一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法与流程

1.本发明涉及土壤污染修复技术领域，具体涉及一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法。


背景技术：

2.20世纪以来，在经济社会不断发展的背景下，油气资源的需求量日益增加，促进了采油工业的快速发展，而油田采油作业过程中产生的落地石油及产出液沉积对井场周围土壤造成一定程度的石油污染问题始终无法避免；若井场在退役归还征地前调查发现确存在土壤中污染物超标情况，油田将面临开展场地污染风险管控与修复的巨大压力。为了减少油气田采对环境造成污染以及实现资源的回收利用，迫切需要寻求高效可行的处理工艺和技术手段实现油田土壤的彻底无害化修复。而微生物修复技术是不改变土壤的性质和用途，适用于井场土壤修复最经济、环保的技术。在土壤土著微生物的代谢作用下，石油中较易降解的石油烃组分会优先被微生物降解并矿化，从而实现一定程度的土壤自净。然而残留的大量多环芳烃类（pahs）持久性有机污染物，由于其化学结构中存在大量苯环结构，对生物氧化过程具有较大抗性，随时间推移会在污染土壤中逐渐积累。因此，油田井场土壤中pahs的高效削减属于油田井场土壤修复过程的瓶颈难题，也是油田采油作业与集输过程中污染控制技术中的重要一环。
3.常规原位生物修复技术降解pahs速率低下，且部分pahs去除率较低，无法充分满足对土壤进行污染物彻底去除的要求。原位生物修复技术通过刺激土壤中具有石油烃类污染物降解能力的土著菌，或者投加外源功能微生物来实现土壤中污染物的削减，因其具有经济性、无二次污染等优点而被视为大面积石油污染土壤治理的理想手段。然而对于石油烃类污染物中最难降解的pahs污染物，常规原位生物修复技术存在菌种代谢活性不高，污染物削减存在选择性（总体削减能力受限），土壤中环境因子和微生物种间竞争影响功能菌种代谢稳定性等一系列瓶颈问题，导致在实际土壤污染物修复应用中采取原位生物修复技术普遍存在对难降解组分（如pahs）去除效率低下的问题。
4.常规原位生物修复技术对pahs的削减，原理是利用微生物（细菌、真菌以及多种微生物的联合体等）的代谢过程破坏pahs的化学结构使之发生降解，并通过提供适合的环境条件或相关功能菌种的浓度与活性，加速该生物降解过程。然而，生物氧化过程存在一个本质上的缺陷，即“生化极值”问题。当目标有机污染物（如特定pahs）的化学键键能超越微生物氧化酶体系所能达到的氧化能力（氧化还原电位，orp）时，生物降解过程便无法有效进行。因而，常规原位生物修复技术在实际应用过程中对石油污染土壤中pahs的修复存在降解速率低下，部分pahs去除率较低等问题，无法充分满足对土壤污染物进行彻底去除的目标要求。例如，公开号为cn1712367a的专利就是主要去除油泥中的饱和烃类。
5.因此，急需开发针对土壤中pahs难降解有机污染物的高效原位削减技术以实现井场土壤的彻底无害化修复。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其技术方案如下：一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，包括如下步骤：（1）培养高效降解多环芳烃复合菌系；所述高效降解多环芳烃复合菌系是指从受多环芳烃污染的油田土壤中富配而成的复合菌群；（2）构建微生物胞外高级氧化体系，实现受多环芳烃污染土壤的高效原位修复。
7.所述步骤（1）油田土壤是指挖取井场周边地区表层0-10cm、表面呈棕色或深褐色、结构疏松及无明显沙质感的土壤；油田土壤取回后进行培养前预处理。
8.所述土壤培养前预处理的措施如下：将土壤置于容器中，用盐水浸润，并置于超声波清洗仪器中低功率震荡；超声震荡结束后，将土壤悬浊液混匀，快速的倒入离心管中，多次漩涡并将上层悬浊液倒入另一个干净的离心管中；如此反复多次，直至所有悬浊液都转入干净的离心管中；将上述转移后的离心管置于离心机中，低温低速离心；离心结束后，离心管倒去上清液后的沉淀物作为预处理后的油田土壤转移至干净的容器中备用。
9.所述盐水盐度为0.5%-1.5%；所述超声波功率为300-600w；所述震荡时间为5-10min；所述低温低速离心的温度为3-5℃，转速为1500-2500r/min，离心时间为8-12min。
10.所述盐水盐度为1%；所述超声波功率为500w；所述震荡时间为8min；所述低温低速离心的温度为4℃，转速为2000r/min，离心时间为10min。
11.所述步骤（1）高效降解多环芳烃复合菌系的培养方法如下:
①
