一种与干旱和复水相关的蛋白磷酸酶基因和应用的制作方法

1.本发明属于分子育种领域，涉及玉米抗旱新品种的培育，特别是指一种与干旱和复水相关的蛋白磷酸酶基因和应用。


背景技术：

2.玉米作为我国种植面积最大的农作物，在饲料、粮食、工业原料等方面都具有较大的需求，与过去相比，玉米的生产种植面积有了大幅度的提高，提高玉米的产量及品质是保障我国粮食安全的前提。但是近年来随着全球气候变暖，极端天气频繁发生，对农作物的生长与结实造成了严重的威胁。在玉米发芽期及幼苗期遭遇干旱胁迫时，不仅会抑制种子的萌发而且会降低幼苗的活力；其次在玉米苗期干旱天气会影响玉米的生长发育，导致叶片水势下降抑制其生长；同时，从木质部流向其他伸长组织的水流中断，导致植物细胞伸长、叶面积、茎直径及株高降低，减少干物质的积累从而降低产量。目前，我国玉米产量无法满足对于玉米的需求量，据统计，在我国总耕地面积中，干旱、半干旱耕地面积占一半以上，我国每年农业灌溉缺水约300亿m3，因干旱环境导致粮食减产 1000~1500万吨。
3.通过种植抗旱节水品种是解决干旱问题行之有效的途径之一，培育“耐高温、高产稳产、抗旱节水”的玉米新品种成了育种家的首要目标，但是借助常规的育种方式育种所用时间长且劳动强度大。近年来以分子标记辅助选择、单倍体育种、转基因、基因编辑为代表的现代育种技术为快速培育抗旱性玉米品种提供了技术手段，提高了育种效率。针对我国抗旱育种具有重大育种价值的基因资源较少问题，高效挖掘抗旱优异基因，进一步创制抗旱种质资源，培育抗旱玉米新品种，并加以推广利用，是从本质上解决干旱灾害的首要选择。
4.专利cn 106480075 a公开了一种调控玉米干旱应激抗性的基因，该基因为zmpp2ca10的缺失突变基因，该专利公开了缺失该基因可以显示增加玉米的抗旱能力的研究，而pp2c蛋白磷酸酶是高等植物中最大的蛋白磷酸酶家族，目前已发现多种蛋白磷酸酶参与响应植物应答非生物胁迫的途径。但是众多的蛋白磷酸酶家族成员，在干旱胁迫中具体是扮演正向还是负向调控，仅通过对现有基因结构的分析，并不能推断得到。挖掘抗旱基因，从分子机制解析抗旱机制是进行抗旱育种的关键方法。为进一步挖掘pp2c蛋白磷酸酶在植物生长发育及应对胁迫反应方面发挥的作用，本技术进行了长期的探索。


技术实现要素：

5.本发明提出一种与干旱和复水相关的蛋白磷酸酶基因和应用，在玉米干旱-复水转录组数据中筛选到一个显著差异表达的pp2c蛋白磷酸酶基因（grmzm2g056572），进行了深入的研究。
6.本发明的技术方案是这样实现的：与干旱和复水相关的蛋白磷酸酶基因，其启动子序列中包括响应激素的元件、参与植物生长发育的元件及响应非生物胁迫的元件。
7.上述响应激素的元件包括gare-motif，tga-element和abre；参与植物生长发育的元件包括abre和cat-box；非生物胁迫响应元件包括g-box，tct-motif，chs-cma1a，sp1，tccc-motif，gc-motif，和are。
8.上述蛋白磷酸酶基因为zmpp2c15，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.上述蛋白磷酸酶基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.含有上述的蛋白磷酸酶基因的载体。
11.上述载体为融合表达载体。
12.上述的含有蛋白磷酸酶基因的载体的制备方法，步骤如下：（1）以玉米总rna反转录得到的cdna为模板，以zmpp2c15-f和zmpp2c15-r为引物对目的片段进行扩增并回收，回收产物连接至pmd18-t载体，转化大肠杆菌dh5a后挑取pcr检测正确的阳性克隆送公司测序；（2）步骤（1）中测序正确的zmpp2c15-pmd18菌液提取质粒后作为模板，分别以特异性引物zmpp2c15-f-asci和zmpp2c15-r-bamhi进行扩增；（3）将步骤（2）的扩增产物与经过双酶切的线性化目的载体利用同源重组技术进行连接并转化，挑取验证正确的阳性克隆即为玉米zmpp2c15基因的融合表达载体zmpp2c15-pfgc5941。
