一种检测肉类或肉类制品中掺假的引物组、试剂盒及方法

1.本发明涉及食品安全生物检测技术领域，具体涉及一种检测肉类或肉类制品中掺假的引物组、试剂盒及方法

背景技术：
，尤其涉及在牛或羊肉类以及加工肉类中是否含有鸭源性成分、猪源性成分的检测引物组、试剂盒及方法。
背景技术
2.近年来，牛、羊肉掺假事件时有发生。多地出现了羊肉中掺入猪肉、鸭肉、狐狸肉等其他价值较低的肉类，或是直接用猪肉、鸭肉掺上羊油、香精、羊肉粉等违法案件。这些连续曝光的制售假羊肉案件，引发了社会广泛关注。牛、羊肉掺假事件的原因主要有三个方面：
3.我国畜禽肉类及肉制品的消费市场十分巨大。建国以来，我国年人均肉类消费量增长了近13倍，肉类消费需求经过了从量到质的变化，目前正处于稳步上升的趋势。
4.中国畜禽养殖量庞大交易市场分布零散，监管部门难以全部覆盖，监管力度不能达到要求。有关资料统计，我国现存的肉牛隐藏在各种小乡镇与农村的街边的交易市场约有3000余个，这类交易市场不仅大部分规模小，交易方式不规范，市场监管不到位，存在很多监管上的漏洞，让黑心商贩找到了可乘之机。
5.牛、羊肉等通过掺假可以获得大量的利润。受饲养成本增加等因素的影响，牛、羊肉等肉品市场价格逐渐提高。而国内外都不乏不法商贩受利益的驱使，将低价的肉掺入高价的牛、羊肉中出售的事件，如英国和爱尔兰爆出将马肉掺入牛肉汉堡中进行售卖的“马肉风波”；2013年江苏无锡侦破制售假羊肉案件。
6.鉴于因猪肉、鸭肉掺入到牛、羊肉出售，以次充好，扰乱市场秩序的事件频发，不仅严重侵害消费者权益，甚至威胁到消费者的身体健康。单纯依据感官判断与形态学(如色泽、气味、弹性、等感官以及肌肉纹理等)等手段判断动物源的方式局限性较大，不能完全满足目前肉制品市场，特别是已进行肉制品加工产品的快速检测需求。因此，如何利用现代分子生物学技术提高动物源检测的水平，研发一套迅速、快捷、有效的检测体系，对于保护消费者利益，维护食品安全，具有重要意义。
7.目前常见的鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分、羊源性成分检测方法主要基于蛋白的色谱法、酶联免疫分析法及以基于核酸为基础的分子生物学测定法(rt-qpcr、pcr-限制性片段长度多态性多态性和环介导等温扩增技术检测等)，其中以rt-pcr法应用最为广泛。
8.重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aidedamplification，raa)是近年开发的一种核酸扩增技术可在恒定39℃的低温条件下进行高特异性的dna扩增，并在数分钟内达到可检测的水平。raa可在同一扩增管内同时进行逆转录和扩增的两步操作，产物可通过琼脂糖凝胶电泳检测，或使用侧向流试纸条(lateral flow strip，lfs)实现核酸扩增产物的可视化，raa-lfs具有操作简单、样品量少、检测快速、成本低等优点，已在医学、食品和环境等多个领域得到广泛应用。


技术实现要素：

9.要解决的问题
10.目前对于肉类以及加工肉类中是否含有鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分的分子生物学检测方法较多，如rt-pcr、rt-qpcr等也已经成为检测的常规手段，但这些手段和方法要么高度依赖训练有素的实验室技术人员，要么需要复杂且昂贵的实验室仪器，或者检测操作过程繁琐，难以脱离实验室环境，在非实验室条件下应用。牛肉类以及加工肉类中经常有鸭源性成分或猪源性成分掺入进行造假或者在羊肉类以及加工肉类中掺入鸭源性成分或猪源性成分，但目前的检测方法因仪器设备的限制，难以在非实验室条件下对鸭源性成分和牛源性成分、猪源性成分和牛源性成分、鸭源性成分和羊源性成分、猪源性成分和羊源性成分同时进行快速、准确的鉴定，在因此亟需建立一种快速、简便、准确的双重动物源性成分可视化检测方法。建立鸭源性成分和牛源性成分、猪源性成分和牛源性成分以及鸭源性成分和羊源性成分、猪源性成分和羊源性成分的raa双重等温核酸扩增体系，并与可视化的lfs检测相结合，可满足市场监管部门和各地食品安全服务部门对牛羊肉类以及加工肉类中常见的掺假肉来源的鸭源性成分、猪源性成分现场快速检测的需求，加强食品分销渠道的监管，对保障食品安全和消费者权益也具有重要意义。
11.技术方案
12.为了解决上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种基于raa检测鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分的引物组、试剂盒及方法。
13.本发明的一个方面，本发明提供了一种检测鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分的raa检测引物组，所述引物组包括鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分正向检测引物和反向检测引物，鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分检测检测探针；其中，
14.所述鸭源性成分检测引物包括正向引物duckderived-f和反向引物duck derived-r，正向引物duckderived-f的序列为5
′‑
ccacttcttagagtactcccag-3
′
，
15.反向引物duckderived-r的序列为5
′‑
gggttgtaactgttgatagtg-3
′
；
16.所述猪源性成分检测引物包括正向引物pig derived-f和反向引物pig derived-r，正向引物pig derived-f的序列为5
′‑
ccaataagcaatgatcaacc-3
′
，
17.反向引物pig derived-r的序列为5
′‑
ctatggctactgagatgtatcc-3
′
；
18.所述牛源性成分检测引物包括正向引物bovine derived-f和反向引物bovine derived-r，正向引物bovine derived-f的序列为:5
′‑
cgtatccctacccatccttaca-3
′
，反向引物bovine derived-r的序列为:5
′‑
acccgattcagacaagtagt-3
′
。
19.所述羊源性成分检测引物包括正向引物ovine derived-f和反向引物bovine derived-r，正向引物ovine derived-f的序列为:5
′‑
caacaccacacttcacagcttgc-3
′
，反向引物ovine derived-r的序列为:5
′‑
ggatcctgctagtgtgtaa-3
′
。
20.作为优选，本发明中鸭源性成分检测探针duck derived-p，其序列为5
′‑
gcacaagct ccaacacaacaaataaagtcahcaagagccctcaacc-3
′
；猪源性成分检测探pig deri ved-p其序列为5
′‑
cgaatcacccgtatcataaattactcaatcchcaagcccattaaactt-3
′
；牛源性成分检测检测探针bovine derived-p，其序列为5
′‑
ctcttcgtgctcccaatta caccaaattchattagtaaggtcagc-3
′
；羊源性成分检测检测探针ovine derived-p，其序列为5′‑
ccatatgacttctacccctaatactcatahctagccaacatcatc-3
′
；所述鸭源性成分、猪源性成分的反向引物duck derived-r、pig derived-r的5
′
端修饰有fitc，所述检测探针duck derived-p、pig derived-p的5
′
端修饰有生物素，duck derived-p、pig de rived-p的3
′
端磷酸化修饰，h为四氢呋喃；所述牛源性成分、羊源性成分反向引物bovine derived-r、ovine derived-r的5
′
端修饰有地高辛，所述探针引物bovine derived-p、ovine derived-p的5
′
端修饰有罗丹明，bovine derived-p、ovine derived-p的3
′
端有磷酸化修饰，h为四氢呋喃。
21.本发明的一个方面，本发明提供了一种检测鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物组。
22.本发明的一个方面，本发明提供的一种检测鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分的raa检测引物组可以用于制备判断待检测的肉类以及加工肉类样品中是否含有鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分的试剂盒。
23.本发明的一个方面，本发明试剂盒还可以含有其他试剂、包括dna提取试剂、样本裂解液、缓冲液、pcr样本扩增试剂，试剂盒说明书。
24.本发明的一个方面，本发明提供的一种检测鸭源性成分和/或牛源性成分、猪源性成分和/或牛源性成分raa检测引物组可以用于判断待检测的肉类以及加工肉类中是否含有鸭源性成分、猪源性成分和牛源性成分。
25.本发明的一个方面，本发明提供的一种检测鸭源性成分和/或羊源性成分、猪源性成分和/或羊源性成分raa检测引物组可以用于判断待检测的肉类以及加工肉类中是否含有鸭源性成分、猪源性成分和羊源性成分。
26.本发明的一个方面，本发明提供的试剂盒可以用于检测待测肉类以及加工肉类中是否含有鸭源性成分和/或牛源性成分、猪源性成分和/或牛源性成分，以及鸭源性成分和/或羊源性成分、猪源性成分和/或羊源性成分。
27.本发明的一个方面，本发明提供了待测的牛或羊肉类以及加工肉类中是否含有鸭源性成分、猪源性成分的方法，包括以下步骤：
28.1)提取待检肉类以及加工肉类的总dna，或对肉类以及加工肉类样品进行快速裂解、释放核酸的处理；
29.2)以步骤1)提取的总dna或样品裂解液上清液为模板，采用引物组中的正向引物和反向引物进行raa扩增，获得扩增产物；
30.3)检测扩增产物，基于扩增产物的检测结果判断检测样品中是否含有鸭源性成分、猪源性成分、羊源性成分和牛源性成分。
31.作为优选，本发明中，若扩增产物中含有287bp的dna片段，则待测样本中含有鸭源性成分，若扩增产物中不含有287bp的dna片段，则待测样本中不含有鸭源性成分；若扩增产物中含有274bp的dna片段，则待测样本中含有猪源性成分，若扩增产物中不含有274bp的dna片段，则待测样本中不含有猪源性成分；若扩增产物中含有351bp的dna片段，则待测样本中含有牛源性成分，若扩增产物中不含有351bp的dna片段，则待测样本中不含有牛源性成分；若扩增产物中含有397bp的dna片段，则待测样本中含有羊源性成分，若扩增产物中不含有397bp的dna片段，则待测样本中不含有羊源性成分。
32.本发明的一个方面，本发明提供了一种检测待测样本中是否含有鸭源性成分、猪
源性成分、羊源性成分和牛源性成分的方法，包括：
33.检测待测肉类以及加工肉类的核酸裂解液或总dna扩增产物中是否含有特异dna片段，若含有特异dna片段，则待测样本含有鸭源性成分、猪源性成分、羊源性成分和牛源性成分，若不含有特异dna片段，则待测样本不含有鸭源性成分、猪源性成分、羊源性成分和牛源性成分；其中，所述特异dna片段为本发明所述的正向引物和反向引物的靶序列。