配制高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基：称取多环芳烃萘、蒽、芘分别溶于有机溶剂中，制成萘-有机溶剂溶液、蒽-有机溶剂溶液、芘-有机溶剂溶液；吸取多环芳烃-有机溶剂溶液加入至装有人工海水培养基的无菌锥形瓶中，使得多环芳烃-有机溶剂的终浓度为500mg/l，静置10-14h；待瓶中有机溶剂完全挥发后，形成高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基；
②
将高效降解多环芳烃复合菌系置于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中进行富集纯化培养：在超净台中用无菌称取预处理后的土壤样品于灭菌离心管中，后按无菌操作将土壤完全移至高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中，在28℃温度下恒温振荡富集培养多环芳烃降解菌；培养三周之后进行两方面的操作：一方面将富集的菌悬液进行梯度稀释，使用含盐全营养固体培养基进行平板涂布并恒温培养，另一方面将富集的菌悬液再次接种于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中再次富集培养；两周之后将富集培养的菌悬液按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；两周之后再次按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；重复培养结束后，固体培养基上所得单菌落细菌根据菌落形态进行分离纯化，得到能够在高盐环境下降解多环芳烃的纯种细菌；
③
纯种细菌的保存：将纯种细菌以保种液保存于-80℃。
12.所述有机溶剂为丙酮或乙腈。
13.所述步骤（2）微生物胞外高级氧化体系的构建方法如下:
①
将制备好的高效降解多环芳烃复合菌系与与受多环芳烃污染的土壤充分混合；
所述土壤为0-20cm且充分破碎的表层土壤，土壤ph调节为7.0-7.5，孔隙度为55%-65%，具有良好的通气、通水和保水性能；所述土壤含水率保持15%-45%；
②
调节高效降解多环芳烃复合菌系中pseudomonas 菌属的菌浓度为10
6-109/kg土壤；
③
调节微量外源共代谢有机质浓度，使多环芳烃与微量外源共代谢有机质的质量比为（50:1）-（150:1）；
④
调节外源常量元素及微量元素，常量元素采用30g/l的cacl2、25g/l的mgso4、30g/l的fecl3，其添加比例均为土壤重量：投加量=1000:1；微量元素采用0.05g/l的h3bo3、0.05g/l的zncl2、0.05g/l的cucl2、0.05g/l的mnso4、0.05g/l的(nh4)6mo7o
24
、0.05g/l的alcl3、0.05g/l的cocl2及0.05g/l的nicl2，其添加比例均为土壤重量：投加量=10000:1；
⑤
经过上述调节后，使微生物胞外高级氧化体系氧化还原电位大于+300 mv。
14.所述多环芳烃与微量外源共代谢有机质的质量比为100:1，微量外源共代谢有机质采用葡萄糖或乙酸钠。
15.所述土壤含水率保持20%-30%；所述pseudomonas菌属的菌浓度为107/kg土壤。
16.与现有技术相比，本发明主要具有以下有益技术效果：1.本发明技术路线合理，土壤修复效果突出。本发明通过从受多环芳烃污染的土壤中获得高效降解多环芳烃的复合菌系，并构建基于多环芳烃污染物识别的微生物胞外高级氧化体系，提高系统整体的污染物耐受水平和降解能力，可有效解决传统原位生物修复降解效能低及降解速率慢的问题，减少土壤修复过程中可能造成的的二次污染风险，对土壤中多环芳烃难降解有机污染物进行高效原位削减，对油田污染土壤实现彻底无害化修复。
17.2.本发明通过从受多环芳烃污染的土壤中获得高效降解多环芳烃的复合菌系，可提高对单一或多种多环芳烃的耐受水平，适用性广，从而提高总体削减能力。
18.3.通过构建微生物胞外高级氧化体系，可进一步提高菌种活性和代谢稳定性，与常规原位生物修复技术相比，其降解速率和降解极限大大提高。
19.4.利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法操作便捷，见效快，降解效能高，且可实现受污染土壤的彻底无害化修复，便于工业化推广应用。
附图说明
20.图1为高效降解多环芳烃复合菌系筛选和分离纯化流程示意图；图2为微生物胞外高级氧化体系对多环芳烃的去除效果曲线图；图3为土壤中土著菌群对多环芳烃的去除效果曲线图。
