一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法

1.本发明涉及生命科学领域中一种适用于评估树鼩空间学习记忆能力的方法，特别是一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法。


背景技术：

2.空间学习记忆是大脑的高级神经生理活动之一，它是一项十分复杂的神经生理活动过程，同时它也是一种可以评价动物及人类认知水平的行为模式，是生物体对外在环境形成内在表征的认知过程。空间记忆分为参考记忆和工作记忆，参考记忆可通过反复训练获得，比如实验动物在迷宫中寻找食物奖励基于参考记忆，实验动物的海马参与了学习、空间记忆、焦虑、应激等过程，执行空间认知和记忆功能。现有研究表明，海马损伤的实验大鼠无法有效的将自己的空间定位与过去经验相结合，破坏了大鼠短期内空间线索的记忆和调用。因此，海马结构功能在很大程度上决定了动物的空间学习记忆能力。
3.树鼩是一种生活在山地森林地带的小型半树栖食虫哺乳动物，他们行动灵活，善于攀援，主要在地上活动、觅食、戏耍和休息。树鼩是灵长类动物的近亲，具有繁殖周期短，饲养成本低等特点，已逐步被应用于感染、癌症、代谢和免疫等相关疾病的研究，在神经认知领域研究中，树鼩具有接近于非人灵长类动物的优势，因此是一种较理想的实验动物。空间定位是树鼩在野外生活的重要本领，它们必须从空间线索和环境中获取记忆信息，以便能够准确定位自己的位置，猎物或敌人的方位，从而制定最佳的进攻或逃避路径。
4.在空间学习记忆实验中，多用食物奖励方法训练实验动物，食物奖励根据实验需求被放置在不同的预定义位置，在学习区分奖励井和非奖励井的空间位置时，可通过设置不同数目、不同位置的奖励井来进行不同任务难度的训练，是一种需要依靠周围环境线索进行奖励定位的任务。综上所述，利用树鼩地面觅食的天然习性，训练其通过寻找食物奖励井来测试空间位置觉和方位觉的学习记忆是评估树鼩空间学习记忆能力的有效方法，但是因树鼩胆小，易受惊，对外界刺激反应大等特点使得树鼩难以建立认知行为学类的范式，因此目前还没有相关的实验研究。


技术实现要素：

5.本发明建立了一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法，目的是评估树鼩空间学习记忆能力，建立树鼩认知行为学类的范式。此外，为了检验执行该迷宫任务依赖动物的空间记忆程度，增加了树鼩海马损毁后相同训练的自身对照实验。树鼩奶酪板迷宫空间学习记忆实验包括实验准备、实验训练及确定成模指标三个步骤。
6.s01:实验准备
7.s011：准备奶酪板迷宫装置
8.奶酪板迷宫是一个圆形竞技场，主板是均匀分布有120个洞的白色聚丙烯材质圆形板，两两洞心之间的距离是相等的，主板分割为4块扇形板，便于拆装和清理。主板下方安装有一底板，所述主板和所述底板组成一块包含120个食物井的盲孔迷宫；
9.所述奶酪板迷宫外围有铁皮圆柱围栏，围栏上贴有不同形状的线索提示物；
10.所述奶酪板迷宫顶上盖有尼龙网，防止树鼩从迷宫中逃逸。
11.s012：对奶酪板迷宫进行实验布置
12.选取奶酪板迷宫边上任意靠壁位置作为迷宫的起始区，放置亚克力板透明三维休息盒，树鼩每次训练始点都是从三维休息盒中出去寻找奖励，在2min内吃完三个食物奖励即为完成了一次训练，然后用食物引诱其回到三维休息盒后，实验者在食物井中放置下一次训练的食物奖励。
13.s013：实验周期内环境设置
14.海马损毁前后的实验，奶酪板迷宫房间环境温度维持在20℃-26℃、湿度40％-70％，迷宫内壁和周围墙上都设置有不同形状及颜色的提示卡，实验周期内迷宫亮度均匀，房间内陈设、光源及其他环境条件在训练周期保持不变，环境保持安静。
15.s02:实验训练
16.s021:实验前准备
17.每天实验前，称量并记录每只树鼩的体重，结合体重变化和训练期间树鼩状态与表现，确定实验周期内的限食饲喂量。
18.s022:海马损毁前训练
19.④
、熟悉环境：在迷宫表面和洞里都遍布食物，当树鼩在迷宫中能够自主觅食井里的食物，足迹均匀分布，且其紧张、焦虑、不专心等情绪引发的行为较少时，即可进入下一阶段的训练。
