一种无细胞蛋白质合成系统及其应用

1.本发明涉及蛋白质合成技术领域，具体涉及一种无细胞蛋白质合成系统及其应用。


背景技术：

2.蛋白质是细胞中的重要分子。在细胞内，蛋白质可以作为酶类催化各种生化反应，可以作为信号分子协调生物体的各种活动，可以支持生物形态，储存能量，运输分子，并使生物体运动，几乎参与了细胞所有功能的执行。
3.传统的蛋白表达是指通过模式生物细菌、真菌、植物细胞或动物细胞等在细菌细胞体内表达外源基因的一种分子生物学技术。随着科学技术的发展，无细胞蛋白质合成系统(cell-free protein synthesis，cfps)技术应运而生。其是基于底盘细菌提取物，以外源mrn a或dna为目的模板，通过补加合成蛋白质所需的底物和转录、翻译相关辅因子等原料，从而实现目的蛋白质合成的系统。为蛋白质的生产和应用提供了一些独特的优势，例如，反应的开放环境允许用户直接添加或合成精确浓度的新成分，且过程无需进行质粒构建、转化、细胞培养、细胞收集和破碎等步骤，是一种快速、省时、便捷的蛋白质表达方式，可以更快、更方便、更可控地针对不同产品进行设计、测试和优化。
4.cfps体系的发展近年来仍集中在几个常见的模式细菌上，如大肠杆菌、酵母、小麦胚芽、兔网织红细胞和昆虫细胞；模式细菌cfps的发展也较为完善，尤其是大肠杆菌因培养条件和细胞裂解方法操作简单具有明显的优势，蛋白质产量最高可达数毫克/毫升，成为目前cfps体系的首选宿主细胞。而关于采用非模式细菌作cfps的底盘细菌的相关研究还十分有限，因此，需要进一步进行深入的探索和比较分析，以更好地指导cfps体系的应用。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种无细胞蛋白质合成系统及其应用。
6.为了实现上述目的，本发明的实施例在提出了一种无细胞蛋白质合成系统，其包括：
7.底盘细菌细胞粗提物，所述底盘细菌细胞粗提物为地衣芽孢杆菌粗提物；
8.dna模板，所述dna模板为整合有荧光报告基因的载体；
9.缓冲液；
10.氨基酸；
11.核苷三磷酸混合物；
12.peg8000。
13.根据本发明实施例的一种无细胞蛋白质合成系统，以地衣芽孢杆菌提取物为底盘细菌，在外源添加缓冲液、氨基酸、再生能量系统、无机盐和其他辅因子等组分，实现体外蛋白合成反应，从而在不同底盘细菌中开发cfps体系来扩大体外合成蛋白的平台范围和潜在
选择，生产多种高表达的结构和功能蛋白。
14.另外，根据本发明上述实施例提出的一种无细胞蛋白质合成系统，还可以具有如下附加的技术特征：
15.可选地，所述dna模板的序列为seq id no：1。
16.可选地，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
17.可选地，所述核苷三磷酸混合物包括1.2mm腺嘌呤核苷三磷酸、0.9mm鸟嘌呤核苷三磷酸、0.9mm胞嘧啶核苷三磷酸和0.9mm尿嘧啶核苷三磷酸。
18.可选地，还包括谷氨酸钾、谷氨酸镁、磷酸烯醇式丙酮酸、环磷酸腺苷、辅酶a、腐胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、trna、叶酸和亚精胺。
19.可选地，所述地衣芽孢杆菌粗提物的制备包括：
20.将地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)cgmcc no.2876在ytp培养基中培养，得到二级种子液；
21.将二级种子液以8000rpm，4℃条件离心，留菌体沉淀，菌体沉淀用s30a缓冲液重悬，启动超声破碎仪进行破碎，向超声破碎仪内加入适量的冰水混合物，破碎后的样品10000rpm离心，将上清转移至无菌干净的1.5ml离心管中，锡箔纸包裹，避光置于37℃孵育80min，孵育后的样品10000rpm离心，取上清液在冰上分装，液氮速冻后存于-80℃冰箱内。
22.本发明的另一方面提出一种试剂盒，所述的试剂盒包括容器和位于容器内的上述的无细胞蛋白质合成系统。
23.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
24.图1为根据本发明实施例的无细胞蛋白合成系统建立的流程图；
25.图2为根据本发明实施例的无细胞蛋白合成系统进行反应时间与荧光蛋白合成量的关系图；纵坐标表示合成的荧光蛋白荧光强度(a.u.)，横坐标表示反应的时间(h)；
26.图3为根据本发明实施例的含有荧光报告基因的质粒图谱示意图；
27.图4为根据本发明实施例的yt+p、yt和lb培养基下获得的底盘细菌粗提物在cfps系统中合成荧光报告蛋白的柱状图；
28.图5为根据本发明实施例的地衣芽孢杆菌cfps系统中质粒浓度对蛋白质表达的影响柱状图；
29.图6为地衣芽孢杆菌cfps系统中分子拥挤度对蛋白质表达的影响柱状图；
30.图7为衣芽孢杆菌cfps系统中氧化还原环境对蛋白质表达的影响柱状图。
具体实施方式
31.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调
整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