具体实施方式
21.下面结合实施例及附图对本发明进行详细说明。
22.实施例1一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其包括如下步骤：（1）培养高效降解多环芳烃复合菌系
高效降解多环芳烃复合菌系是指从受多环芳烃污染的油田土壤中富配而成的复合菌群。实施例中采用的土壤采集地点为石油开采井场周边土地，该场地常年受石油开采影响，土壤中可检测出多种多环芳烃，且多为盐碱地。挖取井场周边地区表层0-10cm、表面呈棕色或深褐色、结构疏松及无明显沙质感的土壤。油田土壤取回后，因其中含有大量的无机颗粒，需在培养前进行预处理。
23.土壤培养前预处理的措施如下：将土壤置于容器中，用盐水浸润，并置于超声波清洗仪器中低功率震荡，以富集土壤颗粒上的微生物；超声震荡结束后，将土壤悬浊液混匀，快速的倒入50ml离心管中，多次漩涡并将上层悬浊液倒入另一个干净的离心管中；如此反复多次，直至所有悬浊液都转入干净的离心管中；将上述转移后的离心管置于离心机中，低温低速离心；离心结束后，离心管倒去上清液后的沉淀物作为预处理后的油田土壤转移至干净的容器中备用。
24.上述盐水盐度为0.5%；超声波功率为300w；震荡时间为5min；低温低速离心的温度为3℃，转速为1500r/min，离心时间为8min。
25.关于高效降解多环芳烃复合菌系的具体培养方法简介如下:
①
配制高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基：称取多环芳烃萘、蒽、芘分别溶于有机溶剂中，制成萘-有机溶剂溶液、蒽-有机溶剂溶液、芘-有机溶剂溶液；吸取5ml多环芳烃-有机溶剂溶液加入至装有100ml人工海水培养基的无菌锥形瓶中，使得多环芳烃-有机溶剂的终浓度为500mg/l，静置10h。待瓶中有机溶剂完全挥发后，形成高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基。配制时，称取萘、蒽、芘的重量均为0.03g，分别溶于有机溶剂中，制成10g/l的混合液；有机溶剂选用丙酮。
26.②
将高效降解多环芳烃复合菌系置于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中进行富集纯化培养：在超净台中用无菌称取约1-2g预处理后的土壤样品于灭菌离心管中，后按无菌操作将土壤完全移至高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中，在28℃温度下恒温振荡富集培养多环芳烃降解菌；培养三周之后进行两方面的操作：一方面将富集的菌悬液进行梯度稀释，使用含盐全营养固体培养基进行平板涂布并恒温培养，另一方面将富集的菌悬液再次接种于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中再次富集培养；两周之后将富集培养的菌悬液按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；两周之后再次按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；重复培养结束后，固体培养基上所得单菌落细菌根据菌落形态进行分离纯化，得到能够在高盐环境下降解多环芳烃的纯种细菌；
③
纯种细菌的保存：将纯种细菌以保种液保存于-80℃。
27.高效降解多环芳烃复合菌系的培养流程参见图1。
28.（2）构建微生物胞外高级氧化体系，实现受多环芳烃污染土壤的高效原位修复微生物胞外高级氧化体系的具体构建方法如下:
①
将制备好的高效降解多环芳烃复合菌系与与受多环芳烃污染的土壤充分混合；所述土壤为0-20cm且充分破碎的表层土壤，土壤ph调节为7.0-7.5，孔隙度为55%-65%，具有良好的通气、通水和保水性能；所述土壤含水率保持含水率保持15%-45%；
②
调节高效降解多环芳烃复合菌系中pseudomonas 菌属的菌浓度为106/kg土壤；
③
调节微量外源共代谢有机质浓度，使多环芳烃与微量外源共代谢有机质的质量
比为50:1；微量外源共代谢有机质采用葡萄糖；
④
调节外源常量元素及微量元素，常量元素采用30g/l的cacl2、25g/l的mgso4、30g/l的fecl3，其添加比例均为土壤重量：投加量=1000:1；微量元素采用0.05g/l的h3bo3、0.05g/l的zncl2、0.05g/l的cucl2、0.05g/l的mnso4、0.05g/l的(nh4)6mo7o
24