20.⑤
、食物井位置改变：进行3天训练，每天任意选取三个井放置食物，食物井的位置每天改变，且食物井组成的食物井面积随训练天数依次增大，即3天食物井面积分别为1、4、8单位，完成此阶段后进入正式训练期。
21.⑥
、正式训练：进行6天的训练，每天改变食物井的位置，正式训练期三个食物井面积为11-13单位，对训练期数据进行统计分析。
22.s023：神经毒素秋水仙素损毁树鼩海马
23.③
、选用神经毒素(秋水仙素)局部注射的方法进行海马损毁，左右脑各注射三个点，分别损毁动物的背侧、中间、腹侧海马，损毁坐标由树鼩脑图谱推断。
24.④
、损毁后的树鼩经过3周休养便可进行奶酪板迷宫实验。
25.s024：海马损毁后实验训练
26.③
、熟悉环境：训练方法及标准同海马损毁前步骤s022一致。
27.④
、正式训练：训练天数及次数同海马损毁前步骤s022一样，食物井的位置与损毁前呈y轴镜像对称且与损毁前第一到第六天一一对应，避免损毁前后因奖励井难度设置不同而对实验结果产生影响。
28.s025：实验注意事项
29.①
、每次实验结束后及时清理迷宫内食物和动物残留物，每只动物结束后需彻底清理迷宫及休息盒。
30.②
、每只树鼩当天训练后，对树鼩进行限制性的给予狗粮，具体限粮需满足能够在维持体重不低于实验前体重的80％且不宜下降过快的前提下进行。
31.所述限粮期的实验树鼩体重需平缓下降。
32.s03:确定成模指标
33.③
、采用海马损毁前后树鼩正式训练期间群体的平均路线系数来评估树鼩空间记忆能力，路线系数的计算公式为：
34.路线系数＝经过食物井顺序的直线距离之和
÷
实际经过的行程长度之和，即
35.其中，d1树鼩从休息盒到达第一个奖励井之间的直线距离，d2树鼩从第一个奖励井到下一个奖励井之间的直线距离，d3为树鼩从第二个奖励井到第三个奖励井之间的直线距离；p1为树鼩从休息盒到达第一个奖励井的实际行程长度，p2为树鼩从第一个奖励井到下一个奖励井的实际行程长度，p3为树鼩从第二个奖励井到第三个奖励井的实际行程长度；路线系数越大，树鼩规划的觅食路线越优。
36.④
、评价指标选择每天20次训练中路线系数最大的五次进行分析，代表树鼩在当天的训练中所能达到的最好水平。
37.其中，所述步骤s012中实验者在食物井中放置食物的过程用毛巾遮盖三维休息盒防止树鼩看到实验者放置食物。
38.其中，所述步骤s012中在奶酪板迷宫装置正上方固定一个摄像头连接着计算机，用于记录树鼩的行为。
39.其中，所述步骤s022熟悉环境的实验过程中可以人为诱导树鼩充分探索迷宫，直至树鼩能够自主觅食，足迹均匀遍布迷宫即可进入下一阶段的训练。
40.其中，所述步骤s022中食物井面积的计算公式：(a
×
h)
×
1/2；紧挨着的三个食物井组成的三角形食物井面积为0.5单位。
41.本发明提供的一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法，该方法是利用树鼩善于在陆地搜索隐藏食物的天性来进行实验的，主要实验方法是在正常的照明条件下进行的，设有熟悉环境的适应阶段，没有厌恶刺激，不需要使用高强光源、水刺激、大噪音或风等刺激手段来完成该项任务。因此，奶酪板迷宫树鼩实验是一种对实验动物尤其树鼩压力很小的空间记忆评估方法，是一种有效且创新的方法。
42.本发明提供的奶酪板迷宫树鼩实验方法包括实验装置的设备，针对环境温度、湿度、房间内置、迷宫环境等各参数优化设置，实验操作步骤中针对树鼩的训练，在训练步骤、次数、时间、频率以及奖励设置等方面均经过多次实验反复论证得到，成功建立评估树鼩空间记忆的行为学范式，成模标准、成模指标制定合理。同时，奶酪板迷宫空间学习记忆树鼩模型比大小鼠模型具有与人更为类似的优势，因此空间学习记忆树鼩模型的成功建立，为后续的神经科学研究如构建ad模型、活体电生理记录、光记录等提供了一种适用于树鼩的行为学实验方法，也能够为研究者在空间编码、学习记忆、新药开发、筛选、评价等多个学科和领域的研究提供更有力的科学数据。
附图说明
43.图1为奶酪板迷宫图示；
