提高反刍动物瘤胃氮素转化效率的敏捷乳杆菌及其应用

1.本发明涉及一株用于饲料添加剂的乳杆菌，尤其涉及一株提高反刍动物瘤胃氮素转化效率的敏捷乳杆菌（lactobacillus agilis），属于敏捷乳杆菌及其应用领域。


背景技术：

2.反刍动物由于其独特的复胃结构，造成其氮利用效率低下，仅为24%-25%。瘤胃微生物参与反刍动物瘤胃氮代谢，其中，瘤胃细菌发酵产生过量的氨，超过微生物的利用效率，过量的氨随粪便和尿液排出体外，造成蛋白质资源浪费和环境污染。
3.反刍动物饲料中使用的微生物饲料添加剂主要用于稳定肠道菌群，促进成年奶牛瘤胃菌群的发育，改善流向下消化道的氮流，提高奶产量。在功能正常的反刍动物中，最初存在于饲料中的糖和蛋白质首先通过瘤胃中的细菌进行发酵。
4.鉴于有益微生物在饲料转化中的重要性，如果能够分离获得提高奶牛氮素转化效率的微生物菌株，这对于控制瘤胃发酵以提高动物生产力并提高反刍动物瘤胃内氮利用效率均具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供一株能够提高反刍动物瘤胃氮素转化效率的敏捷乳杆菌；本发明的目的之二是将所述敏捷乳杆菌作为饲料添加剂应用于提高反刍动物瘤胃氮素转化效率；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的一方面是提供了一株敏捷乳杆菌（lactobacillus agilis）w70，其微生物保藏编号是cgmcc no. 25654，其分类命名是：敏捷乳杆菌lactobacillus agilis，保藏单位是：中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏时间是：2022年9月7日。
6.其中，所述敏捷乳杆菌（lactobacillus agilis）w70的16s rrna的核苷酸序列为seq id no.1所示。
7.本发明的另一方面是将所述的敏捷乳杆菌（lactobacillus agilis）w70作为饲料添加剂应用于提高反刍动物瘤胃氮素转化效率。
8.其中，所述的提高反刍动物瘤胃氮素转化效率包括但不限于：（1）降低反刍动物瘤胃的nh3n含量；（2）提高反刍动物瘤胃的微生物蛋白（mcp）生成能力；（3）降低反刍动物瘤胃的乙酸/丙酸比；（4）升高反刍动物瘤胃的总挥发酸（vfa）含量。
9.本发明中所述的反刍动物包括但不限于：牛，羊，骆驼或者鹿，优选为牛，更优选为奶牛。
10.本发明的敏捷乳杆菌能够有效提高奶牛氮素转化效率，在控制瘤胃发酵以提高动物生产力以及提高反刍动物瘤胃内氮利用效率均具有应用前景。
11.本发明整体技术方案详述为了提高反刍动物瘤胃内氮利用效率，本发明以筛选自瘤胃的13株细菌为研究对象，筛选氨氮移除细菌，并对筛选出的氨氮移除细菌lactobacillus agilisw70对氨氮移除、mcp生成和提高瘤胃内氮素转化能力进行研究，为减少瘤胃内氮排放提供依据。
12.本发明使用培养组学方法，针对荷斯坦奶牛瘤胃液，使用m10琼脂、血琼脂、schaelder琼脂、wilkins-chalgren琼脂、脑心浸液琼脂、三丁酸甘油琼脂、苛养厌氧琼脂、mrs琼脂、氨基葡萄糖琼脂、pyg琼脂、rgca琼脂共11种培养基分别在有氧（恒温培养箱）、厌氧（厌氧培养箱）环境中进行纯培养菌株分离，将得到的菌株进行氨氮移除功能菌株筛选，以筛选自瘤胃的有氧条件下生长的bacillus safenisisb55、lactobacillus agilisw70、microbacterium saccharophilumw1、bacillus safenisisb52、bacillus safenisisf79、weissella confusew26、enterococcus camellianes35细菌和厌氧条件下生长的lactobacillus mucosaes12、enterococcus faeciumf42、lactobacillus fermentumm50、enterococcus lactism21、enterococcus faeciumb2、lactobacillus salivariusx36细菌为研究对象，进行氨氮移除细菌筛选，发现lactobacillus agilisw70和lactobacillus fermentumm50具有较高的氨氮移除和mcp生成能力。
13.其中，在以30mmol/l氨氮为唯一氮源时lactobacillus agilisw70具有最大的氨氮移除能力，由0h的52.13mg/dl降至15h的35.4mg/dl，移除32.09%氨氮。