13.上述步骤（1）中引物zmpp2c15-f序列如seq id no.3所示，引物zmpp2c15-r序列如seq id no.4所示。
14.上述步骤（2）中引物zmpp2c15-f-asci序列如seq id no.5所示，引物zmpp2c15-r-bamhi序列如seq id no.6所示。
15.上述的含有蛋白磷酸酶基因的载体在培育干旱胁迫的玉米植株中的应用。
16.本发明具有以下有益效果：1、本发明通过转录组数据筛选到一个在干旱胁迫及复水条件下表达量差异较大的pp2c蛋白磷酸酶基因zmpp2c15，通过实验证明在玉米生长发育过程中遭遇干旱、高温及盐胁迫时，该基因能够积极响应以缓解玉米所受到的危害。通过生物信息学及转录组数据分析筛选到响应干旱和复水处理的基因pp2c蛋白磷酸酶，通过节点图分析获得响应干旱胁迫及复水的关键基因zmpp2c15。ncbi功能注释发现该基因位于第2染色体，含有8个外显子和7个内含子。蛋白保守结构域分析发现，该蛋白序列如seq id no.2所示含有pp2c结构域（图1），暂命名该基因为zmpp2c15。
17.2、本技术的pp2c蛋白磷酸酶基因zmpp2c15过表达可以显著增强转基因拟南芥植株对干旱的耐受性。
18.3、在zmpp2c15基因的atg上游2000bp中存在着多种顺式作用元件，包括非生物胁迫响应元件；g-box，tct-motif，chs-cma1a，sp1，tccc-motif，gc-motif ，are；响应激素的元件有gare-motif，tga-element，abre，响应植物生长发育的元件有cat-box。表明zmpp2c15的表达受到非生物胁迫及相关激素的诱导，同时在植物的生长发育中存在着重要的调节作用。
19.4、在对干旱（20% peg6000）、高温（37℃）、盐（200 mmol/l）和aba（0.1 mmol/l）激素处理下zmpp2c15的表达模式进行分析。如图4所示，在干旱、高温、盐及aba胁迫下zmpp2c15均上调表达，尤其在干旱及盐胁迫下上调幅度较大，结果说明zmpp2c15能够积极
响应干旱、高温、盐及aba胁迫处理。过表达zmpp2c15基因提高了拟南芥植株对干旱和高温的耐受性。
20.5、利用crispr-cas9技术对玉米中的zmpp2c15基因进行敲除，并对敲除植株进行干旱处理。在干旱胁迫下，zmpp2c15敲除后植株的生长受到明显的抑制作用，叶片萎蔫、干枯的现象较为严重。野生型植株在干旱胁迫下虽然也受到一定程度的影响，但野生型植株受到的抑制效果明显小于zmpp2c15敲除植株。证明干扰zmpp2c15基因的表达，会导致玉米对干旱敏感，结果说明zmpp2c15基因在干旱胁迫中起正向调控的作用，为培育耐干旱玉米植株提供了新思路。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为玉米zmpp2c15蛋白保守结构域。
23.图2为玉米zmpp2c15的进化树分析图。
24.图3为zmpp2c15组织特异性表达图。
25.图4为zmpp2c15响应干旱、高温、盐和aba的表达模式。
26.图5为zmpp2c15基因pcr产物电泳图。
27.图6为zmpp2c15筛选拟南芥阳性苗pcr图。
28.图7为zmpp2c15过表达拟南芥在干旱、高温、盐胁迫下的表型变化图。
29.图8为zmpp2c15突变型与野生型的序列比较。
30.图9为zmpp2c15转基因突变体玉米在干旱胁迫及复水后的表型变化图。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1：zmpp2c15的序列分析本技术在课题组前期进行的玉米干旱-复水转录组数据中筛选到一个显著差异表达的pp2c蛋白磷酸酶基因。以玉米自交系郑8713为材料，在三叶期对其进行自然干旱胁迫及恢复浇水处理，通过分析转录组数据筛选到一个具有显著差异表达的pp2c蛋白磷酸酶基因。ncbi功能注释发现该基因位于第2染色体，含有8个外显子和7个内含子。通过分析蛋白保守结构域发现该蛋白序列如seq id no.2所示含有pp2c结构域（图1），暂命名该基因为zmpp2c15。