34.本发明的一个方面，本发明提供了一种基于raa扩增方式检测鸭源性成分和/或牛源性成分、猪源性成分和/或牛源性成分，以及鸭源性成分和/或羊源性成分、猪源性成分和/或羊源性成分的方法。
35.作为优选，所述方法包括以下步骤：
36.1)按照核酸释放剂提供的方法裂解肉类样品；或者按照dna提取试剂说明书操作，提取总dna，溶于te溶液或纯水中；
37.2)以步骤1)提取的总dna或肉类以及加工肉类裂解液为模板，采用引物组中的正向引物和反向引物进行raa扩增，若扩增产物中含有287bp的dna片段，则待测样本中含有鸭源性成分，若扩增产物中不含有287bp的dna片段，则待测样本中不含有鸭源性成分；若扩增产物中含有274bp的dna片段，则待测样本中含有猪源性成分，若扩增产物中不含有274bp的dna片段，则待测样本中不含有猪源性成分；若扩增产物中含有351bp的dna片段，则待测样本中含有牛源性成分，若扩增产物中不含有351bp的dna片段，则待测样本中不含有牛源性成分；若扩增产物中含有397bp的dna片段，则待测样本中含有羊源性成分，若扩增产物中不含有397bp的dna片段，则待测样本中不含有羊源性成分。
38.正向引物duckderived
‑‑
f的序列为5
′‑
ccacttcttagagtactcccag-3
′
，
39.反向引物duckderived
‑‑
r的序列为5
′‑
gggttgtaactgttgatagtg-3
′
；
40.正向引物pig derived-f的序列为5
′‑
ccaataagcaatgatcaacc-3
′
，
41.反向引物pig derived-r的序列为5
′‑
ctatggctactgagatgtatcc-3
′
；
42.正向引物bovine derived-f的序列为:5
′‑
cgtatccctacccatccttaca-3
′
，
43.反向引物bovine derived-r的序列为:5
′‑
acccgattcagacaagtagt-3
′
。
44.正向引物ovine derived-f的序列为:5
′‑
caacaccacacttcacagcttgc-3
′
，
45.反向引物ovine derived-r的序列为:5
′‑
ggatcctgctagtgtgtaa-3
′
。
46.作为优选，所述检测鸭源性成分和/或牛源性成分raa扩增的反应体系如下：
47.成分体积(μl)肉类样品裂解液或总dna溶液2基础缓冲液29.4duck derived-f(5μm)0.88duck derived-r(5μm)1.26bovine derived-f(5μm)1.17bovine derived-r(5μm)1.68ddh2o至总体系为47.5
48.作为优选，所述检测猪源性成分和/或牛源性成分raa扩增的反应体系如下：
49.成分体积(μl)肉类样品裂解液或总dna溶液2
基础缓冲液29.4pig derived-f(5μm)0.73pig derived-r(5μm)1.05bovine derived-f(5μm)0.44bovine derived-r(5μm)0.63ddh2o至总体系为47.5
50.作为优选，所述检测鸭源性成分和/或羊源性成分raa扩增的反应体系如下：
51.成分体积(μl)肉类样品裂解液或总dna溶液2基础缓冲液29.4duck derived-f(5μm)0.58duck derived-r(5μm)0.84ovine derived-f(5μm)1.03ovine derived-r(5μm)1.48ddh2o至总体系为47.5
52.作为优选，所述检测猪源性成分和/或羊源性成分raa扩增的反应体系如下：
53.成分体积(μl)肉类样品裂解液或总dna溶液2基础缓冲液29.4pig derived-f(5μm)0.51pig derived-r(5μm)0.73ovine derived-f(5μm)0.88ovine derived-r(5μm)1.26ddh2o至总体系为47.5
54.作为优选，所述raa扩增的反应条件设置如下：反应液配制完成后，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀；将0.2ml的eppendorf管放入带有热盖功能的pcr仪上，39℃，保温25min。
55.作为优选，扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，鸭源性成分raa扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测靶序列初始扩增模板最低拷贝数为101个拷贝；猪源性成分raa扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测靶序列初始扩增模板最低拷贝数为101个拷贝；牛源性成分raa扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测靶序列初始扩增模板最低拷贝数为101个拷贝。
56.其中，raa扩增产物的检测过程为：raa反应结束后，将反应管取出。每个反应管中加入100μl酚/氯仿(1:1)，充分振荡均匀，12000rpm离心10min(该步骤可使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀)。取10μl上清液与2μl 6
×
loading buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200v电泳15min；待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳；eb染色5min，紫外灯下观察及拍照。
57.本发明的一个方面，本发明提供了一种检测待测样本中是否含有鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分的方法。
58.作为优选，所述方法包括：检测待测样本的裂解液或核酸样品的扩增产物中是否
含有特异dna片段，若含有特异dna片段，则待测样本中含有鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分，若不含有特异dna片段，则待测样本中不含有鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分；其中，所述特异dna片段为待测样本的总dna中本发明所述的引物组的靶序列。
59.本发明的一个方面，本发明提供了一种基于raa-侧流层析技术检测鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分的方法。
60.作为优选，所述方法包括以下步骤：
61.1)按照核酸释放剂提供的方法裂解肉类样品；或者按照dna提取试剂说明书操作，提取总dna，溶于te溶液或纯水中；
62.2)以步骤1)获得的裂解液或提取的总dna或为模板，采用引物组进行raa扩增；
63.正向引物duck derived-f的序列为5
′‑
ccacttcttagagtactcccag-3
′
，
64.反向引物duck derived-r的序列为5
′‑
gggttgtaactgttgatagtg-3
′
；
65.正向引物pig derived-f的序列为5
′‑
ccaataagcaatgatcaacc-3
′
，
66.反向引物pig derived-r的序列为5
′‑
ctatggctactgagatgtatcc-3
′
；
67.正向引物bovine derived-f的序列为:5
′‑
cgtatccctacccatccttaca-3
′
，
68.反向引物bovine derived-r的序列为:5
′‑
acccgattcagacaagtagt-3
′
。
69.正向引物ovine derived-f的序列为:5
′‑
caacaccacacttcacagcttgc-3
′
，
70.反向引物ovine derived-r的序列为:5
′‑
ggatcctgctagtgtgtaa-3
′
。
71.所述鸭源性成分检测探针duck derived-p，其序列为5
′‑
gcacaagctccaacacaac aaataaagtcahcaagagccctcaacc-3
′
；所述猪源性成分检测探针pig derived-p，其序列为5
′‑
cgaatcacccgtatcataaattactcaatcchcaagcccattaaactt-3
′
；所述牛源性成分检测探针bovine derived-p，其序列为5
′‑
ctcttcgtgctcccaattacaccaaa ttchattagtaaggtcagc-3
′
；所述羊源性成分检测探针ovine derived-p，其序列为5
′‑
ccatatgacttctacccctaatactcatahctagccaacatcatc-3
′
；所述鸭源性成分、猪源性成分的反向引物duck derived-r、pig derived-r的5
′
端修饰有fitc，所述检测探针duck derived-p、pig derived-p的5
′
端修饰有生物素，duck derived-p、pig derived-p的3
′
端磷酸化修饰，h为四氢呋喃；所述牛源性成分、羊源性成分反向引物bovine derived-r、ovine derived-r的5
′
端修饰有地高辛，所述探针引物bovine derived-p、ovine derived-p的5
′
端修饰有罗丹明，bovine derived-r、ovine derived-p的3
′
端有磷酸化修饰，h为四氢呋喃。
72.作为优选，所述检测鸭源性成分和/或牛源性成分raa扩增的反应体系如下：
73.成分体积(μl)肉类以及加工肉类样品裂解液或dna溶液2基础缓冲液29.4duck derived-f(5μm)0.88duck derived-r(5μm)1.26duck derived-p(1μm)1.26bovine derived-f(5μm)1.17bovine derived-r(5μm)1.68bovine derived-p(1μm)1.68
ddh2oupto47.5
74.作为优选，所述检测猪源性成分和/或牛源性成分raa扩增的反应体系如下
75.成分体积(μl)肉类以及加工肉类样品裂解液或dna溶液2基础缓冲液29.4pig derived-f(5μm)0.73pig derived-r(5μm)1.05pig derived-p(1μm)1.05bovine derived-f(5μm)0.44bovine derived-r(5μm)0.63bovine derived-p(1μm)0.63ddh2oupto47.5
76.作为优选，所述检测鸭源性成分和/或羊源性成分raa扩增的反应体系如下：：
77.成分体积(μl)肉类以及加工肉类样品裂解液或dna溶液2基础缓冲液29.4duck derived-f(5μm)0.58duck derived-r(5μm)0.84duck derived-p(1μm)0.84ovine derived-f(5μm)1.03ovine derived-r(5μm)1.48ovine derived-p(1μm)1.48ddh2oupto47.5
78.作为优选，所述检测猪源性成分和/或羊源性成分raa扩增的反应体系如下