32.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
33.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
34.ytp培养基：称取16g的胰蛋白胨(tryptone)，10g的酵母提取物(yeast extract)，5g的氯化钠(sodium chloride)，溶于1l的水中，加入终浓度为22mm的kh2po4及40mm的k2hpo4，灭菌待用。
35.底盘细菌为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)cgmcc no.2876。
36.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
37.实施例1地衣芽孢杆菌粗提物
38.用接种环从保种管中蘸取适量菌液后在不添加抗生素的lb固体培养基上划线复苏。挑取单菌落至20ml新鲜的ytp液体培养基中，于37℃，200rpm摇床过夜制备一级种子液；一级种子液以5％的接种量转入100ml新鲜的ytp液体培养基，培养至菌体进入对数生长期的末期(约3.5h)，制备二级种子液。
39.地衣芽孢杆菌的菌液(二级种子液)以8000rpm，4℃条件离心，留菌体沉淀。菌体沉淀用s30a缓冲液重悬，离心并记录菌体质量，用液氮快速冷冻保存。待使用时，用s30a缓冲液重悬。启动超声破碎仪进行破碎，向超声破碎仪内加入适量的冰水混合物，营造低温环境，防止破碎过程过热，影响细胞提取物活性，破碎后的样品10000rpm离心，将上清转移至无菌干净的1.5ml离心管中，锡箔纸包裹，避光置于37℃孵育80min。孵育后的样品10000rpm离心，取上清液在冰上分装，液氮速冻后存于-80℃冰箱内，即得地衣芽孢杆菌粗提物。
40.实施例2无细胞蛋白质合成系统
41.地衣芽孢杆菌cfps反应体系(原始体系)120mm谷氨酸钾、7mm谷氨酸镁、25mm磷酸烯醇式丙酮酸、8mm环磷酸腺苷(camp)、2mm氨基酸、1mm腐胺、0.3mm辅酶a(coa)、0.33mm烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、1.2mm atp、0.9mm gtp、0.9mm ctp、0.9mm gtp、3mm trna、34μg/ml叶酸、50mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、1.5mm亚精胺、25μl细胞粗提物(实施例1获得)、250ng dna模板，用溶剂(无菌水)补充到50μl。
42.在反应体系中，各组分不变的情况下，使无细胞蛋白合成反应的时间从0h增加到10h后，设置无dna的对照组，分别从各实验组及对照组取样，通过检测荧光强度进行比较。
43.结果如图2所示，在地衣芽孢杆菌cfps反应中，目的(荧光)蛋白快速合成，约4h便达到了峰值。
44.其他条件不变，将接种的培养基替换成yt培养基或lb培养基，检测荧光强度。
45.结果如图4所示，更高含量碳源和添加有磷元素的ytp培养基为地衣芽孢杆菌活化最适培养基。
46.dna浓度是影响cfps反应中蛋白质产量的关键因素。质粒dna浓度的增加可以提供更多的转录元件来支持转录和翻译过程，可能导致蛋白质产量的增加。在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，将体系中的质粒浓度从0ng/μl增加到600ng/μl，设置无dna的对照
组，及100ng/μl、200ng/μl、300ng/μl、400ng/μl、500ng/μl和600ng/μl的实验组分别进行无细胞蛋白合成反应。待4h后，分别从各实验组及对照组取样，通过检测荧光强度进行比较。
47.结果如图5所示，cfps体系中存在质粒浓度饱和点，体系的荧光强度先随着质粒浓度的增大而提高，但到饱和点后荧光强度会趋于稳定。地衣芽孢杆菌cfps体系筛选出最优的质粒浓度为250ng/μl。
48.在无细胞系统中分子拥挤度会对分子动力学产生很大的影响，为了模拟活细胞的拥挤环境，添加一些拥挤剂(如聚乙二醇等)来增加无细胞体系中的分子密度。在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，设置未额外添加拥挤剂作对照组，及在该体系中分别添加了1％、1.5％、2％、2.5％、3％ peg8000的实验组分别进行无细胞蛋白合成反应。待4h后，分别从各实验组及对照组取样，通过检测荧光强度进行比较。
49.结果如图6所示，地衣芽孢杆菌cfps体系筛选出最优的分子拥挤剂(以peg8000为例)添加量为2％。
50.体系中的氧化环境也是影响蛋白质合成的关键因素，因为它会影响体系的催化性能，也会影响某些蛋白质中二硫键的形成。在氧化还原环境测试实验中，变量是由谷胱甘肽(氧化型)和谷胱甘肽(还原型)的比值而调节的环境氧化还原偏好。在反应体系中其他组分浓度不变的情况下，设置未额外添加氧化还原剂作对照组，及在该体系中gssg和gsh添加量的比值分别为1：8、1：4、1：1、4：1、8：1的实验组分别进行无细胞蛋白合成反应。待4h后，分别从各实验组及对照组取样，通过检测荧光强度进行比较。
