)；
51.图8是圆盘抑菌圈法—pet-gst1在大肠杆菌e.coli bl21(de3)中诱导表达使其影响对chp的敏感性。
具体实施方式
52.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的或无特殊说明的实验方法，均为本领域技术人员熟知的常规条件和常规方法。
53.实施例1抗精喹禾灵棒头草的抗性测定：
54.棒头草杂草(polypogonfugax)隶属禾本科，为一年生杂草，是我国冬油菜和冬小麦田中危害最严重的主要杂草之一。为了明确棒头草对精喹禾灵的抗药性水平，采用整株测定法研究了采集的棒头草生物型对精喹禾灵的敏感性水平。结果表明发现采集的抗性棒头草生物型r能够在精喹禾灵田间推荐剂量下正常生长，其鲜重抑制中剂量(gd
50
)值为57g a.i./ha；而对照的敏感棒头草生物型s的gd
50
值为9.6g a.i./ha，相对抗性倍数达6倍(图1)。此外还检测了r种群对其它accase抑制剂类除草剂的抗性，发现r种群对高效氟吡甲禾灵也具有抗性，抗性倍数达到6.08倍。因此，抗性棒头草生物型可能包含有抗精喹禾灵和高效氟吡甲禾灵的基因。
55.实施例2抗性基因的克隆：
56.自然界中，一种植物抗精喹禾灵的确凿证据是拥有抗精喹禾灵靶标酶accase基因，即靶标酶accase相关位点突变降低了精喹禾灵对其敏感性从而获得抗性。对抗性棒头草种群进行靶标酶抗性机理的研究，从抗性和敏感种群中各挑取9株进行精喹禾灵靶标酶基因乙酰辅酶a羧化酶(accase)片段的克隆，将克隆到的基因序列进行了比对，结果发现与s种群相比，r种群未有靶标酶突变，说明该种群无靶标酶抗性机理。
57.通过转录组测序技术，获得了2个棒头草种群(r，s)的转录组数据。统计评估测序的质量值时，发现其碱基q30都在90％以上，表明测序质量非常可靠成功测序结果。对组装后的基因表达量进行进一步分析，发现在r和s之间差异表达的基因共有102个，这其中与非靶标抗性相关的基因共1个。使用转录组测序的rna样本对发现的这1个非靶标抗性相关差异基因进行荧光定量pcr验证，结果发现：与敏感种群s相比，抗性种群中r中谷胱甘肽-s-转移酶基因(gst1)始终高表达。以提取的棒头草总rna为模板，使用hiscript ii cdna第一链的合成试剂盒(vazyme，公司)反转成cdna。根据转录组预测的gst1基因的cds序列，设计了两条特异引物(f:atggcgccggtgaaggtgtt，r:tcaagctttgggcggaaccatgctg)，见seq id no.5-6；使用高保真2
×
primestar max premix(takara，公司)进行全长扩增，扩增条件如下：
58.条件：
[0059][0060]
将目标pcr产物纯化回收并克隆、测序，最终成功获得棒头草gst1基因的两个变异型(seq id no:1和seq id no:2)，核苷酸序列的相同性达到89.88％，氨基酸(seq id no:3和seq id no:4)的相同性达到86.76％。
[0061]
实施例3gst1基因过表达载体的构建和转基因抗除草剂水稻的获得
[0062]
1)构建gst1基因过表达载体。
[0063]
设计特异性引物(f:tgttacttctgcaggatggcgccggtgaaggtgt，r:cggatccataacgcgtcaagctttgggcggaacca见seq id no.7-8；)将目标基因的全长序列从t克隆测序载体上扩增出来，并结合表达载体pox(购买自武汉伯远生物科技有限公司)的多克隆酶切位点，与线性化的表达载体pox混匀后通过in fusion(takara，公司)试剂盒连接反应，连接反应结束后转化大肠杆菌感受态细胞，对能扩增出预期目标片段的质粒进行序列测定，最终得到重组表达载体(图2)并通过电击法转入农杆菌感受态eha105(coolaber，公司)中。
[0064]
2)抗性愈伤组织的筛选及其对除草剂的敏感性测定。
[0065]
以水稻种子为材料，去除颖壳后经75％乙醇消毒后，置于n6d的培养基上28℃暗培养，3周后选取致密的愈伤组织颗粒用于转化。利用农杆菌菌株将重组质粒转入其感受态细胞中，得到带有表达载体pox-gst1阳性农杆菌(擎科，公司)，并培养新鲜农杆菌菌液。水稻愈伤组织浸入此菌液中，并转入选择培养基筛选抗性愈伤组织。
[0066]
转基因愈伤组织对除草剂抗性的测定。将共培养后的愈伤组织放在含有hygromycin的筛选培养基上，暗培养14天，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织进行除草剂耐受性实验。以带有pox-gfp过表达的转基因水稻愈伤组织为对照，观察pox-gst1过表达的转基