、0.05g/l的alcl3、0.05g/l的cocl2及0.05g/l的nicl2，其添加比例均为土壤重量：投加量=10000:1；
⑤
经过上述调节后，使微生物胞外高级氧化体系氧化还原电位大于+300 mv。
29.实施例2一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其包括如下步骤：（1）培养高效降解多环芳烃复合菌系高效降解多环芳烃复合菌系是指从受多环芳烃污染的油田土壤中富配而成的复合菌群。实施例中采用的土壤采集地点为石油开采井场周边土地，该场地常年受石油开采影响，土壤中可检测出多种多环芳烃，且多为盐碱地。挖取井场周边地区表层0-10cm、表面呈棕色或深褐色、结构疏松及无明显沙质感的土壤。油田土壤取回后，因其中含有大量的无机颗粒，需在培养前进行预处理。
30.土壤培养前预处理的措施如下：将土壤置于容器中，用盐水浸润，并置于超声波清洗仪器中低功率震荡，以富集土壤颗粒上的微生物；超声震荡结束后，将土壤悬浊液混匀，快速的倒入50ml离心管中，多次漩涡并将上层悬浊液倒入另一个干净的离心管中；如此反复多次，直至所有悬浊液都转入干净的离心管中；将上述转移后的离心管置于离心机中，低温低速离心；离心结束后，离心管倒去上清液后的沉淀物作为预处理后的油田土壤转移至干净的容器中备用。
31.上述盐水盐度为0.7%；超声波功率为450w；震荡时间为7min；低温低速离心的温度为3.5℃，转速为1800r/min，离心时间为9min。
32.关于高效降解多环芳烃复合菌系的具体培养方法简介如下:
①
配制高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基：称取多环芳烃萘、蒽、芘分别溶于有机溶剂中，制成萘-有机溶剂溶液、蒽-有机溶剂溶液、芘-有机溶剂溶液；吸取5ml多环芳烃-有机溶剂溶液加入至装有100ml人工海水培养基的无菌锥形瓶中，使得多环芳烃-有机溶剂的终浓度为500mg/l，静置11h。待瓶中有机溶剂完全挥发后，形成高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基。配制时，称取萘、蒽、芘的重量均为0.04g，分别溶于有机溶剂中，制成10g/l的混合液；有机溶剂选用乙腈。
33.②
将高效降解多环芳烃复合菌系置于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中进行富集纯化培养：在超净台中用无菌称取约1-2g预处理后的土壤样品于灭菌离心管中，后按无菌操作将土壤完全移至高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中，在28℃温度下恒温振荡富集培养多环芳烃降解菌；培养三周之后进行两方面的操作：一方面将富集的菌悬液进行梯度稀释，使用含盐全营养固体培养基进行平板涂布并恒温培养，另一方面将富集的菌悬液再次接种于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中再次富集培养；两周之后将富集培养的菌悬液按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；两周之后再次按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；重复培养结束后，固体培养基上所得单菌落细菌根据菌落形态进行分离纯化，得到能够在高盐环境下
降解多环芳烃的纯种细菌；
③
纯种细菌的保存：将纯种细菌以保种液保存于-80℃。
34.高效降解多环芳烃复合菌系的培养流程参见图1。
35.（2）构建微生物胞外高级氧化体系，实现受多环芳烃污染土壤的高效原位修复微生物胞外高级氧化体系的具体构建方法如下:
①
将制备好的高效降解多环芳烃复合菌系与与受多环芳烃污染的土壤充分混合；所述土壤为0-20cm且充分破碎的表层土壤，土壤ph调节为7.0-7.5，孔隙度为55%-65%，具有良好的通气、通水和保水性能；所述土壤含水率保持含水率保持20%-30%；
②
调节高效降解多环芳烃复合菌系中pseudomonas 菌属的菌浓度为107/kg土壤；
③
调节微量外源共代谢有机质浓度，使多环芳烃与微量外源共代谢有机质的质量比为70:1；微量外源共代谢有机质采用乙酸钠；
④
调节外源常量元素及微量元素，常量元素采用30g/l的cacl2、25g/l的mgso4、30g/l的fecl3，其添加比例均为土壤重量：投加量=1000:1；微量元素采用0.05g/l的h3bo3、0.05g/l的zncl2、0.05g/l的cucl2、0.05g/l的mnso4、0.05g/l的(nh4)6mo7o