79.成分体积(μl)肉类以及加工肉类样品裂解液或dna溶液2基础缓冲液29.4pig derived-f(5μm)0.51pig derived-r(5μm)0.73pig derived-p(1μm)0.73ovine derived-f(5μm)0.88ovine derived-r(5μm)1.26ovine derived-p(1μm)1.26ddh2oupto47.5
80.作为优选，所述raa扩增的反应条件设置如下：反应液配制完成后，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀；将0.2ml的eppendorf管放入带有热盖功能的pcr仪上，39℃，保温16min。
81.3)应用侧流层析试纸条对鸭源性成分和/或牛源性成分raa扩增产物进行检测，若
试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有鸭源性成分和牛源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有牛源性成分，但不含有鸭源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有鸭源性成分，但不含有牛源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有牛源性成分和鸭源性成分；若试纸条质控区和两个检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试。
82.检测的具体过程可以为：将装有50μlraa扩增产物的eppendorf管管盖打开，取2.5μl扩增产物至一新的1.5ml的eppendorf管，稀释20倍。将一根新的核酸侧向层析试纸条结合垫端直接插入装有稀释产物的eppendorf管管中，液面不得超过样品垫的浸没上限标记。待判读区全部浸润后，将试纸平放1min，观察显色结果，并在10min内记录。每个测试样品至少出现一条质控线，有或无检测线。若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有鸭源性成分和牛源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有牛源性成分，但不含有鸭源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有鸭源性成分，但不含有牛源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有牛源性成分和鸭源性成分；若试纸条质控区和两个检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试。
83.4)应用侧流层析试纸条对猪源性成分和/或牛源性成分raa扩增产物进行检测，若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有猪源性成分和牛源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有牛源性成分，但不含有猪源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有猪源性成分，但不含有牛源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有牛源性成分和猪源性成分；若试纸条质控区和两个检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试。
84.检测的具体过程可以为：将装有50μlraa扩增产物的eppendorf管管盖打开，取2.5μl扩增产物至一新的1.5ml的eppendorf管，稀释20倍。将一根新的核酸侧向层析试纸条结合垫端直接插入装有稀释产物的eppendorf管管中，液面不得超过样品垫的浸没上限标记。待判读区全部浸润后，将试纸平放1min，观察显色结果，并在10min内记录。每个测试样品至少出现一条质控线，有或无检测线。若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有猪源性成分和牛源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有牛源性成分，但不含有猪源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有猪源性成分，但不含有牛源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位
于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有牛源性成分和猪源性成分；若试纸条质控区和两个检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试。
85.5)应用侧流层析试纸条对鸭源性成分和/或羊源性成分raa扩增产物进行检测，若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有鸭源性成分和羊源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有羊源性成分，但不含有鸭源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有鸭源性成分，但不含有羊源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有羊源性成分和鸭源性成分；若试纸条质控区和两个检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试。
86.检测的具体过程可以为：将装有50μlraa扩增产物的eppendorf管管盖打开，取2.5μl扩增产物至一新的1.5ml的eppendorf管，稀释20倍。将一根新的核酸侧向层析试纸条结合垫端直接插入装有稀释产物的eppendorf管管中，液面不得超过样品垫的浸没上限标记。待判读区全部浸润后，将试纸平放1min，观察显色结果，并在10min内记录。每个测试样品至少出现一条质控线，有或无检测线。若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有鸭源性成分和羊源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有羊源性成分，但不含有鸭源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有鸭源性成分，但不含有羊源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有羊源性成分和鸭源性成分；若试纸条质控区和两个检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试。
87.6)应用侧流层析试纸条对猪源性成分和/或羊源性成分raa扩增产物进行检测，若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有猪源性成分和羊源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有羊源性成分，但不含有猪源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有猪源性成分，但不含有羊源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有羊源性成分和猪源性成分；若试纸条质控区和检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试。
88.检测的具体过程可以为：将装有50μlraa扩增产物的eppendorf管管盖打开，取2.5μl扩增产物至一新的1.5ml的eppendorf管，稀释20倍。将一根新的核酸侧向层析试纸条结合垫端直接插入装有稀释产物的eppendorf管管中，液面不得超过样品垫的浸没上限标记。待判读区全部浸润后，将试纸平放1min，观察显色结果，并在10min内记录。每个测试样品至少出现一条质控线，有或无检测线。若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有猪源性成分和羊源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有羊源性
成分，但不含有猪源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有猪源性成分，但不含有羊源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有羊源性成分和猪源性成分；若试纸条质控区和检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试。
89.其中，raa-侧流层析技术每个反应可检测出的鸭源性成分初始扩增模板最低拷贝数为32个拷贝，猪源性成分初始扩增模板最低拷贝数为22个拷贝，牛源性成分靶序列初始扩增模板最低拷贝数为44个拷贝，羊源性成分靶序列初始扩增模板最低拷贝数为36个拷贝。
90.有益效果
91.本发明提供了一种用于检测鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分、羊源性成分的特异性引物组，建立了牛羊肉中掺假鸭源性成分或猪源性成分的双重快速检测方法。本发明中所设计的引物可以有效扩增靶基因，具有较高的特异性和灵敏性，与其他物种无交叉反应，可用于鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分、羊源性成分的现场快速检测，对于食品安全的监管具有重要意义。
附图说明
92.图1是以鸭源性成分扩增引物组1～4不同物种样品进行raa扩增的情况；
93.图2是以猪源性成分扩增引物组5～8不同物种样品进行raa扩增的情况；
94.图3是以牛源性成分扩增引物组9～12不同物种样品进行raa扩增的情况；
95.图4是以羊源性成分扩增引物组13～16不同物种样品进行raa扩增的情况；
96.图5中a为牛源性成分扩增引物组bovine derived-f和bovine derived-r的raa扩增灵敏度检测；图5中b为羊源性成分扩增引物组ovine derived-f和ovine derived-r的raa扩增灵敏度检测；图5中c为鸭源性成分扩增引物组duck derived-f和duck derived-r的raa扩增灵敏度检测；图5中d为猪源性成分扩增引物组pig derived-f和pig derived-r的raa扩增灵敏度检测；50μl raa扩增初始模板拷贝数从106拷贝到100拷贝依次递减；其中，m为plus dna标记；
“‑”
为ddh2o替代同体积质粒的阴性对照。
97.图6单靶标一次性核酸检测试纸条(jy0201)结构及检测结果示意图；
98.图7是使用鸭源性成分检测引物组a、引物组b、引物组c、引物组d进行阳性质粒及阴性对照的raa-lfs检测结果；
99.图8是使用猪源性成分检测引物组e、引物组f、引物组g、引物组h进行阳性质粒及阴性对照的raa-lfs检测结果；