44.图2为奶酪板迷宫三维图示；
45.图3为路线系数计算图示；
46.图4为树鼩海马损毁前后群体平均路线系数最大五次对比图示，d1树鼩从休息盒
到达第一个奖励井之间的直线距离，d2树鼩从第一个奖励井到下一个奖励井之间的直线距离，d3为树鼩从第二个奖励井到第三个奖励井之间的直线距离；p1为树鼩从休息盒到达第一个奖励井的实际行程长度，p2为树鼩从第一个奖励井到下一个奖励井的实际行程长度，p3为树鼩从第二个奖励井到第三个奖励井的实际行程长度；
47.101-主板；102食物井；103-底板；104-食物井面积为0.5单位，a-三个食物井组成的三角形的底边长；h-三个食物井组成的三角形的高。201-三维休息盒；202-铁皮围栏；203-尼龙网；204-底板；
具体实施方式
48.以下将结合具体实施例及附图1-4来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
49.本发明提供一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法，包括以下步骤：
50.s01:实验准备
51.s011：准备奶酪板迷宫装置
52.奶酪板迷宫是一个圆形竞技场，主板101是均匀分布有120个洞的白色聚丙烯材质圆形板，两两洞心之间的距离是相等的，主板101分割为4块扇形板，便于拆装和清理。主板101下方安装有一底板103，主板101和底板103组成一块包含120个食物井的盲孔迷宫；奶酪板迷宫外围有铁皮圆柱围栏202，围栏上贴有不同形状的线索提示物；迷宫顶上盖有尼龙网203，防止树鼩从迷宫中逃逸。
53.s012：对奶酪板迷宫进行实验布置
54.选取奶酪板迷宫边上任意靠壁位置作为迷宫的起始区，放置亚克力板透明三维休息盒201，树鼩每次训练始点都是从三维休息盒201中出去寻找奖励，在2min内吃完三个食物奖励即为完成了一次训练，然后用食物引诱其回到三维休息盒201后，实验者在洞中放置下一次训练的食物奖励。
55.s013：实验周期内环境设置
56.海马损毁前后实验，奶酪板迷宫房间环境温度都维持在22℃-24℃、湿度50％-70％，迷宫内壁和周围墙上都设置有不同形状及颜色的提示卡，开始实验前需调整灯光，保证光照均匀，迷宫内无返光、无阴影，避免因光线差异对树鼩偏好的影响，房间内陈设，光源及其他环境条件在整个实验周期内保持不变，且实验期间需保持环境安静，减少对动物的干扰。
57.s02:实验训练
58.s021:实验前准备
59.选取11只树鼩进行奶酪板迷宫实验，每天实验前，称量并记录每只树鼩的体重，结合体重变化和训练期间树鼩的状态与表现，确定当天训练后的饲喂量。
60.s022:海马损毁前树鼩实验训练
61.①
、熟悉环境：在迷宫表面和洞里都遍布食物，实验树鼩顺序每天随机生成，将树鼩从饲养窝箱中轻柔的赶进三维休息盒201，再转移至迷宫起始区，给予1min的冷静期，冷静期后打开三维休息盒201闸门，待树鼩进入迷宫寻找食物奖励，同时操作电脑开始记录其轨迹。树鼩进入迷宫吃完3个食物或到达2min截止时间停止记录，诱导树鼩进入三维休息盒
201，给予面包奖励，足迹均匀且学会在洞里觅食的树鼩则进入下一阶段训练。
62.②
、食物井位置改变：
63.第一天：任选三个面积为1的食物井102放置食物碎屑作为该天的奖励井，相对集中的食物奖励能降低实验难度，增强树鼩执行任务的信心。将实验树鼩通过三维休息盒201转移至迷宫起始区，给予1min的冷静期，冷静期后打开三维休息盒201闸门，待树鼩进入迷宫寻找食物奖励，同时操作电脑开始记录其轨迹。树鼩进入迷宫吃完3个食物或到达2min截止时间停止记录，用面包碎屑诱导树鼩回三维休息盒201，此时实验者在食物井再次放置食物，待树鼩休息1min后进行下一次实验，每只每天进行15次训练，每次的训练方法一致。
64.第二天：任选三个面积为4的食物井102放置食物碎屑作为该天的奖励井，训练方法和次数同第一天。
65.第三天：任选三个面积为8的食物井102放置食物碎屑作为该天的奖励井，训练方法和次数同第一、二天。
66.③