24
、0.05g/l的alcl3、0.05g/l的cocl2及0.05g/l的nicl2，其添加比例均为土壤重量：投加量=10000:1；
⑤
经过上述调节后，使微生物胞外高级氧化体系氧化还原电位大于+300 mv。
36.实施例3一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其包括如下步骤：（1）培养高效降解多环芳烃复合菌系高效降解多环芳烃复合菌系是指从受多环芳烃污染的油田土壤中富配而成的复合菌群。实施例中采用的土壤采集地点为石油开采井场周边土地，该场地常年受石油开采影响，土壤中可检测出多种多环芳烃，且多为盐碱地。挖取井场周边地区表层0-10cm、表面呈棕色或深褐色、结构疏松及无明显沙质感的土壤。油田土壤取回后，因其中含有大量的无机颗粒，需在培养前进行预处理。
37.土壤培养前预处理的措施如下：将土壤置于容器中，用盐水浸润，并置于超声波清洗仪器中低功率震荡，以富集土壤颗粒上的微生物；超声震荡结束后，将土壤悬浊液混匀，快速的倒入50ml离心管中，多次漩涡并将上层悬浊液倒入另一个干净的离心管中；如此反复多次，直至所有悬浊液都转入干净的离心管中；将上述转移后的离心管置于离心机中，低温低速离心；离心结束后，离心管倒去上清液后的沉淀物作为预处理后的油田土壤转移至干净的容器中备用。
38.上述盐水盐度为1%；超声波功率为500w；震荡时间为8min；低温低速离心的温度为4℃，转速为2000r/min，离心时间为10min。
39.关于高效降解多环芳烃复合菌系的具体培养方法简介如下:
①
配制高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基：称取多环芳烃萘、蒽、芘分别溶于有机溶剂中，制成萘-有机溶剂溶液、蒽-有机溶剂溶液、芘-有机溶剂溶液；吸取5ml多环芳烃-有机溶剂溶液加入至装有100ml人工海水培养基的无菌锥形瓶中，使得多环芳烃-有机溶剂的终浓度为500mg/l，静置12h。待瓶中有机溶剂完全挥发后，形成高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基。配制时，称取萘、蒽、芘的重量均为0.05g，分别溶于有机溶剂
中，制成10g/l的混合液；有机溶剂选用丙酮。
40.②
将高效降解多环芳烃复合菌系置于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中进行富集纯化培养：在超净台中用无菌称取约1-2g预处理后的土壤样品于灭菌离心管中，后按无菌操作将土壤完全移至高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中，在28℃温度下恒温振荡富集培养多环芳烃降解菌；培养三周之后进行两方面的操作：一方面将富集的菌悬液进行梯度稀释，使用含盐全营养固体培养基进行平板涂布并恒温培养，另一方面将富集的菌悬液再次接种于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中再次富集培养；两周之后将富集培养的菌悬液按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；两周之后再次按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；重复培养结束后，固体培养基上所得单菌落细菌根据菌落形态进行分离纯化，得到能够在高盐环境下降解多环芳烃的纯种细菌；
③
纯种细菌的保存：将纯种细菌以保种液保存于-80℃。
41.高效降解多环芳烃复合菌系的培养流程参见图1。
42.（2）构建微生物胞外高级氧化体系，实现受多环芳烃污染土壤的高效原位修复微生物胞外高级氧化体系的具体构建方法如下:
①
将制备好的高效降解多环芳烃复合菌系与与受多环芳烃污染的土壤充分混合；所述土壤为0-20cm且充分破碎的表层土壤，土壤ph调节为7.0-7.5，孔隙度为55%-65%，具有良好的通气、通水和保水性能；所述土壤含水率保持含水率保持15%-45%；
②
调节高效降解多环芳烃复合菌系中pseudomonas 菌属的菌浓度为108/kg土壤；
③
调节微量外源共代谢有机质浓度，使多环芳烃与微量外源共代谢有机质的质量比为100:1；微量外源共代谢有机质采用葡萄糖；
④
调节外源常量元素及微量元素，常量元素采用30g/l的cacl2、25g/l的mgso4、30g/l的fecl3，其添加比例均为土壤重量：投加量=1000:1；微量元素采用0.05g/l的h3bo3、0.05g/l的zncl2、0.05g/l的cucl2、0.05g/l的mnso4、0.05g/l的(nh4)6mo7o