33.以zmpp2c15基因编码的蛋白序列进行ncbi搜索并进行进化树分析，发现与水稻的os04g0656500蛋白亲缘关系较近（图2），推测zmpp2c15与水稻同源基因可能存在相似的生物学功能。
34.对其进行启动子顺式作用元件分析，结果如表1：在zmpp2c15atg上游2000bp中存在着多种顺式作用元件，包括非生物胁迫响应元件；g-box，tct-motif，chs-cma1a，sp1，tccc-motif，gc-motif ，are；响应激素的元件有gare-motif，tga-element，abre，其中abre元件通过参与脱落酸aba信号传导途径来应答干旱胁迫；响应植物生长发育的元件有cat-box。表明zmpp2c15在植物的生长发育中扮演着重要的作用，同时该基因的表达受到非生物胁迫及相关激素的诱导。
35.表1zmpp2c15基因的启动子顺式元件实施例2：玉米zmpp2c15表达模式分析一、zmpp2c15不同组织的表达模式以郑8713自交系为材料，分析zmpp2c15基因（序列如seq id no.1所示）在不同器官中的表达模式，发现该基因在根、茎、叶和发育器官中均表达如图3所示，属于组织型表达基因，并在首根和首叶中具有较高的表达量。
36.二、zmpp2c15响应非生物胁迫和脱落酸的表达模式通过分析zmpp2c15基因的启动子顺式作用元件（表1），发现zmpp2c15基因的启动子区域含有响应非生物胁迫以及赤霉素、生长素及aba等植物激素的元件，因此分析干旱（20% peg6000）、高温（37℃）、盐（200mmol/l）、aba（0.1 mmol/l）等处理下zmpp2c15的表达模式。如图4所示，在干旱、高温、盐及aba处理下zmpp2c15均会上调表达，尤其在干旱及盐胁迫下上调幅度较大，结果说明zmpp2c15积极上调表达响应干旱、高温、盐及aba处理。
37.实施例3：zmpp2c15基因的克隆提取玉米总rna，以反转录到的cdna为模块，zmpp2c15-f (forward primer) 序列如seq id no.3所示: atgtgtcgctcacgtgaaaa和zmpp2c15-r(reverse primer)序列如seq id no.4所示: ttaagcgtatccgctgctac特异序列为引物，选择高保真酶p505（vazyme）扩增zmpp2c15基因的开放阅读框。扩增程序为: 95℃预变性5 min，95℃变性30s、55℃退火30s、
72℃延伸1min,第三个步骤循环35次，最后72℃彻底延伸10 min，扩增体系如表2。pcr扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，有单一且条带大小与zmpp2c15基因大小一致，如图5所示。在紫外凝胶成像仪下切下目的条带并进行dna回收，将回收产物连接至pmd18-t载体，然后转化大肠杆菌dh5a，挑取pcr检测正确的阳性克隆送公司测序。测序正确的菌液提取质粒以进行下一步实验。
38.表2zmpp2c15基因克隆的扩增体系实施例4：zmpp2c15转基因拟南芥的获得与鉴定一、zmpp2c15基因与过表达载体连接使用asci和bamhi对目的载体（pfgc5941）进行双酶切。以测序正确的zmpp2c15-pmd18菌液提取的质粒为模板，zmpp2c15-f-asci (forward primer)序列如seq id no.5所示: aggcgcgccaatgctattgctgtttca和zmpp2c15-r-bamhi(reverse primer)序列如seq id no.6所示: cgggatccttaagcgtatccgctgct特异序列为引物，使用高保真酶p505进行pcr扩增，体系如表2。