正式训练：任选三个面积为11-13的食物井102放置食物碎屑作为训练期的奖励井，训练期每天更改食物井位置。方法同食物井位置改变训练期，每天训练次数增加到20次。
67.s023：秋水仙素损毁树鼩海马两侧
68.①
、对上述完成完奶酪板迷宫训练的树鼩进行三天休息后进行海马损毁，异氟烷麻醉后定位，找到左右脑的6个坐标点后用微量注射泵进行秋水仙素注射，缝合伤口观察树鼩状态，术后给予悉心照料。
69.②
、秋水仙素浓度为0.6μg/μl，每个注射位点体积为1μl。
70.⑤
、海马损毁后的树鼩经过3周休养可进行奶酪板迷宫实验。
71.s024:海马损毁后实验训练
72.①
、熟悉环境：训练方法和标准同海马损毁前实验。
73.②
、正式训练：实验者、训练天数和次数同损毁前实验一样，第一天到第六天，食物井的设置与损毁前实验一一对应，位置与损毁前实验呈y轴镜像对称。
74.s025：实验注意事项
75.①
、每次实验结束后需及时清理迷宫内食物和动物残留物，每只动物结束后需彻底清理迷宫及三维休息盒，防止对后续待测树鼩产生气味干扰。
76.②
、每只树鼩当天训练后，对树鼩进行限制性的给予狗粮，具体限粮需满足能够在维持体重不低于实验前体重的80％且不宜下降过快的前提下进行。
77.③
、海马损毁后，实验训练分为熟悉环境和正式训练两阶段，无食物井位置改变的阶段，因为损毁前的树鼩已经知道了食物井每天都在改变。
78.④
、由于每只树鼩的性格不同，熟悉迷宫的天数也各不同，胆小、易受惊的树鼩需要更长的时间来适应环境，可人为诱导树鼩充分探索迷宫，直至树鼩能够自主觅食，足迹均匀遍布迷宫即可进入下一阶段的训练。损毁后的树鼩对迷宫环境较为熟悉，熟悉环境阶段花费的时间更少。
79.s03:确定成模指标
80.用deeplabcut(dlc)建模分析正式训练期的路线系数，损毁前后分析方法一致，取每只树鼩当天训练中路线系数最大五次的平均值，11只树鼩平均后得到该天群体的路线系
数平均值。将群体损毁前后的数据以训练天数为横轴，路线系数平均值为纵轴作图，得到损毁前后群体平均路线系数对比图。
81.路线系数＝经过食物井顺序的直线距离之和
÷
实际经过的行程长度之和，即路线系数越大，树鼩规划的觅食路线越优。
82.其中：d1树鼩从休息盒到达第一个奖励井之间的直线距离，d2树鼩从第一个奖励井到下一个奖励井之间的直线距离，d3为树鼩从第二个奖励井到第三个奖励井之间的直线距离；p1为树鼩从休息盒到达第一个奖励井的实际行程长度，p2为树鼩从第一个奖励井到下一个奖励井的实际行程长度，p3为树鼩从第二个奖励井到第三个奖励井的实际行程长度；路线系数越大，树鼩规划的觅食路线越优。
83.结果显示：
①
奶酪板迷宫树鼩实验方法在海马损毁前后，群体平均路线系数最大的5次有显著差异(p＝0.001)，说明海马损毁后的树鼩在执行奶酪板迷宫任务时，空间记忆能力受损。
②
成功建立了评估树鼩空间记忆的行为学范式，成模标准、成模指标制定合理。

技术特征：
1.一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法，具体步骤为：s01:实验准备s011：准备奶酪板迷宫装置奶酪板迷宫是一个圆形竞技场，主板是均匀分布有120个洞的白色聚丙烯材质圆形板，两两洞心之间的距离是相等的，主板分割为4块扇形板，便于拆装和清理；主板下方安装有一底板，所述主板和所述底板组成一块包含120个食物井的盲孔迷宫；所述奶酪板迷宫外围有铁皮圆柱围栏，围栏上贴有不同形状的线索提示物；所述奶酪板迷宫顶上盖有尼龙网，防止树鼩从迷宫中逃逸；s012：对奶酪板迷宫进行实验布置选取奶酪板迷宫边上任意靠壁位置作为迷宫的起始区，放置亚克力板透明三维休息盒，树鼩每次训练始点都是从三维休息盒中出去寻找奖励，在2min内吃完三个食物奖励即为完成了一次训练，然后用食物引诱其回到三维休息盒后，实验者在食物井中放置下一次训练的食物奖励；s013：实验周期内环境设置海马损毁前后的实验，奶酪板迷宫房间环境温度维持在20℃-26℃、湿度40％-70％，迷宫内壁和周围墙上都设置有不同形状及颜色的提示卡，实验周期内迷宫亮度均匀，房间内陈设、光源及其他环境条件在训练周期保持不变，环境保持安