100.图9是使用牛源性成分检测引物组i、引物组j、引物组k、引物组l进行阳性质粒及阴性对照的raa-lfs检测结果；
101.图10是使用鸭源性成分检测引物组m、引物组n、引物组o、引物组p进行阳性质粒及阴性对照的raa-lfs检测结果；
102.图11鸭源性成分检测引物组araa-lfs的检测灵敏度；
103.图12鸭源性成分检测引物组araa扩增体系内下游引物的添加量对检测灵敏度的影响；
104.图13鸭源性成分检测引物组araa扩增体系内醋酸镁的添加量对检测灵敏度的影响；
105.图14猪源性成分检测引物组h raa-lfs的检测灵敏度；
106.图15牛源性成分检测引物组i raa-lfs的检测灵敏度；
107.图16羊源性成分检测引物组m raa-lfs的检测灵敏度；
108.图17鸭源性成分检测引物a、猪源性成分检测引物组h、牛源性成分检测引物组i和羊源性成分检测引物组m的raa-lfs检测特异性评价
109.图18双靶标一次性核酸检测试纸条(jy0209)结构及检测结果示意图；
110.图19以质粒为模板进行鸭源性成分与牛源性成分检测引物组双重raa-lfs检测结果；
111.图20以质粒为模板进行猪源性成分与牛源性成分检测引物组双重raa-lfs检测结果；
112.图21以质粒为模板进行鸭源性成分与羊源性成分检测引物组双重raa-lfs检测结果；
113.图22以质粒为模板进行猪源性成分与羊源性成分检测引物组双重raa-lfs检测结果；
114.图23鸭源性成分检测引物组、猪源性成分检测引物组、牛源性成分检测引物组、羊源性成分检测引物组qpcr熔解曲线分析；
115.图24鸭源性成分检测引物、猪源性成分检测引物组、牛源性成分检测引物组、羊源性成分检测引物组qpcr对应梯度稀释质粒绝对定量扩增曲线分析；
116.图25鸭源性成分与牛源性成分检测引物组双重raa-lfs灵敏度检测结果；
117.图26猪源性成分与牛源性成分检测引物组双重raa-lfs灵敏度检测结果；
118.图27鸭源性成分与羊源性成分检测引物组双重raa-lfs灵敏度检测结果；
119.图28猪源性成分与羊源性成分检测引物组双重raa-lfs灵敏度检测结果；
120.图29鸭源性成分与牛源性成分检测引物组双重raa-lfs反应引物优化检测结果；
121.图30猪源性成分与牛源性成分检测引物组双重raa-lfs反应引物优化检测结果；
122.图31鸭源性成分与羊源性成分检测引物组双重raa-lfs反应引物优化检测结果；
123.图32猪源性成分与羊源性成分检测引物组双重raa-lfs反应引物优化检测结果；
124.图33简单裂解后的鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉分别进行动物源性成分双重raa-lfs检测情况；
125.图34自制不同比例的动物源性掺假肉随机取样的raa-lfs快速检测结果。
具体实施方式
126.下面结合附图对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。
127.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方面。下述实施例中所述的实验材料，如无特殊说明，均未自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
128.本发明所涉及的肉类样本来源：
129.本发明涉及的肉类以及加工肉类均购买于宁波各大商超中，相应的总dna均保存
于宁波大学省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室中。
130.本发明所涉及的样品制备方法为：
131.以肉类以及加工肉类作为实验对象，对于传统dna方法的提取，使用通用型基因组dna提取试剂盒(新景生物，杭州)，根据试剂的说明书操作，从鸭肉、猪肉、牛肉羊肉样品中提取总dna。
132.为了评估所使用快速裂解免dna提取方法的raa-lfs体系是否可用肉类以及加工肉类中鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分、羊源性成分的快速检测，将肉类以及加工肉类样品放入1.5ml eppendorf管中，加入100μl酷闪核酸释放剂(tiosbio，北京宝盈同汇生物技术有限公司)后，用眼科剪将待检样品剪碎后，释放核酸，离心，获得相应样品的裂解液。以1μl样品裂解液或其稀释液作为raa的扩增模板。样品裂解液可立即实验，或于-70℃储存3个月以上。
133.核酸侧向层析试纸条来源于北京宝盈同汇生物技术有限公司。
134.实验例1：鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分检测的引物设计及筛选
135.本发明小组经过大量序列分析，以鸭线粒体、猪线粒体、牛线粒体和羊线粒体基因组序列为靶标，分析靶基因序列特点后，应用primer premier 5.0软件设计种属特异性扩增引物。引物设计遵循以下原则。
136.①
扩增引物长度约20～30bp，不同引物的退火温度尽可能一致或相似；
②
扩增产物长度约200～500bp，具物种特异性。
137.使用美国国家生物技术信息中心(ncbi)的blast功能对引物扩增区段序列进行比对，完成引物扩增特异性的初步鉴定。通过鉴定的引物交由通用生物系统(安徽)有限公司合成，纯度级别为hplc。引物具体序列如表1所示。
138.正向引物duck derived-f的序列为5
′‑
ccacttcttagagtactcccag-3
′
，
139.反向引物duck derived-r的序列为5
′‑
gggttgtaactgttgatagtg-3
′
；
140.正向引物pig derived-f的序列为5
′‑
ccaataagcaatgatcaacc-3
′
，
141.反向引物pig derived-r的序列为5
′‑
ctatggctactgagatgtatcc-3
′
；
142.正向引物bovine derived-f的序列为:5
′‑
cgtatccctacccatccttaca-3
′
，
143.反向引物bovine derived-r的序列为:5
′‑
acccgattcagacaagtagt-3
′
。
144.正向引物ovine derived-f的序列为:5
′‑
caacaccacacttcacagcttgc-3
′
，
145.反向引物ovine derived-r的序列为:5
′‑
ggatcctgctagtgtgtaa-3
′
。
146.鸭源性成分检测探针duck derived-p，其序列为5
′‑
gcacaagctccaacacaacaaat aaagtcahcaagagccctcaacc-3
′
；pig derived-p其序列为5
′‑
cgaatcacccgtatca taaattactcaatcchcaagcccattaaactt-3
′
所述牛源性成分检测检测探针bovine der ived-p，其序列为5
′‑
ctcttcgtgctcccaattacaccaaattchattagtaaggtcagc-3
′
；所述羊源性成分检测检测探针ovine derived-p，其序列为5
′‑
ccatatgacttctacccctaa tactcatahctagccaacatcatc-3
′
；
147.表1鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分raa基础款扩增用引物
[0148][0149][0150]
使用raa核酸扩增试剂盒(基础款jy0203)，以肉类以及加工肉类中总dna或肉类以及加工肉类样品裂解液作为模板，分别进行组1-～4、组5-～8和组9-～12的正向引物和反向引物的raa扩增，扩增体系(单个样品/反应)如下：
[0151]
成分体积(μl)肉类以及加工肉类样品裂解液或dna溶液2基础缓冲液29.4正向引物(10μm)2.1反向引物(10μm)2.1ddh2o至总体系为47.5
[0152]
反应液配制完成后，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀；将0.2ml的eppendorf管放入带有热盖功能的pcr仪上，39℃，保温30min。
[0153]
raa反应结束后，将反应管取出。每个反应管中加入100μl酚/氯仿(1:1)，充分振荡
均匀，12000rpm离心10min(该步骤可使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀)。取10μl上清液与2μl 6
×
loading buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200v电泳15min；待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳；eb染色5min，紫外灯下观察及拍照。
[0154]
如图1-4所示，添加2μl总dna溶液或样品裂解液的前提下，使用鸭源性成分扩增引物组1～4分别在牛、羊、鸭、猪、鸡5个物种的总dna中进行raa扩增，其中鸭源性成分扩增引物组2在鸭肉的总dna中的扩增产物电泳条带清晰、明亮，无杂带，扩增条带大小与预期一致，而其他肉类的总dna中没有明显的扩增产物；使用猪源性成分扩增引物组5～8分别在不同物种的总dna中进行raa扩增，猪源性成分扩增引物组5在猪肉的总dna中的扩增产物电泳条带清晰、明亮，无杂带，扩增条带大小与预期一致，而其他肉类的总dna中没有明显的扩增产物；使用牛源性成分扩增引物组9～12分别在不同物种的总dna中进行raa扩增，引物组11在牛肉的总dna中的扩增产物电泳条带清晰、明亮，无杂带，扩增条带大小与预期一致，而其他肉类的总dna中没有明显的扩增产物，可用于检测牛源性成分。使用羊源性成分扩增引物组13～16分别在不同物种的总dna中进行raa扩增，引物组13在羊肉的总dna中的扩增产物电泳条带清晰、明亮，无杂带，扩增条带大小与预期一致，而其他肉类的总dna中没有明显的扩增产物，可用于检测羊源性成分。
[0155]
各引物对最佳引物组的扩增产物均克隆至t载体，经测序后，确定为目的序列。确定将各引物对的最佳引物组合分别为鸭源性成分扩增引物组2、猪源性成分扩增引物组5、牛源性成分扩增引物组11和羊源性成分扩增引物组13，并将鸭源性成分扩增引物组2的上、下游引物重新命名为duck derived-f和duck derived-r；猪源性成分扩增引物组5的上、下游引物重新命名为pig derived-f和pig derived-r；牛源性成分扩增引物组11的上、下游引物重新命名为bovine derived-f和bovine derived-r；羊源性成分扩增引物组13的上、下游引物重新命名为ovine derived-f和ovine derived-r。
[0156]
实验例2：鸭源性成分、猪源性成分与、牛源性成分和羊源性成分检验样品比对盘制备和组成
[0157]
鸭源性成分扩增引物组duck derived-f和duck derived-r阳性扩增产物、猪源性成分扩增引物组pig derived-f和pig derived-r阳性扩增产物、牛源性成分检测引物组bovine derived-f和bovine derived-r阳性扩增产物，羊源性成分检测引物组ovine derived-f和ovine derived-r扩增产物克隆、测序正确的质粒，分别转化摇菌过夜后进行质粒抽提，以紫外分光光度计测量重组质粒od260、od280及od260/od280值，并重复3次，确定质粒dna浓度和纯度。