14.本发明进一步采用体外发酵测定lactobacillus agilisw70和lactobacillus fermentumm50对瘤胃氮素的转化效率。根据试验数据可见，与对照组相比，添加lactobacillus agilisw70后，使nh3n极显著降低（16.19%），mcp极显著升高（23.81%），其中，lactobacillus agilisw70在降低nh3n和升高mcp的效果上明显优于lactobacillus fermentumm50；与对照组相比，添加lactobacillus agilisw70后，使总vfa极显著升高；其中，lactobacillus agilisw70在降低乙酸/丙酸比和升高总vfa的效果上明显优于lactobacillus fermentumm50。
附图说明
15.图1为在有氧条件下氨氮移除菌株筛选试验结果；生长的菌株中，bacillus safenisisb55、lactobacillus agilisw70、microbacterium saccharophilumw1、bacillus safenisisb52、bacillus safenisisf79、weissella confusew26、enterococcus camellianes35中，lactobacillus agilisw70具有较高的氨氮移除和mcp生成能力。
16.图2为在厌氧条件下氨氮移除菌株筛选试验结果；lactobacillus mucosaes12、enterococcus faeciumf42、lactobacillus fermentumm50、enterococcus lactism21、enterococcus faeciumb2、lactobacillus salivariusx36中，lactobacillus fermentumm50具有较高的氨氮移除和mcp生成能力。
17.图3为lactobacillus agilisw70在5、10、15、20、25、30mmol/l氨氮为唯一氮源，od、氨氮和mcp测定结果；在5、10、15、20、25、30mmol/l氨氮为唯一氮源时，lactobacillus agilisw70具有一定的氨氮移除能力；在30mmol/l氨氮为唯一氮源时具有最大的氨氮移除能力，由0h的52.13mg/dl降至15h的35.4mg/dl，移除32.09%氨氮。
18.图4为lactobacillus fermentumm50在5、10、15、20、25、30mmol/l氨氮为唯一氮
源，od、氨氮和mcp测定结果；在5、10、15、20、25、30mmol/l氨氮为唯一氮源时，lactobacillus fermentumm50具有一定的氨氮移除能力，在30mmol/l氨氮为唯一氮源时具有最大的氨氮移除能力，由0h的52.88mg/dl降至15h的31.39mg/dl，移除40.64%氨氮。
19.图5为以5mmol/l氨氮为唯一氮源时，lactobacillus agilisw70的氨氮移除和mcp生成能力测定；在以5mmol/l氨氮为唯一氮源时，15h时氨氮由0h的11.06mg/dl降至9.48mg/dl，降低了14%，同时15h时mcp由0h的0.06g/l增加至0.2g/l，增加了70%。
20.图6为以15mmol/l氨氮为唯一氮源时，lactobacillus agilisw70的氨氮移除和mcp生成能力测定；在以15mmol/l氨氮为唯一氮源时，15h时氨氮由0h的26.20mg/dl降至23.48mg/dl，降低了10%，同时15h时mcp由0h的0.07g/l增加至0.2g/l，增加了65%。
21.图7为以25mmol/l氨氮为唯一氮源时，lactobacillus agilisw70的氨氮移除和mcp生成能力测定；在以25mmol/l氨氮为唯一氮源时，15h时氨氮由0h的38.92mg/dl降至36.13mg/dl，降低了7%，同时15h时mcp由0h的0.10g/l增加至0.26g/l，增加了62%。
22.图8为lactobacillus agilisw70的生长曲线图。
具体实施方式
23.以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
24.实施例1 敏捷乳杆菌（lactobacillus agilis）w70的分离、筛选和鉴定1试验方法1 .1菌株分离采取中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平动物试验基地荷斯坦奶牛瘤胃内容物1ml，添加30%甘油，放置于厌氧密封盒中保温带回实验室，使用m10琼脂、血琼脂、schaelder琼脂、wilkins-chalgren琼脂、脑心浸液琼脂、三丁酸甘油琼脂、苛养厌氧琼脂、mrs琼脂、氨基葡萄糖琼脂、pyg琼脂、rgca琼脂共11种培养基分别在有氧（恒温培养箱）、厌氧（厌氧培养箱）环境中进行培养组学实验，进行纯培养操作，使用涂布平板法进行涂布，并挑选单菌落纯化后进行16s rrna鉴定。
25.1.2 氨氮移除菌株筛选将上述分离菌株接种于装液量250 ml的500ml的以30mmol/l氨氮为唯一氮源的培养基中进行培养，温度39℃，15h取样，测定发酵液od（600nm）、氨氮和mcp（微生物蛋白）值。