因水稻愈伤组织对2种aopp类除草剂(精喹禾灵和高效氟吡甲禾灵)的抗性。结果发现：1)与gfp相比，gst1过表达水稻愈伤组织在精喹禾灵10、20、40nm浓度下生长状态更好。然而gst1-2变异型生长状态优于gst1-1，表明gst1-2变异型能赋予水稻对精喹禾灵更高的抗性水平(图3)。2)与gfp相比，gst1-2变异型过表达水稻愈伤组织在高效氟吡甲禾灵50、100、200nm浓度下生长状态更好。然而gst1-1变异型无明显差异(图4)。表明gst1-2变异型能赋予水稻对高效氟吡甲禾灵的抗性，而gst1-1变异型不能。
[0067]
实施例4gst1基因体外高效表达与纯化
[0068]
1)gst1基因重组表达载体的构建。设计包含pet-28a同源臂的特异性引物(f:tgggtcgcggatccgaaatggcgccggtgaaggtgt，r:gtgcggccgcaagcttgtcaagctttgggcggaacca见seq id no.9-10；)将目标片段从t克隆载体上扩增后纯化回收，将表达载体pet28a(翌圣生物，公司)经ecori和hindiii酶切胶回收。通过in fusion(takara，公司)试剂盒连接反应，回收后的目标片段和线性化pet28a两者的量为1:1，建议各50ng-100ng。
[0069]
连接反应体系：
[0070][0071]
连接反应结束后转化大肠杆菌感受态细胞，对能扩增出预期目标片段的质粒进行序列测定，最终得到重组表达载体(图5)通过热激法转入大肠杆菌bl21(de3)菌株中。涂布于含有50mg l-1
卡那霉素的平板，获得重组转化子e.coli bl21(de3)(pet-gst1)。
[0072]
2)gst1蛋白的表达与纯化
[0073]
将重组菌株e.coli bl21(de3)(pet-gst1)在lb培养基中培养至od
600
＝0.4-1，向培养基中加入终浓度为1mm的iptg，28℃诱导12h后，离心收集菌体。获得的菌体用预冷的pbs(50mm，ph＝8.0)洗涤并重悬，然后超声波破碎，离心取上清。由于构建的重组菌株e.coli bl21(de3)(pet-gst1)经过iptg诱导表达的gst1蛋白n端带有6个组氨酸残基组成的标签，重组蛋白可以通过his标签蛋白纯化试剂盒(coolaber，公司)进行洗脱纯化，详细纯化步骤及所需溶液见试剂盒内附说明书。最后进行sds-page电泳检测目的蛋白纯度，最终获得gst1的纯酶(图6)，同时确定了最佳的洗脱条件为洗脱液(20mm tris-hci，200mm咪唑，500mm naci)。蛋白浓度的测定采用bradford方法，牛血清白蛋白作为标准蛋白质。
[0074]
实施例5gst1蛋白酶学分析
[0075]
酶学分析是通过测定gst1蛋白催化谷胱甘肽(gsh)与1-氯-2,4-二硝基苯(cdnb)、4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(nbd-ci)底物反应的酶动力学实验。测试gst1蛋白对gsts酶已知底物(cdnb和nbd-ci)的酶动力。
[0076]
1)与底物cdnb的酶促反应体系(200μl)：
[0077]
gsh(终浓度1mm)50μl
[0078]
cdnb(终浓度0.25-3mm)100μl
[0079]
纯化gst1重组蛋白(1mg/ml)50ul
[0080]
加入重组蛋白后，反应开始，在30℃下进行，在96孔板内通过酶标仪(tecaninfinitem200pro,austria)测定波长340nm下的吸光值，每隔1min检测一次，共检测3min。结果显示(图7)，gst1-1和gst1-2两种变异型对底物cdnb的v
max
分别是15.93mm和3.41mm。km分别是0.45mm和1.56mm。表明gst1蛋白对底物cdnb具有较好的耦合亲和力，但gst1-1蛋白对cdnb的耦合亲和力显著高于gst1-2蛋白。
[0081]
2)与底物nbd-ci的酶促反应体系(200μl):
[0082]
gsh(终浓度1mm)50μl
[0083]
nbd-ci(终浓度0.025-0.25mm)100μl
[0084]
纯化gst1重组蛋白(1mg/ml)50ul
[0085]
加入重组蛋白后，反应开始，在30℃下进行，在96孔板内测定波长419nm下的吸光值，每隔1min检测一次，共检测3min。结果显示(图7)，gst1-1和gst1-2两种变异型对底物nbd-ci的v
max
分别是15.79mm和3.12mm。km分别是0.31mm和0.26mm。表明gst1蛋白对底物nbd-ci具有较好的耦合亲和力，但gst1-1蛋白对cdnb的耦合亲和力显著高于gst1-2蛋白。此外还观察到nbd-ci终浓度大于0.25mm时，会抑制gst1蛋白的酶活性。
[0086]
3)精喹禾灵及其主要代谢产物喹禾灵酸对gst1蛋白酶活性的抑制中浓度(反应体系150μl)
[0087]
gsh(终浓度1mm)50μl
[0088]
精喹禾灵或喹禾灵酸(终浓度3.125-800μm)50μl
[0089]
纯化gst1重组蛋白(1mg/ml)50ul
[0090]