静；s02:实验训练s021:实验前准备每天实验前，称量并记录每只树鼩的体重，结合体重变化和训练期间树鼩状态与表现，确定实验周期内的限食饲喂量；s022:海马损毁前训练1、熟悉环境：在迷宫表面和洞里都遍布食物，当树鼩在迷宫中能够自主觅食井里的食物，足迹均匀分布，且其紧张、焦虑、不专心等情绪引发的行为较少时，即可进入下一阶段的训练；2、食物井位置改变：进行3天训练，每天任意选取三个井放置食物，食物井的位置每天改变，且食物井组成的食物井面积随训练天数依次增大，即3天食物井面积分别为1、4、8单位，完成此阶段后进入正式训练期；3、正式训练：进行6天的训练，每天改变食物井的位置，正式训练期三个食物井面积为11-13单位，对训练期数据进行统计分析；s023：神经毒素秋水仙素损毁树鼩海马1、选用神经毒素秋水仙素局部注射的方法进行海马损毁，左右脑各注射三个点，分别损毁动物的背侧、中间、腹侧海马，损毁坐标由树鼩脑图谱推断；2、损毁后的树鼩经过3周休养便可进行奶酪板迷宫实验；s024：海马损毁后实验训练1、熟悉环境：训练方法及标准同海马损毁前步骤s022一致；2、正式训练：训练天数及次数同海马损毁前步骤s022一样，食物井的位置与损毁前呈y轴镜像对称且与损毁前第一到第六天一一对应，避免损毁前后因奖励井难度设置不同而对实验结果产生影响；
s025：实验注意事项
①
、每次实验结束后及时清理迷宫内食物和动物残留物，每只动物结束后需彻底清理迷宫及休息盒。
②
、每只树鼩当天训练后，对树鼩进行限制性的给予狗粮，具体限粮需满足能够在维持体重不低于实验前体重的80％且不宜下降过快的前提下进行。所述限粮期的实验树鼩体重需平缓下降。s03:确定成模指标1、采用海马损毁前后树鼩正式训练期间群体的平均路线系数来评估树鼩空间记忆能力，路线系数的计算公式为：路线系数＝经过食物井顺序的直线距离之和
÷
实际经过的行程长度之和，即2、评价指标选择每天20次训练中路线系数最大的五次进行分析，代表树鼩在当天的训练中所能达到的最好水平。2.根据权利要求1所述的一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法，所述步骤s012中实验者在食物井中放置食物的过程用毛巾遮盖三维休息盒防止树鼩看到实验者放置食物。3.根据权利要求1所述的一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法，所述步骤s012中在奶酪板迷宫装置正上方固定一个摄像头连接着计算机，用于记录树鼩的行为。4.根据权利要求1所述的一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法，所述步骤s022熟悉环境的实验过程中可以人为诱导树鼩充分探索迷宫，直至树鼩能够自主觅食，足迹均匀遍布迷宫即可进入下一阶段的训练。5.根据权利要求1所述的一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法，所述步骤s022中食物井面积的计算公式：(a
×
h)
×
1/2；紧挨着的三个食物井组成的三角形食物井面积为0.5单位。

技术总结
一种奶酪板迷宫评估树鼩空间学习记忆能力的方法，包括实验准备、实验训练、确定成模指标三个步骤，实验准备中针对奶酪板迷宫装置、实验布置、环境设置等各参数优化设计，实验训练中在设置海马损毁前及海马损毁后训练，成功建立评估树鼩空间记忆的行为学范式，成模标准、成模指标制定合理。本发明空间学习记忆树鼩模型的成功建立，为后续的神经科学研究如构建AD模型、活体电生理记录、光记录等提供一种适用于树鼩的行为学实验方法，也能够为研究者在空间编码、学习记忆、新药开发、筛选、评价等多个学科和领域的研究提供更有力的科学数据。多个学科和领域的研究提供更有力的科学数据。多个学科和领域的研究提供更有力的科学数据。


技术研发人员：卢立 李成季 惠一晴 葛晓帆 蔡星
受保护的技术使用者：中国科学院昆明动物研究所
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/7/21