26.1.3lactobacillus agilisw70和lactobacillus fermentumm50在5、10、15、20、25、30mmol/l氨氮为唯一氮源条件下，od（600nm）、氨氮和mcp测定将lactobacillus agilisw70和lactobacillus fermentumm50接种于装液量250 ml的500ml的以5、10、15、20、25、30mmol/l氨氮为唯一氮源的培养基中进行培养，温度39℃，15h取样，测定发酵液od（600nm）、氨氮和mcp值。
27.1.4lactobacillus agilisw70在以5、15、25mmol/l氨氮为唯一氮源时，od（600nm）、氨氮和mcp测定将lactobacillus agilisw70接种于装液量250 ml的500ml的以5、15、25mmol/l氨
氮为唯一氮源的培养基中进行培养，温度39℃，0h、15h取样，测定发酵液od（600nm）、氨氮和mcp值。
28.2试验结果2.1氨氮移除菌株筛选在有氧条件下生长的菌株中，bacillus safenisisb55、lactobacillus agilisw70、microbacterium saccharophilumw1、bacillus safenisisb52、bacillus safenisisf79、weissella confusew26、enterococcus camellianes35中，lactobacillus agilisw70具有较高的氨氮移除和mcp生成能力（图1）。
29.在厌氧条件下，lactobacillus mucosaes12、enterococcus faeciumf42、lactobacillus fermentumm50、enterococcus lactism21、enterococcus faeciumb2、lactobacillus salivariusx36中，lactobacillus fermentumm50具有较高的氨氮移除和mcp生成能力（图2）。
30.2.2lactobacillus agilisw70和lactobacillus fermentumm50在5、10、15、20、25、30mmol/l氨氮为唯一氮源，od、氨氮和mcp测定在5、10、15、20、25、30mmol/l氨氮为唯一氮源时，lactobacillus agilisw70具有一定的氨氮移除能力。在30mmol/l氨氮为唯一氮源时具有最大的氨氮移除能力，由0h的52.13mg/dl降至15h的35.4mg/dl，移除32.09%氨氮（图3）。
31.在5、10、15、20、25、30mmol/l氨氮为唯一氮源时，lactobacillus fermentumm50具有一定的氨氮移除能力，在30mmol/l氨氮为唯一氮源时具有最大的氨氮移除能力，由0h的52.88mg/dl降至15h的31.39mg/dl，移除40.64%氨氮（图4）。
32.2.3以5、15、25mmol/l氨氮为唯一氮源时，lactobacillus agilisw70的氨氮移除和mcp生成能力测定在以5mmol/l氨氮为唯一氮源时，15h时氨氮由0h的11.06mg/dl降至9.48mg/dl，降低了14%，同时15h时mcp由0h的0.06g/l增加至0.2g/l，增加了70%（图5）。
33.在以15mmol/l氨氮为唯一氮源时，15h时氨氮由0h的26.20mg/dl降至23.48mg/dl，降低了10%，同时15h时mcp由0h的0.07g/l增加至0.2g/l，增加了65%（图6）。
34.在以15mmol/l氨氮为唯一氮源时，15h时氨氮由0h的38.92mg/dl降至36.13mg/dl，降低了7%，同时15h时mcp由0h的0.10g/l增加至0.26g/l，增加了62%（图7）。
35.2.4氨氮移除菌株的鉴定所筛选的lactobacillus agilisw70的16s rrna的核苷酸序列为seq id no.1所示。根据菌株16s rrna序列结果，在ncbi上进行比对，相似度为100%，鉴定为敏捷乳杆菌lactobacillus agilis。
36.2.5lactobacillus agilisw70的生长特性lactobacillus agilisw70的生长曲线见图8。根据图8可见，lactobacillus agilisw70在15h达到最大生长量，对应的od值为1.10。
37.试验例1应用敏捷乳杆菌菌株的体外发酵试验1试验方法1.1试验菌株实施例1所筛选的lactobacillus agilisw70和lactobacillus fermentumm50。
38.1.2发酵底物与添加物发酵底物：tmr日粮（采自中国农科院畜牧兽医研究所昌平基地）。
39.添加物：1
×