[0158]
按照下面的公式获得质粒的拷贝数：
[0159]
拷贝数＝质粒浓度
×
6.02
×
10
23
/(660
×
质粒总长度)
[0160]
计算拷贝数并稀释至1
×
108拷贝/μl，
–
20℃保存备用。将已定值的重组质粒稀释至1
×
106拷贝/μl，再10倍系列稀释，获得1
×
100拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl和1
×
106拷贝/μl质粒稀释液为后续扩增模板。
[0161]
实验例3：用于鸭源性成分、猪源性成分与、牛源性成分和羊源性成分的引物灵敏度的检测
[0162]
为了进一步检测鸭源性成分扩增引物组duck derived-f和duck derived-r、猪源
性成分扩增引物组pig derived-f和pig derived-r、牛源性成分检测引物组bovine derived-f和bovine derived-r和羊源性成分检测引物组ovine derived-f和ovine derived-r的灵敏性，将各自对应扩增产物质粒dna的10倍系列稀释液(每微升106、105、104、103、102、101、100拷贝)用作raa的模板，使用ddh2o用作阴性对照模板。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳比较同一模板分别进行不同引物raa的扩增情况。
[0163]
从牛源性成分扩增引物组(图5中a)和羊源性成分扩增引物组(图5中b)、鸭源性成分扩增引物组(图5中c)、猪源性成分扩增引物组(图5中d)raa扩增灵敏度实验结果可知，鸭源性成分检测引物组duck derived-f和duck derived-r、猪源性成分检测引物组pig derived-f和pig derived-r、牛源性成分检测引物组bovine derived-f和bovine derived-r和羊源性成分检测引物组ovine derived-f和ovine derived-r raa扩增均可检出低至101个拷贝的鸭源性成分质粒。
[0164]
实验例4：鸭源性成分、猪源性成分与、牛源性成分和羊源性成分raa-lfs检测
[0165]
针对实施例1中的引物组1～8扩增区段，应用primer premier 5.0软件设计种属特异性的探针序列，探针序列位于扩增引物中间区段，经四氢呋喃修饰。引物设计遵循原则为：探针长度约为30～45bp；
②
探针序列具有物种特异性。
[0166]
使用美国国家生物技术信息中心(ncbi)的blast功能对引物扩增区段序列进行比对，完成引物扩增特异性的初步鉴定。通过鉴定的引物交由通用生物系统(安徽)有限公司合成，纯度级别为hplc。引物具体序列、探针及扩增下游引物标记情况如下表2所示。
[0167]
表2鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分raa试纸条款扩增用引物
[0168]
[0169]
[0170][0171]
以各引物组上、下游引物对应扩增产物1
×
106拷贝/μl重组质粒溶液为模板，使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行引物组a～引物组p的raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0172]
组分用量(μl)基础缓冲液29.4上游引物(10μm)2.1探针引物(10μm)0.6下游引物(10μm)2.11
×
106拷贝/μl重组质粒溶液2以水补足体积至47.5
[0173]
加样顺序为阴性质控样本(1
×
106拷贝/μl重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)、1
×
106拷贝/μl重组质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0174]
将反应管放置在39℃条件下反应16min。raa反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20～50倍。
[0175]
将单靶标一次性核酸检测试纸条(jy0201)结构示意图如图6所示，将试纸条的浸液区端(标示蓝色箭头向上)插入eppendorf管，液面不得超过浸液区的max指示线，待判读区全部浸润(约需30～60sec)，将试纸平放1min，等待红色条带出现。根据试纸条显色情况直接读取检测结果。10min内观察结果，10min后判读无效。
[0176]
如图7-图10所示，分别使用鸭源性成分检测引物组b、c、d，猪源性成分检测引物组e、f、g；牛源性成分检测引物组j、k、l，和羊源性成分检测引物组n、o、p，进行raa扩增，上述检测引物组阴性对照扩增产物的raa扩增产物稀释20倍后，试纸条检测结果为阳性，不可用于后续raa核酸扩增试纸条灵敏度检测；而鸭源性成分检测引物组a，猪源性成分检测引物组h，牛源性成分检测引物组i，羊源性成分检测引物组o的阴性对照扩增产物稀释20倍后，试纸条检测结果均为阴性，1
×
106拷贝/μl重组质粒溶液raa检测结果均为阳性，可用于后续raa核酸扩增试纸条灵敏度检测。
[0177]
确定鸭源性成分检测引物组a、猪源性成分检测引物组h、牛源性成分检测引物组i和羊源性成分检测引物组m为动物源性检测引物组，并将鸭源性成分检测引物组a中的探针引物duck derived-p1重新命名为duck derived-p，猪源性成分检测引物组h中的探针引物pig derived-p4重新命名为pig derived-p，牛源性成分检测引物组i中的探针引物bovine derived-p1重新命名为bovine derived-p，羊源性成分检测引物组m中的探针引物ovine derived-p1重新命名为ovine derived-p。
[0178]
实验例5：鸭源性成分检测引物组raa-lfs的检测灵敏度
[0179]
以鸭源性成分检测引物组a对相应扩增片段的阳性质粒为模板，使用实验例4中的raa扩增体系，以1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl和1
×
100拷贝/μl质粒稀释液为模板，分别进行raa扩增，扩增产物经20倍稀释后进行试纸条检测，确定不同引物组合的检测灵敏度。
[0180]
鸭源性成分检测引物组araa-lfs灵敏度检测结果如图11所示，鸭源性成分raa-lfs的最低检测阈值为103个拷贝。
[0181]
实施例6：利用鸭源性成分检测引物组a优化raalfs检测体系
[0182]
实验中使用的探针具有以下特点：
①
设计方向为正向，即与上游引物为同一方向；
②
长度在46～52nt；
③3′
端经磷酸化修饰，以抑制dna链延伸；
④
序列内部添加了切割位点，在探针与模板dna结合时被exo酶切割，并起始dna链的延伸；
⑥5′
端经生物素修饰，探针与下游(经fitc修饰的)引物的双链扩增产物可被核酸试纸条检测到。
[0183]
试纸条检测产物为经exo酶切割后的探针和下游引物(经fitc修饰)的双链扩增产物，因此理论上增加下游引物的添加量有助于提高raa核酸试纸条检测的灵敏度。但下游引物添加过量时，也会导致下游引物与探针引物二聚体的形成几率，并导致检测结果的假阳性。
[0184]
使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行raa反应体系的配制(单个样品/反应)，下游引物添加量的调整如表3。每组体系均对102拷贝/μl样品盘、101拷贝/μl样品盘、100拷贝/μl样品盘，阴性质控样本进行测试。样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注
意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0185]
将反应管放置在39℃条件下反应16min。raa反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20倍，进行试纸条检测，确定最适添加量。
[0186]
表3鸭源性成分扩增引物组araa扩增体系内下游引物添加量的调整
[0187][0188]
结果如图12显示，以102拷贝/μl样品盘、101拷贝/μl样品盘、100拷贝/μl样品盘，阴性质控样本为模板，模板添加体积相同的条件下，调整下游引物的添加量，当50μl扩增体系下游引物(10μm)添加量调整为3μl时，检测灵敏度表现最佳，不仅可以检测到101拷贝的样品，同时阴性质控样本为阴性。
[0189]
扩增体系中添加mgac2可启动raa扩增，且扩增体系中mgac2的添加量直接影响扩增的效率和产物得率。理论上，增加mgac2的添加量有助于提高扩增产物得率，并增加raa核酸试纸条检测的灵敏度。但mgac2添加过量时，也会导致阴性样本检测结果的假阳性。
[0190]
使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行raa反应体系的配制(单个样品/反应)，mgac2添加量的调整体系如下。
[0191]
表4鸭源性成分扩增引物组araa扩增体系内mgac2添加量的调整
[0192][0193]
每组体系均对102拷贝/μl样品盘、101拷贝/μl样品盘、100拷贝/μl样品盘，阴性质控样本进行测试。样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入表4中不同体积的280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0194]
将反应管放置在39℃条件下反应16min。raa反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20倍，进行试纸条检测，确定最适添加量。
[0195]
实验结果如图13所示，以102拷贝/μl样品盘、101拷贝/μl样品盘、100拷贝/μl样品盘，阴性质控样本为模板，模板添加体积相同的条件下，调整mgac2的添加量，当mgac2调整为2.5μl与2.8μl时，检测灵敏度表现相同，不仅可以检测到101拷贝/μl的样品，同时阴性质控样本为阴性。根据表4中调整体系2、调整体系3中的结果可知，mgac2添加过量会导致阴性质控样本出现假阳性。鉴于每50μl扩增体系mgac2添加量为2.5μl与2.8μl检测灵敏度表现相同，最终确定mgac2的最适添加量为2.5μl，以避免阴性样本出现假阳性。
[0196]
实施例7：猪源性成分、牛源性成分和羊源成分检测引物组raa-lfs检测灵敏度
[0197]
猪源性成分、牛源性成分、羊源性成分raa扩增使用实施例6所述的raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)扩增体系和试纸条检测方式进行raa反应体系的配制，完成不同引物组合1
×
106拷贝/μl、1
×
105拷贝/μl、1
×
104拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
101拷贝/μl和1
×
