一种肺癌C-MYC基因扩增的FISH检测方法与流程

一种肺癌c-myc基因扩增的fish检测方法
技术领域
1.本发明涉及肺癌检测技术领域，具体为一种肺癌c-myc基因扩增的fish检测方法。


背景技术：

2.癌症是全球人类健康的主要威胁之一，每年有数百万人死于癌症。根据最新的年度全球癌症统计报告，肺癌是全世界最常诊断的癌症，也是癌症死亡的主要原因。原发性肺癌通常分为非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌(sclc)。nsclc约占所有肺癌的83％。c-myc基因首先被发现与小细胞肺癌有关，30％的肺癌患者c-myc基因扩增，在非小细胞肺癌(nsclc)患者中，10％存在c-myc基因扩增，50％存在过度表达。定位于8q24的c-myc基因可能在细胞增殖和分化中发挥重要作用，并可能在一定条件下诱导细胞凋亡。
3.myc基因是myc原癌基因家族中的一员，定位于人类染色体8q24，在细胞生长、分化、凋亡过程中发挥调控作用，人类肿瘤中大多可检测到c-myc的表达异常，c-myc原癌基因激活的主要方式是c-myc基因的扩增和过度表达。
4.目前，市场上检测c-myc基因扩增主要用pcr方法，由于检测的是肿瘤和正常细胞的混合物，因此结果不够准确，而市场上迫切需要一种更为准确的检测方法。fish检测技术可用于检测癌症发生和发展过程中的染色体改变，对肺癌临床辅助诊断具有灵敏性和特异性。