加入重组蛋白后，反应开始，在37℃下反应2小时。加入100ul浓度为2mmcdnb溶液检测gst的酶活。在波长340nm下测定3min内的吸光值变化。结果显示(图7)，精喹禾灵(3.125-800μm)没有改变gst1蛋白对底物cdnb的偶联活性，精喹禾灵主要代谢产物喹禾灵酸对gst1-1蛋白的抑制中浓度为656.15μm，而对gst1-2蛋白的抑制中浓度为49.99μm。这表明精喹禾灵主要代谢产物喹禾灵酸能够竞争gst1蛋白对底物cdnb的偶联活性，并且喹禾灵酸更适合作为变异型蛋白gst1-2的底物，精喹禾灵不能作为gst1蛋白的底物。这可能是实施例1中gst1介导棒头草抗精喹禾灵的代谢作用机制。
[0091]
实施例6gst1蛋白的抗氧化活性的测定
[0092]
将0.2ml转化的大肠杆菌e.colibl21(de3)(pet-gst1)在lb液体培养基中培养至od
600
＝1，均匀涂布在含有卡那霉素(50mgl-1
)和iptg(1mmoll-1
)的lb固体培养基平板上，将平板转移到37℃的培养箱中培养1h。然后将灭菌滤片(直径5mm)分别在0、40、80、160和320mm的chp(chp干粉用丙酮溶解)中浸泡。将浸泡过的灭菌滤片置于预培养的大肠杆菌e.colibl21(de3)(pet-gst1)和pet-28a空载的lb平板表面。在37℃下培养48h后，记录chp抑制圈大小，判断目的蛋白的抗氧化活性。结果显示(图8)，pet-gst1-1和pet-gst1-2在大肠杆菌e.colibl21(de3)中诱导表达均能显著提升其对chp的抗性。表明gst1基因具有抗氧化酶活性，这也可能是gst1介导棒头草抗精喹禾灵的原因之一。
[0093]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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seq id no:1
[0095]
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[0101]
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技术特征：
1.一种抗除草剂基因，该基因的核苷酸序列为以下任意一种：seq id no:1、seq id no:2，以及功能相同的同源性基因序列。2.根据权利要求1所述的抗除草剂基因，其特征在于，所述的除草剂为芳氧苯氧丙酸酯类，进一步包含精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精噁唑禾草灵、禾草灵、炔草酯、恶唑酰草胺、氰氟草酯中的至少一种。3.权利要求1或2所述的抗除草剂基因编码的蛋白质多肽，氨基酸序列包括：seq id no:3、seq id no:4。4.一种表达抗除草剂基因的质粒，其特征在于，包含权利要求1所述的核苷酸序列。5.一种表达抗除草剂基因的重组菌株，其特征在于，将权利要求4所述的质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)获得重组菌株e.coli bl21(de3)。6.权利要求1或2所述的抗除草剂基因的应用，其特征在于，将所述的基因转入植物中，获得抗性植株；优选转入植物愈伤组织中，获得抗除草剂植物愈伤组织，然后分化出抗性植株。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物，包括双子叶和单子叶植物，进一步包括：禾本科作物；更进一步，所述植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。8.一种体外重组表达蛋白快速检测其对除草剂解毒代谢作用的体系，其特征在于，包括步骤如下：(1)将seq id no:1和seq id no:2所示序列重组在蛋白表达载体；(2)将步骤(1)的重组表达载体转入宿主细胞；(3)诱导宿主细胞表达大量目的蛋白；(4)纯化目的蛋白检测其对除草剂的代谢作用。9.一种体外重组表达谷胱甘肽-s-转移酶快速检测其抗氧化酶活性的体系，其特征在于，包括步骤如下：(1)将seq id no:1和seq id no:2所示序列重组在蛋白表达载体；(2)将步骤(1)的重组表达载体转入宿主细胞；(3)在诱导平板培养基上检测转入谷胱甘肽-s-转移酶的宿主细胞对chp的敏感性；(4)记录抑菌圈大小。10.权利要求1或2所述的抗除草剂基因在植物转基因培养中作为筛选标记的应用。

技术总结
本发明属于植物基因工程技术领域，本发明公开了一种抗除草剂的基因及其应用。具体的说，本发明涉及抗除草剂的基因及其编码的蛋白质、构建的载体以及它们的应用。该基因可以用来在农作物中表达而使农作物对除草剂的抗性增强。本发明可以运用在抗除草剂转基因作物研制的领域，有很好的应用前景。有很好的应用前景。有很好的应用前景。


技术研发人员：潘浪 陈文 柏连阳 李宗芳 柏丁溢
受保护的技术使用者：湖南农业大学
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/21