100拷贝/μl质粒稀释液的raa扩增，扩增产物经20倍稀释后进行试纸条检测。参见图14-图16，猪源性成分检测引物组h、牛源性成分检测引物组i和羊源性成分检测引物组m经raa扩增后，均可检出低至101个拷贝的靶基因。
[0198]
实施例8：用于鸭源性成分、猪源性成分与、牛源性成分和羊源性成分检测引物的特异性评价
[0199]
本实施例以经pcr验证，无外源污染的牛肉、羊肉、鸭肉、猪肉和鸡肉作为实验对象，提取总dna作为扩增模板。使用实施例4所筛选出的引物鸭源性成分、猪源性成分检测引物组、牛源性成分检测引物组，使用实施例6所述的raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)扩增体系和试纸条检测方式进行raa反应体系的配制，分别对总dna进行raa扩增，
完成raa扩增，扩增产物经20倍稀释后进行试纸条检测，确定不同引物组合检测的特异性。
[0200]
鸭源性成分检测引物组a、猪源性成分检测引物组h、牛源性成分检测引物组组i和羊源性成分检测引物组m的raa-lfs引物特异性评价结果如图17所示，可以看出，鸭源性成分检测引物组、猪源性成分检测引物组、牛源性成分和羊源性成分检测引物组扩增产物的lfs检测结果均仅在对应总dna中显示阳性，未发现与其他物种dna发生交叉反应，表明所筛选的各引物对特异性极佳，适于进行鸭源性成分、猪源性成分与、牛源性成分和羊源性成分的raa-lfs检测；
[0201]
实验例9：鸭源性成分、猪源性成分与、牛源性成分和羊源性成分不同引物组双重raa-lfs检测体系的建立
[0202]
将实施例7中的鸭源性成分a、猪源性成分检测引物组h、牛源性成分检测引物组i、羊源性成分检测引物组m配置为mix，以利于raa双重扩增系内的引物添加量优化，引物mix各组分如下：
[0203][0204][0205]
以各引物组上、下游引物扩增产物的1
×
106拷贝/μl的质粒稀释液为模板，使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行鸭源性成分和牛源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0206][0207]
设置阴性质控样本(1
×
106拷贝/μl重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)，加样顺序为阴性质控样本，1
×
106拷贝/μl同浓度鸭源性成分和牛源性成分等浓度混合质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0208]
以各引物组上、下游引物扩增产物的1
×
106拷贝/μl阳性质粒稀释液为模板，使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行猪源性成分和牛源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0209][0210]
设置阴性质控样本(1
×
106拷贝/μl重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)，加样顺序为阴性质控样本，1
×
106拷贝/μl同浓度猪源性成分和牛源性成分混合质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0211]
以各引物组上、下游引物扩增产物的1
×
106拷贝/μl的质粒稀释液为模板，使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行鸭源性成分和羊源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0212][0213]
设置阴性质控样本(1
×
106拷贝/μl重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)，加样顺序为阴性质控样本，1
×
106拷贝/μl同浓度鸭源性成分和羊源性成分混合质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0214]
以各引物组上、下游引物扩增产物的1
×
106拷贝/μl的质粒稀释液为模板，使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行猪源性成分和羊源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0215][0216]
设置阴性质控样本(1
×
106拷贝/μl重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)，加样顺序为阴性质控样本，1
×
106拷贝/μl同浓度猪源性成分和羊源性成分混合质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0217]
将反应管放置在39℃条件下反应16min。raa反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20～50倍。
[0218]
将双靶标一次性核酸检测试纸条(jy0209)结构示意图如图18所示，将试纸条的浸液区端(标示蓝色箭头向上)插入eppendorf管，液面不得超过浸液区的max指示线，待判读
个拷贝；猪源性成分检测引物组h和牛源性成分检测引物组i双重raa-lfs同时准确检测的最低检测阈值为104个拷贝；鸭源性成分检测引物组a和羊源性成分检测引物组m双重raa-lfs同时准确检测的最低检测阈值为104个拷贝；猪源性成分检测引物组h和羊源性成分检测引物组m双重raa-lfs同时准确检测的最低检测阈值为101个拷贝。
[0228]
实验例12:鸭源性成分、猪源性成分与、牛源性成分和羊源性成分双重raa-lfs检测体系的优化
[0229]
使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行鸭源性成分检测引物组a和牛源性引物组i成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0230][0231]
设置阴性质控样本(重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)，加样顺序为阴性质控样本，1
×
101拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl同浓度鸭源性成分和牛源性成分阳性混合质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0232]
使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行猪源性成分和牛源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0233][0234]
设置阴性质控样本(重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)，加样顺序为阴性质控样本，1
×
101拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl同浓度猪源性成分和牛源性成分阳性混合质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系
混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0235]
使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行鸭源性成分和羊源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0236][0237]
设置阴性质控样本(重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)，加样顺序为阴性质控样本，1
×
101拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl同浓度鸭源性成分和羊源性成分阳性混合质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0238]
使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行猪源性成分和羊源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0239][0240]
设置阴性质控样本(重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)，加样顺序为阴性质控样本，1
×
101拷贝/μl、1
×
102拷贝/μl、1
×
103拷贝/μl同浓度猪源性成分和羊源性成分阳性混合质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0241]
将反应管放置在39℃条件下反应16min。raa反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20～50倍。
[0242]
鸭源性成分与牛源性成分检测引物组双重raa-lfs灵敏度检测结果如图29所示，猪源性成分与牛源性成分检测引物组双重raa-lfs灵敏度检测结果如图30所示，鸭源性成分与羊源性成分检测引物组双重raa-lfs灵敏度检测结果如图31所示，猪源性成分与羊源性成分检测引物组双重raa-lfs灵敏度检测结果如图32所示。除猪源性成分与牛源性成分检测引物组mix4的双重raa-lfs最低检测阈值均可达到101个拷贝，其余双重检测体系中组合mix2的双重raa-lfs最低检测阈值均可达到101个拷贝。
[0243]
实验例13：简单裂解后的肉类及肉类加工品的动物源性成分双重raa-lfs检测
[0244]
经qpcr鉴定，分别包含鸭源性成分、猪源性成分与、牛源性成分和羊源性成分的肉类加工品(含卤制肉类加工品)，取约50mg样品和100μl的酷闪核酸释放剂(bt0068)混合，并用眼科剪将待检样品剪碎后，离心，取2μl裂解液上清液待检。
[0245]
使用实验例11中优化好的双重raa扩增体系扩增，以肉类及肉类加工品裂解液上清液为模板，使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行鸭源性成分和牛源性成分的双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0246]
组分用量(μl)基础缓冲液29.4duck derived-f(5μm)0.88duck derived-r(5μm)1.26duck derived-p(1μm)1.26bovine derived-f(5μm)1.17bovine derived-r(5μm)1.68bovine derived-p(1μm)1.68裂解液上清液2以水补足体积至47.5
[0247]
使用实验例11中优化后的双重raa扩增体系扩增，以肉类及肉类加工品裂解液上清液为模板，使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行猪源性成分和牛源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0248]