109cfu/mllactobacillus agilisw70和lactobacillus fermentumm50。
40.1.3瘤胃液采集及缓冲液配制选用3头胎次相同、健康且装有永久性瘤胃瘘管的泌乳期荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体。奶牛每天饲喂2次（7: 00和19: 00），自由饮水。在晨饲后2h采集瘤胃液，混合后装于保温瓶带回实验室，在厌氧无菌条件下经4层纱布过滤，操作在39℃水浴进行。同时配制缓冲液，配制完成后持续通入co2，至ph 值为 6.8~7.0 为止，置于39℃水浴中恒温静置，备用。
41.1.4发酵方法与组别设置准确称取约0.5g发酵底物于100ml厌氧发酵瓶中，接种时迅速将每个瓶中加入预热的液体培养基50ml和4层纱布过滤的新鲜瘤胃液25ml，并向瓶中持续通入co25s后，立即加上瓶塞，并将每个发酵瓶于39 ℃恒温箱下分别连续培养24h，实验设置3组，分别为ctl组（空白对照），w70组（lactobacillus agilisw70）和m50组（lactobacillus fermentumm50），每组6个重复，实验重复2次。
42.1.5样品采集及制备在发酵培养24h后结束发酵程序，立即测定发酵液ph值，将发酵液通过尼龙袋过滤发酵液固相后，收集部分发酵液，－20 ℃冷冻保存，用于挥发性脂肪酸（vfa）、nh
3-n和微生物蛋白（mcp）指标的测定。
[0043] 2试验结果体外发酵测定lactobacillus agilisw70和lactobacillus fermentumm50对瘤胃氮素转化效率的影响结果见表1和表2。
[0044]
表1 体外发酵测定w70和m50对nh3n和mcp的影响 根据表1的试验数据可见，与对照组相比，添加lactobacillus agilisw70后，使nh3n极显著降低（16.19%），mcp极显著升高（23.81%），其中，lactobacillus agilisw70在降低nh3n和升高mcp的效果上明显优于lactobacillus fermentumm50。
[0045]
表2 体外发酵测定w70和m50对乙丙比和总vfa的影响
根据表2的试验数据可见，与对照组相比，添加lactobacillus agilisw70后，使乙酸/丙酸比极显著降低，使总vfa（挥发酸）升高；其中，lactobacillus agilisw70在降低乙酸/丙酸比和升高总vfa的效果上明显优于lactobacillus fermentumm50。

技术特征：
1.一株敏捷乳杆菌（lactobacillus agilis），其特征在于，其微生物保藏编号是：cgmcc no. 25654。2.权利要求1所述的敏捷乳杆菌在制备提高反刍动物瘤胃氮素转化效率的饲料添加剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述提高反刍动物瘤胃氮素转化效率是降低反刍动物瘤胃的nh3n含量。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述提高反刍动物瘤胃氮素转化效率是提高反刍动物瘤胃的微生物蛋白生成能力或含量。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述提高反刍动物瘤胃氮素转化效率是降低反刍动物瘤胃的乙酸/丙酸比。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述提高反刍动物瘤胃氮素转化效率是提高反刍动物瘤胃的总挥发酸含量。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的反刍动物包括牛，羊，骆驼或者鹿。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的反刍动物是牛。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的牛是奶牛。

技术总结
本发明公开了提高反刍动物瘤胃氮素转化效率的敏捷乳杆菌及其应用,属于敏捷乳杆菌及其应用领域。为了提高反刍动物瘤胃内氮利用效率，本发明以选自瘤胃的13株细菌为研究对象筛选氨氮移除细菌，从中筛选得到一株敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilis），其微生物保藏编号是CGMCC No.25654。本发明所筛选分离的敏捷乳杆菌能够有效降低瘤胃NH3N含量和乙酸/丙酸比，升高MCP和总VFA含量，在控制瘤胃发酵以提高动物生产力以及提高反刍动物瘤胃内氮利用效率等方面具有应用前景。等方面具有应用前景。等方面具有应用前景。


技术研发人员：卜登攀 马露 段晓微
受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/7/21