39.将双酶切后的pfgc5941载体和对应酶扩增的pcr纯化回收产物,使回收产物与融合载体产生相同的黏性末端，利用同源重组技术（vazyme）将目的基因连到表达载体pfgc5941上。然后转化大肠杆菌dh5a，挑取pcr检测正确的阳性克隆送公司测序。测序正确的菌液提取质粒以进行下一步实验。
40.二、zmpp2c15转基因拟南芥材料的获得及拟南芥阳性苗的筛选通过拟南芥花序侵染法将zmpp2c15基因过表达载体转入拟南芥，待拟南芥成熟后收获的种子为t0代。t0代种子消毒后，种植于含有35 mg/l除草剂的1/2 ms培养基上进行阳性苗的筛选，挑选生长健壮的拟南芥转基因株系提取dna，以bar（421bp）引物（bar-forward:5'-aaacccacgtcatgccagtt-3’和bar-reverse:5'-catcgagacaagcacggtca-3’）进行pcr扩增，如图6所示。将pcr验证为阳性的拟南芥幼苗进行种植，成熟后收获t1代种子。将t1代种子种植于不含抗生素的1/2 ms培养基，筛选出阳性幼苗并进行种植，成熟后获得t2代种子。选择相同的培养基在种植一次，获得纯合的t3代种子。
41.提取野生型和检测带有bar条带的拟南芥株系rna，反转录成cdna，检测zmpp2c15
基因的表达量，成功获得纯合的zmpp2c15的转基因株系。
42.实施例5：zmpp2c15过表达拟南芥的抗逆性分析一、干旱、高温、盐胁迫对拟南芥幼苗生长发育的影响随着气候的变化，干旱和高温等一些极端天气频繁发生，对植物的生长发育带来严重的威胁，本实验设计干旱（水分缺失，温度适合植株生长）、高温（水分正常，温度高于正常生长适合温度）和盐（水分正常但是加入200 mmol/l的nacl，温度适合植株正常生长）条件对zmpp2c15基因功能进行初步探究。
43.由图7可知，正常生长条件下，野生型和转基因zmpp2c15株系l1、l2和l3的长势基本一致，生长状态较好。干旱胁迫7天后，转基因拟南芥株系和野生型拟南芥株系的生长均受到抑制，出现叶片萎蔫，叶尖发黄的现象，但转基因拟南芥过表达株系l1、l2和l3相对于野生型均表现出较好的生长状态。高温（37℃）处理下，野生型植株生长受到严重的威胁，叶片开始萎蔫、发黄，出现了濒死的状况，虽然转基因株系l1、l2和l3同样受到高温胁迫导致叶片发黄，但是其生长情况明显好于野生型植株生长状况。在盐胁迫（200 mmol/l的nacl）处理下拟南芥的生长状况受到一定程度的影响，出现叶片萎蔫、干枯的现象，但是转基因拟南芥株系l1、l2和l3的生长优于野生型株系。说明过表达zmpp2c15基因提高了拟南芥植株对干旱、高温和盐胁迫的耐受性。
44.实施例6：zmpp2c15沉默玉米的抗逆性分析一、玉米zmpp2c15基因的敲除及玉米阳性苗的筛选根据 crispr-cas9 实验方案，使用 4 条引物以 pcbc-mt1t2 为模板进行扩增，得到约1000bp 的条带，与预期结果一致。将目的片段连接到pbue411 载体并转化大肠杆菌 dh5 a；使用载体通用引物进行菌液 pcr 检测，产物凝胶检测大小约为 1000bp，与实验预期结果相符；挑取pcr检测正确的阳性单克隆送公司测序，测序结果正确，突变体载体pbue411+zmpp2c15构建成功。将构建好的载体转入农杆菌 eha105 后，交予公司做玉米遗传转化。
45.对获得待定的敲除转基因dna用除草剂bar基因进行pcr扩增筛选，去掉部分野生型单株，初步获得玉米突变体阳性植株，通过进一步的检测和测序，发现突变体在靶位点处出现了 7个碱基的缺失，如图8所示，这些碱基的缺失导致zmpp2c15基因编码的氨基酸移码，蛋白突变。
46.二、zmpp2c15突变体玉米的抗旱性分析 选取玉米zmpp2c15突变体及野生型植株进行干旱胁迫及复水处理，由图9可知，在正常处理下，野生型植株和突变体植株的长势情况基本一致。用20%的peg6000对其进行干旱胁迫后，玉米植株的生长受到了明显的抑制，出现叶片萎蔫、叶尖变黄、部分叶片干枯的现象，其中zmpp2c15突变体植株相比于野生型植株生长受到的抑制作用更明显。在干旱胁迫5天后，对野生型及突变体植株解除干旱胁迫进行复水处理，发现野生型和突变体植株恢复正常生长，叶片萎蔫程度减缓，开始变绿，且野生型植株的恢复状况较突变体植株快；表明zmpp2c15基因的表达，导致玉米对干旱敏感，说明zmpp2c15基因在干旱胁迫中起正向调控作用。