51.结果如图7所示，还原环境更利于地衣芽孢杆菌cfps系统合成目的蛋白。当中谷胱甘肽(氧化型)和谷胱甘肽(还原型)的最优比为1：8。
52.实施例3优化后的无细胞蛋白质合成系统
53.地衣芽孢杆菌反应体系：以50μl cfps系统为例，各试剂组分及浓度如下：
54.组分浓度组分浓度谷氨酸钾120mm磷酸烯醇式丙酮酸25mm谷氨酸镁7mm环磷酸腺苷(camp)8mm氨基酸2mm腐胺1mm辅酶a(coa)0.3mm烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)0.33mmatp1.2mmtrna3mmgtp、ctp、gtp；0.9mm叶酸34μg/ml4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)50mm亚精胺1.5mm细胞粗提物(实施例1获得)25μlpeg80002％dna模板(图3所示)250ng溶剂(无菌水)补充到50μl
55.将上述的反应体系混匀后在37℃培养箱4h进行蛋白质表达。
56.荧光蛋白测定：孵育结束后，立即放置于molecular devices多功能酶标仪，检测荧光信号强弱，以相对荧光单位值(relative fluorescence unit,rfu)作为活性单位。
57.在该优化后的反应体系下孵育得到的荧光蛋白合成量为14μg/ml。
58.综上，根据本发明的实施例，开发了一种地衣芽孢杆菌的无细胞蛋白合成系统，经超声破碎制备的地衣芽孢杆菌提取物，在外源添加缓冲液、氨基酸、再生能量系统、无机盐和其他辅因子等组分，实现体外蛋白合成反应，从而在不同底盘细菌中开发cfps体系来扩
大体外合成蛋白的平台范围和潜在选择，生产多种高表达的结构和功能蛋白。
59.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
60.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种无细胞蛋白质合成系统，其特征在于，包括：底盘细菌细胞粗提物，所述底盘细菌细胞粗提物为地衣芽孢杆菌粗提物；dna模板，所述dna模板为整合有荧光报告基因的载体；缓冲液；氨基酸；核苷三磷酸混合物；peg8000。2.如权利要求1所述的无细胞蛋白质合成系统，其特征在于，所述dna模板的序列为seq id no：1。3.如权利要求1所述的无细胞蛋白质合成系统，其特征在于，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。4.如权利要求1所述的无细胞蛋白质合成系统，其特征在于，所述核苷三磷酸混合物包括1.2mm腺嘌呤核苷三磷酸、0.9mm鸟嘌呤核苷三磷酸、0.9mm胞嘧啶核苷三磷酸和0.9mm尿嘧啶核苷三磷酸。5.如权利要求1所述的无细胞蛋白质合成系统，其特征在于，还包括谷氨酸钾、谷氨酸镁、磷酸烯醇式丙酮酸、环磷酸腺苷、辅酶a、腐胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、trna、叶酸和亚精胺。6.如权利要求1所述的无细胞蛋白质合成系统，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌粗提物的制备包括：将地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)cgmcc no.2876在ytp培养基中培养，得到二级种子液；将二级种子液以8000rpm，4℃条件离心，留菌体沉淀，菌体沉淀用s30a缓冲液重悬，启动超声破碎仪进行破碎，向超声破碎仪内加入适量的冰水混合物，破碎后的样品10000rpm离心，将上清转移至无菌干净的1.5ml离心管中，锡箔纸包裹，避光置于37℃孵育80min，孵育后的样品10000rpm离心，取上清液在冰上分装，液氮速冻后存于-80℃冰箱内。7.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括容器和位于容器内的如权利要求1-5中任一项所述的无细胞蛋白质合成系统。

技术总结
本发明公开了一种无细胞蛋白质合成系统及其应用，该系统包括：底盘细菌细胞粗提物，所述底盘细菌细胞粗提物为地衣芽孢杆菌粗提物；DNA模板，所述DNA模板为整合有荧光报告基因的载体；缓冲液；氨基酸；核苷三磷酸混合物；PEG8000。该系统以地衣芽孢杆菌提取物为底盘细菌，在外源添加缓冲液、氨基酸、再生能量系统、无机盐和其他辅因子等组分，实现体外蛋白合成反应，从而在不同底盘细菌中开发CFPS体系来扩大体外合成蛋白的平台范围和潜在选择，生产多种高表达的结构和功能蛋白。产多种高表达的结构和功能蛋白。


技术研发人员：何宁 翁悦 夏文昊 曹名锋
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2022.10.18
技术公布日：2023/7/21