组分用量(μl)基础缓冲液29.4pig derived-f(5μm)0.73pig derived-r(5μm)1.05pig derived-p(1μm)1.05bovine derived-f(5μm)0.44bovine derived-r(5μm)0.63bovine derived-p(1μm)0.63裂解液上清液2以水补足体积至47.5
[0249]
使用实验例11中的双重raa扩增体系扩增，以肉类及肉类加工品裂解液上清液为模板，使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行鸭源性成分和羊源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0250]
组分用量(μl)基础缓冲液29.4duck derived-f(5μm)0.58duck derived-r(5μm)0.84duck derived-p(1μm)0.84ovine derived-f(5μm)1.03ovine derived-r(5μm)1.48ovine derived-p(1μm)1.48裂解液上清液2以水补足体积至47.5
[0251]
使用实验例11中的双重raa扩增体系扩增，以肉类及肉类加工品裂解液上清液为模板，使用raa核酸扩增试剂盒(试纸条法)(jy0204)进行猪源性成分和羊源性成分双重raa反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
[0252][0253][0254]
加样顺序为阴性质控样本(裂解液上清液替换为同体积的超纯水)、肉类及肉类加工品裂解液上清液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
[0255]
将反应管放置在39℃条件下反应16min。raa反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20～50倍。
[0256]
经简单裂解后，肉类及肉类加工品的动物源性成分双重raa-lfs检测结果如图33
所示，使用鸭源性成分与牛源性成分检测引物组，分别检测鸭肉或牛肉样品；使用猪源性成分与牛源性成分检测引物组，分别检测猪肉或牛肉样品；使用鸭源性成分与羊源性成分检测引物组，分别检测鸭肉或羊肉样品；使用猪源性成分与羊源性成分检测引物组，分别检测猪肉或羊肉样品。各样品动物源性成分检测引物组经双重raa-lfs检测后，在阴性对照显示为阴性的情况下，扩增产物的显色结果均与qpcr鉴定结果相符。
[0257]
实验例14：自制包含鸭源性成分的掺假牛肉类制品、猪源性成分的掺假牛肉类制品、包含鸭源性成分的掺假羊肉类制品和猪源性成分的掺假羊肉类制品双重raa-lfs快速检测
[0258]
鸭肉与牛肉样品经液氮速冻后，分别使用研钵研磨至粉末，并将冷冻状态的鸭肉粉末与牛肉粉末分别按照1：1、1：9、1：99和1：999的比例进行充分混合。四种比例的样品各称量100mg，并分为两等份，其中的一份50mg自制掺假肉样品使用通用型基因组dna提取试剂盒(新景生物，杭州)提取总dna，进行qpcr分析，测定cq值，并计算样品拷贝数。另一份50mg样品按照酷闪核酸释放剂提供的方法，完成自制掺假肉样品的快速裂解，将实验例11中的双重raa扩增体系扩增，体系如下：
[0259]
组分用量(μl)基础缓冲液29.4duck derived-f(5μm)0.88duck derived-r(5μm)1.26duck derived-p(1μm)1.26bovine derived-f(5μm)1.17bovine derived-r(5μm)1.68bovine derived-p(1μm)1.68肉类以及加工肉类样品裂解液2以水补足体积至47.5
[0260]
反应液配制完成后，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀。
[0261]
猪肉与牛肉样品经液氮速冻后，分别使用研钵研磨至粉末，并将冷冻状态的猪肉粉末与牛肉粉末分别按照1：1、1：9、1：99和1：999的比例进行充分混合。四种比例的样品各称量100mg，并分为两等份，其中的一份50mg自制掺假肉样品使用快速通用型基因组dna提取试剂盒(新景生物，杭州)提取总dna，进行qpcr分析，测定cq值，并计算样品拷贝数。另一份50mg样品按照酷闪核酸释放剂提供的方法，完成自制掺假肉样品的裂解，将实验例11中的双重raa扩增体系扩增，体系如下：
[0262]
组分用量(μl)基础缓冲液29.4pig derived-f(5μm)0.73pig derived-r(5μm)1.05pig derived-p(1μm)1.05bovine derived-f(5μm)0.44
bovine derived-r(5μm)0.63bovine derived-p(1μm)0.63肉类以及加工肉类样品裂解液2以水补足体积至47.5
[0263]
反应液配制完成后，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀。
[0264]
鸭肉与羊肉样品经液氮速冻后，分别使用研钵研磨至粉末，并将冷冻状态的鸭肉粉末与羊肉粉末分别按照1：1、1：9、1：99和1：999的比例进行充分混合。四种比例的样品各称量100mg，并分为两等份，其中的一份50mg自制掺假肉样品使用快速通用型基因组dna提取试剂盒(新景生物，杭州)提取总dna，进行qpcr分析，测定cq值，并计算样品拷贝数。另一份50mg样品按照酷闪核酸释放剂提供的方法，完成自制掺假肉样品的裂解，将实验例11中的双重raa扩增体系扩增，体系如下：
[0265]
组分用量(μl)基础缓冲液29.4duck derived-f(5μm)0.58duck derived-r(5μm)0.84duck derived-p(1μm)0.84ovine derived-f(5μm)1.03ovine derived-r(5μm)1.48ovine derived-p(1μm)1.48肉类以及加工肉类样品裂解液2以水补足体积至47.5
[0266]
反应液配制完成后，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀。
[0267]
猪肉与羊肉样品经液氮速冻后，分别使用研钵研磨至粉末，并将冷冻状态的猪肉粉末与羊肉粉末分别按照1:1、1:9、1:99和1:999的比例进行充分混合。四种比例的样品各称量100mg，并分为两等份，其中的一份50mg自制掺假肉样品使用快速通用型基因组dna提取试剂盒(新景生物，杭州)提取总dna，进行qpcr分析，测定cq值，并计算样品拷贝数。另一份50mg样品按照酷闪核酸释放剂提供的方法，完成自制掺假肉样品的裂解，将实验例11中的双重raa扩增体系扩增，体系如下：
[0268]
[0269][0270]
反应液配制完成后，在每个0.2ml的eppendorf管加入2.5μl 280mm的mgac2，充分混匀；将0.2ml的eppendorf管放入带有热盖功能的pcr仪上，39℃，保温16min。raa反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20倍。
[0271]
对比自制的不同比例动物源性掺假肉样品的raa-lfs检测结果(图34)与qpcr检测结果可以看出，本发明小组所发明的raa-lfs检测体系可通过样品的快速裂解，实现鸭源性成分与牛源性成分，猪源性成分与牛源性成分，鸭源性成分与羊源性成分，猪源性成分与羊源性成分的快速、准确检测。
[0272]
表5自制不同比例的动物源性掺假肉随机取样的qpcr检测结果
[0273]
[0274][0275]
综上所述，本技术通过一系列实施例，筛选出了能够同时检测鸭源性成分与牛源性成分，猪源性成分与牛源性成分，鸭源性成分与羊源性成分，猪源性成分与羊源性成分的引物组。该引物组可以有效扩增靶基因，具有较高的特异性和灵敏性，与其他物种无交叉反应，可用于鸭源性成分、猪源性成分、牛源性和羊源性成分的现场快速检测，对于食品安全具有重要意义。
[0276]
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
[0277]
本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本技术中的权利。

技术特征：
1.一种检测鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分和羊源性成分的raa检测引物组，其特征在于，所述引物组包括鸭源性成分检测引物、猪源性成分检测引物、牛源性成分检测引物和羊源性成分检测引物，鸭源性成分检测探针、猪源性成分检测探针、牛源性成分检测探针和羊源性成分检测探针；其中，所述鸭源性成分检测引物包括正向引物duck derived-f和反向引物duck derived-r，正向引物duck derived-f的序列为5
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ccacttcttagagtactcccag-3
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，反向引物duck derived-r的序列为5
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gggttgtaactgttgatagtg-3
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；所述猪源性成分检测引物包括正向引物pig derived-f和反向引物pig derived-r，正向引物pig derived-f的序列为5
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ccaataagcaatgatcaacc-3
´
，反向引物pig derived-r的序列为5
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ctatggctactgagatgtatcc-3
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；所述牛源性成分检测引物包括正向引物bovine derived-f和反向引物bovine derived-r，正向引物bovine derived-f的序列为: 5
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cgtatccctacccatccttaca-3
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，反向引物bovine derived-r的序列为:5
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acccgattcagacaagtagt-3
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；所述羊源性成分检测引物包括正向引物ovine derived-f和反向引物bovine derived-r，正向引物ovine derived-f的序列为: 5