47.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.与干旱和复水相关的蛋白磷酸酶基因，其启动子序列中包括响应激素的元件、参与植物生长发育的元件及响应非生物胁迫的元件。2.根据权利要求1所述的与干旱和复水相关的蛋白磷酸酶基因，其特征在于：所述响应激素的元件包括gare-motif，tga-element和abre；参与植物生长发育的元件包括abre和cat-box；非生物胁迫响应元件包括g-box，tct-motif，chs-cma1a，sp1，tccc-motif，gc-motif，和are。3.根据权利要求2所述的与干旱和复水相关的蛋白磷酸酶基因，其特征在于：所述蛋白磷酸酶基因为zmpp2c15，其核苷酸序列如seq id no.1所示。4.根据权利要求2所述的与干旱和复水相关的蛋白磷酸酶基因，其特征在于：所述蛋白磷酸酶基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。5.含有权利要求1-4任一项所述的蛋白磷酸酶基因的载体。6.根据权利要求5所述的含有蛋白磷酸酶基因的载体，其特征在于：所述载体为融合表达载体。7.权利要求6所述的含有蛋白磷酸酶基因的载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）以玉米总rna反转录得到的cdna为模板，以zmpp2c15-f和zmpp2c15-r为引物对目的片段进行扩增并回收，回收产物连接至pmd18-t载体，转化大肠杆菌dh5a后挑取pcr检测正确的阳性克隆送公司测序；（2）步骤（1）中测序正确的zmpp2c15-pmd18菌液提取质粒后作为模板，分别以特异性引物zmpp2c15-f-asci和zmpp2c15-r-bamhi进行扩增；（3）将步骤（2）的扩增产物与经过双酶切的线性化目的载体利用同源重组技术进行连接并转化，挑取验证正确的阳性克隆即为玉米zmpp2c15基因的融合表达载体zmpp2c15-pfgc5941。8.根据权利要求7所述的含有蛋白磷酸酶基因的载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中引物zmpp2c15-f序列如seq id no.3所示，引物zmpp2c15-r序列如seq id no.4所示。9.根据权利要求7所述的含有蛋白磷酸酶基因的载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中引物zmpp2c15-f-asci序列如seq id no.5所示，引物zmpp2c15-r-bamhi序列如seq id no.6所示。10.权利要求6所述的含有蛋白磷酸酶基因的载体在培育耐干旱胁迫的玉米植株中的应用。

技术总结
本发明属于分子育种领域，涉及玉米抗旱新品种的培育，特别是指一种与干旱和复水相关的蛋白磷酸酶基因和应用。本发明通过转录组数据筛选到一个在干旱胁迫及复水条件下表达量差异较大的PP2C蛋白磷酸酶基因ZmPP2C15，通过实验证明在玉米生长发育过程中遭遇干旱、高温及盐胁迫时，该基因能够积极响应以缓解玉米所受到的危害。通过生物信息学及转录组数据分析筛选到响应干旱和复水处理的基因PP2C蛋白磷酸酶，通过节点图分析获得响应干旱胁迫及复水的关键基因ZmPP2C15。过表达ZmPP2C15基因提高了拟南芥植株对干旱和高温的耐受性。拟南芥植株对干旱和高温的耐受性。拟南芥植株对干旱和高温的耐受性。


技术研发人员：鲁晓民 曹丽茹 庞芸芸 张前进 马晨晨 叶飞宇 王振华 张新
受保护的技术使用者：神农种业实验室
技术研发日：2023.02.13
技术公布日：2023/7/22