技术实现要素：

5.解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种肺癌c-myc基因扩增的fish检测方法，具备对肺癌临床辅助诊断具有灵敏性和特异性的优点，解决了市场上检测c-myc基因扩增主要用pcr方法，由于检测的是肿瘤和正常细胞的混合物，因此结果不够准确，而市场上迫切需要一种更为准确的检测方法的问题。
7.(二)技术方案
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肺癌c-myc基因扩增的fish检测方法，包括如下步骤：
9.s1：对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理；
10.s2：采用一组双色探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关基因扩增。
11.优选的，该试剂盒包括：
12.一组双色探针，所述一组双色探针为标记为红色的c-myc基因探针和标记为绿色的8号染色体着丝粒探针。
13.(三)有益效果
14.与现有技术相比，本发明提供了一种肺癌c-myc基因扩增的fish检测方法，具备以下有益效果：
15.本发明的肺癌相关c-myc基因扩增fish检测方法通过对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理，然后采用一组双色探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关基因的扩增；该设计周全，操作简单，特异性和敏感性高，可以快速，准确，直观地测出肺癌相关c-myc基因扩增状态，检测结果准确可靠，从而可作为医师对肺癌进行分子病理分型的参考依据，适用于大规模推广应用。
具体实施方式
16.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.实施例
18.一种肺癌c-myc基因扩增的fish检测方法，具体步骤如下：
19.肺癌组织石蜡切片预处理程序：
20.1.1将载玻片浸入2％3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,sigma chemical co.,st.louis,mo)丙酮溶液中5分钟，随后在丙酮及蒸馏水中漂洗，自然干燥载玻片。
21.1.2从福尔马林固定石蜡包埋组织中获取多块4微米切片，分别置于以上经氨基烷基硅烷(aminoalkylsiane)处理过的载玻片上。
22.1.3将组织切片置于65℃下过夜烘烤。
23.1.4将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100％乙醇中5分钟。
24.1.5将组织切片依次室温置于100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各两分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水中3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分。
25.1.6 50℃下用30％(w/v)酸性亚硫酸钠(sodium bisulfite)处理组织切片20-30分钟。
26.1.7于2
×
ssc溶液中漂洗2次，每次5分钟
27.1.8取0.4ml蛋白酶k储存液(20mg/ml)溶于40ml 20
×
ssc(ph 7.0)得到蛋白酶k工作液(200μg/ml)；将组织切片浸泡在蛋白酶k工作液中，37℃下孵育20-30分钟。
28.1.9组织切片经蛋白酶k消化后，于2
×
ssc溶液中漂洗2次，每次5分钟。
29.特别说明：为确保消化充分，可以自然干燥组织切片，将15μldapi复染剂滴加于组织切片区域，立即盖上盖玻片。暗处放置10-20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察消化情况。
30.如果消化过度，可放弃本次fish实验，选择新的组织切片重复实验，缩短蛋白酶k消化时间；
31.如果消化不充分，可将组织切片浸泡在2
×
ssc溶液中帮助脱落盖玻片，盖玻片脱落后，于2
×
ssc溶液中漂洗2次，每次5分钟，然后将组织切片置于37℃蛋白酶k工作液中继续消化5-20分钟；
32.如果消化适中，可将组织切片浸泡在2
×
ssc溶液中帮助脱落盖玻片，盖玻片脱落
后，于2
×
ssc溶液中漂洗2次，每次5分钟，继续第1.9步实验操作。
33.1.10将组织切片置于0.1m hcl中室温浸泡5-10分钟，于2
×
ssc溶液中漂洗2次，每次5分钟。
34.1.11将组织切片玻片依次置于-20℃预冷的70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水。
35.1.12将组织切片室温浸入丙酮溶液中2分钟。
36.1.13自然干燥玻片。
37.1.14加热玻片至56℃。
38.2.荧光原位杂交
39.将玻片放入杂交仪，75℃变性5分钟，40℃杂交过夜。
40.3.洗涤
41.3.1杂交完成后，每张载玻片在50％甲酰胺加4
×
ssc(ph 7.0)40℃下洗涤3次5分钟。
42.3.2 4
×
ssc(ph 7.0)40℃下洗涤3次3分钟。
43.3.3 4
×
ssc加1％tritonx溶液40℃下洗涤5分钟，最后在分散水中洗涤。
44.4.镜检
45.在荧光显微镜下观察计数，利用蓝色滤镜观察绿色信号，利用绿色滤镜观察红色信号，利用双通道观察红绿融合的黄色信号。荧光显微镜下，组织细胞分散，核内红绿信号清晰可辨、背景干净，少见自发荧光。选择背景干净，杂交信号强烈，细胞核大小均一无重叠，核边界清晰，dapi染色均一的区域拍照记录。
46.结果判断
47.计数肿瘤细胞集中，各通道信号清晰可辨，细胞核轮廓清楚无重叠的细胞30个，统计ratio值(ratio值＝30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。常见异常类型：c-myc位点扩增。
48.正常细胞：单个间期细胞中红色及绿色信号各2个。
49.c-myc基因扩增异常细胞：单个间期细胞核中红色信号大于2，且绿色信号不少于2个。
50.比值≤1.8为阴性结果，提示该样本无c-myc基因扩增。
51.比值≥2.2为阳性结果，提示样本中c-myc基因发生扩增。
52.检测结果的解释：计数30个细胞，统计比值(ratio值＝30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。比值≤1.8为阴性结果，提示该样本无c-myc基因扩增。比值≥2.2为阳性结果，提示样本中c-myc基因发生扩增。比值在1.8-2.2之间时，可以选择增加计数细胞至100个，或重做fish实验来判断最终结果。
53.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种肺癌c-myc基因扩增的fish检测方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理；s2：采用一组双色探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关基因扩增。2.用于检测肺癌相关c-myc基因扩增的一组双色fish探针，根据权利要求1所述的一种肺癌c-myc基因扩增的fish检测方法，其特征在于：该试剂盒包括：一组双色探针，所述一组双色探针为标记为红色的c-myc基因探针和标记为绿色的8号染色体着丝粒探针。

技术总结
本发明涉及肺癌检测技术领域，且公开了一种肺癌C-MYC基因扩增的FISH检测方法，包括如下步骤：S1：对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理；S2：采用一组双色探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关基因扩增；本发明的肺癌相关C-MYC基因扩增FISH检测方法通过对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理，然后采用一组双色探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关基因的扩增；该设计周全，操作简单，特异性和敏感性高，可以快速，准确，直观地测出肺癌相关C-MYC基因扩增状态，检测结果准确可靠，从而可作为医师对肺癌进行分子病理分型的参考依据，适用于大规模推广应用。适用于大规模推广应用。


技术研发人员：高军涛 高明景 邵小红 路佳怡 靳馥源 张旭 余乐 李征途
受保护的技术使用者：瀚星（苏州）医学科技有限公司
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/7/22