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caacaccacacttcacagcttgc-3
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，反向引物ovine derived-r的序列为:5
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ggatcctgctagtgtgtaa-3
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。2.如权利要求1所述的引物组，其特在于，所述鸭源性成分检测探针duck derived-p，其序列为5
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gcacaagctccaacacaacaaataaagtcahcaagagccctcaacc-3
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；所述猪源性成分检测探针pig derived-p，其序列为5
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cgaatcacccgtatcataaattactcaatcchcaagcccattaaactt-3
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；所述牛源性成分检测检测探针bovine derived-p，其序列为5
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ctcttcgtgctcccaattacaccaaattchattagtaaggtcagc
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；所述羊源性成分检测检测探针ovine derived-p，其序列为5
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ccatatgacttctacccctaatactcatahctagccaacatcatc-3
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；所述鸭源性成分、猪源性成分检测所需反向引物duck derived-r、pig derived-r的5
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端修饰有fitc，所述检测探针duck derived-p、pig derived-p的5
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端修饰有生物素，duck derived-p、pig derived-p的3
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端磷酸化修饰，h为四氢呋喃；所述牛源性成分、羊源性成分反向引物bovine derived-r、ovine derived-r的5
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端修饰有地高辛，所述探针引物bovine derived-p、ovine derived-p的5
´
端修饰有罗丹明，bovine derived-p、ovine derived-p的3
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端有磷酸化修饰，h为四氢呋喃。3.一种检测肉类以及加工肉类中是否含有牛源性成分、羊源性成分、鸭源性成分和/或猪源性成分，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组。4.如权利要求1或2所述的引物组在制备用于检测待测的牛或羊肉类以及加工肉类中是否含有鸭源性成分、猪源性成分的试剂或试剂盒中的应用。5.如权利要求3所述的试剂盒在检测肉类以及加工肉类中是否含有牛源性成分、羊源性成分、鸭源性成分和/或猪源性成分中的应用。6.一种利用试剂盒检测待测的牛或羊肉类以及加工肉类中是否含有鸭源性成分、猪源
性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）提取待测肉类以及加工肉类的总dna，或对肉类以及加工肉类样品进行快速裂解、释放核酸的处理；2）以步骤1）提取的总dna或样品裂解液上清液为模板，采用权利要求1或2所述的引物组中的正向引物和反向引物进行raa扩增，获得扩增产物；3）检测扩增产物，基于扩增产物的检测结果判断是否含有鸭源性成分和/或牛源性成分、猪源性成分和/或牛源性成分，鸭源性成分和/或羊源性成分、猪源性成分和/或羊源性成分。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，若扩增产物中含有287bp的dna片段，则待测样本中含有鸭源性成分，若扩增产物中不含有287bp的dna片段，则待测样本中不含有鸭源性成分；若扩增产物中含有274bp的dna片段，则待测样本中含有猪源性成分，若扩增产物中不含有274bp的dna片段，则待测样本中不含有猪源性成分；若扩增产物中含有351bp的dna片段，则待测样本中含有牛源性成分，若扩增产物中不含有351bp的dna片段，则待测样本中不含有牛源性成分；若扩增产物中含有397bp的dna片段，则待测样本中含有羊源性成分，若扩增产物中不含有397bp的dna片段，则待测样本中不含有羊源性成分。8.一种检测待测的牛或羊肉类以及加工肉类中是否含有鸭源性成分、猪源性成分的方法的方法，其特征在于，包括：检测待测肉类以及加工肉类的裂解液或总dna扩增产物中是否含有特异dna片段，若含有特异dna片段，则待测生物样本含有鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分或羊源性成分，若不含有特异dna片段，则待测肉类以及加工肉类不含有鸭源性成分、猪源性成分、牛源性成分或羊源性成分；其中，所述特异dna片段为权利要求1或2所述的正向引物和反向引物的靶序列。9.一种基于raa-侧流层析技术检测肉类以及加工肉类样品中的鸭源性成分和/或牛源性成分、猪源性成分和/或牛源性成分，鸭源性成分和/或羊源性成分、猪源性成分和/或羊源性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）对肉类以及加工肉类样品进行快速裂解、释放核酸的处理，或提取待测生物样本的总dna；2）以步骤1）获得的样本裂解液上清液或提取的总dna为模板，采用权利要求1或2所述的引物组进行raa扩增；3）应用侧流层析试纸条对肉类以及加工肉类样品中的鸭源性成分和/或牛源性成分raa扩增产物进行检测，若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有鸭源性成分和牛源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有牛源性成分，但不含有鸭源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有鸭源性成分，但不含有牛源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有牛源性成分和鸭源性成分；若试纸条质控区和两个检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试；4）应用侧流层析试纸条对肉类以及加工肉类样品中猪源性成分和/或牛源性成分raa
扩增产物进行检测，若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有猪源性成分和牛源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有牛源性成分，但不含有猪源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有猪源性成分，但不含有牛源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有牛源性成分和猪源性成分；若试纸条质控区和两个检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试；5）应用侧流层析试纸条对肉类以及加工肉类样品中鸭源性成分和/或羊源性成分raa扩增产物进行检测，若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有鸭源性成分和羊源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有羊源性成分，但不含有鸭源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有鸭源性成分，但不含有羊源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有羊源性成分和鸭源性成分；若试纸条质控区和两个检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试；6）应用侧流层析试纸条对肉类以及加工肉类样品中猪源性成分和/或羊源性成分raa扩增产物进行检测，若试纸条只有质控区条带显色，检测区没有条带显色，检测结果为阴性，表明样本中不含有猪源性成分和羊源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t1，检测结果为阳性，表明检测样本中含有羊源性成分，但不含有猪源性成分；若试纸条有两个条带显色，其中一条位于质控区，另一条位于检测区t2，检测结果为阳性，表明检测样本中含有猪源性成分，但不含有羊源性成分；若试纸条有三个条带显色，有两个条带显色，其中一条位于质控区，一条位于检测区t1，一条位于检测区t2，则检测结果为阳性，表明样本中同时含有羊源性成分和猪源性成分；若试纸条质控区和检测区均不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新测试。

技术总结
本发明涉及动物源性成分检测技术领域，具体涉及一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术（RAA）检测牛源性的肉类以及加工肉类中是否存在鸭源性成分和猪源性成分，及羊源性的肉类以及加工肉类中是否存在鸭源性成分和猪源性成分的试剂盒及方法。本发明设计了特异性的引物组可以有效扩增鸭源性成分线粒体基因组，猪源性成分的线粒体基因组、牛源性成分的线粒体基因组和羊源性成分的线粒体基因组，引物组具有较高的特异性和灵敏度，与其他物种无交叉反应。该引物组可与侧向流试纸条联合使用用于检测牛、羊源性成分的肉类以及加工肉类中常见的掺假肉来源的鸭源性成分、猪源性成分鉴定和现场快速检测。场快速检测。场快速检测。


技术研发人员：宋雪梅 曹宇浩 申进玲
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/7/22