24
、0.05g/l的alcl3、0.05g/l的cocl2及0.05g/l的nicl2，其添加比例均为土壤重量：投加量=10000:1；
⑤
经过上述调节后，使微生物胞外高级氧化体系氧化还原电位大于+300 mv。
43.实施例4一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其包括如下步骤：（1）培养高效降解多环芳烃复合菌系高效降解多环芳烃复合菌系是指从受多环芳烃污染的油田土壤中富配而成的复合菌群。实施例中采用的土壤采集地点为石油开采井场周边土地，该场地常年受石油开采影响，土壤中可检测出多种多环芳烃，且多为盐碱地。挖取井场周边地区表层0-10cm、表面呈棕色或深褐色、结构疏松及无明显沙质感的土壤。油田土壤取回后，因其中含有大量的无机颗粒，需在培养前进行预处理。
44.土壤培养前预处理的措施如下：将土壤置于容器中，用盐水浸润，并置于超声波清洗仪器中低功率震荡，以富集土壤颗粒上的微生物；超声震荡结束后，将土壤悬浊液混匀，快速的倒入50ml离心管中，多次漩涡并将上层悬浊液倒入另一个干净的离心管中；如此反复多次，直至所有悬浊液都转入干净的离心管中；将上述转移后的离心管置于离心机中，低
温低速离心；离心结束后，离心管倒去上清液后的沉淀物作为预处理后的油田土壤转移至干净的容器中备用。
45.上述盐水盐度为1.2%；超声波功率为550w；震荡时间为9min；低温低速离心的温度为4.5℃，转速为2200r/min，离心时间为11min。
46.关于高效降解多环芳烃复合菌系的具体培养方法简介如下:
①
配制高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基：称取多环芳烃萘、蒽、芘分别溶于有机溶剂中，制成萘-有机溶剂溶液、蒽-有机溶剂溶液、芘-有机溶剂溶液；吸取5ml多环芳烃-有机溶剂溶液加入至装有100ml人工海水培养基的无菌锥形瓶中，使得多环芳烃-有机溶剂的终浓度为500mg/l，静置13h。待瓶中有机溶剂完全挥发后，形成高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基。配制时，称取萘、蒽、芘的重量均为0.06g，分别溶于有机溶剂中，制成10g/l的混合液；有机溶剂选用丙酮。
47.②
将高效降解多环芳烃复合菌系置于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中进行富集纯化培养：在超净台中用无菌称取约1-2g预处理后的土壤样品于灭菌离心管中，后按无菌操作将土壤完全移至高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中，在28℃温度下恒温振荡富集培养多环芳烃降解菌；培养三周之后进行两方面的操作：一方面将富集的菌悬液进行梯度稀释，使用含盐全营养固体培养基进行平板涂布并恒温培养，另一方面将富集的菌悬液再次接种于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中再次富集培养；两周之后将富集培养的菌悬液按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；两周之后再次按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；重复培养结束后，固体培养基上所得单菌落细菌根据菌落形态进行分离纯化，得到能够在高盐环境下降解多环芳烃的纯种细菌；
③
纯种细菌的保存：将纯种细菌以保种液保存于-80℃。
48.高效降解多环芳烃复合菌系的培养流程参见图1。
49.（2）构建微生物胞外高级氧化体系，实现受多环芳烃污染土壤的高效原位修复微生物胞外高级氧化体系的具体构建方法如下:
①
将制备好的高效降解多环芳烃复合菌系与与受多环芳烃污染的土壤充分混合；所述土壤为0-20cm且充分破碎的表层土壤，土壤ph调节为7.0-7.5，孔隙度为55%-65%，具有良好的通气、通水和保水性能；所述土壤含水率保持含水率保持20%-30%；
②
调节高效降解多环芳烃复合菌系中pseudomonas 菌属的菌浓度为109/kg土壤；
③
调节微量外源共代谢有机质浓度，使多环芳烃与微量外源共代谢有机质的质量比为130:1；微量外源共代谢有机质采用葡萄糖；
④
调节外源常量元素及微量元素，常量元素采用30g/l的cacl2、25g/l的mgso4、30g/l的fecl3，其添加比例均为土壤重量：投加量=1000:1；微量元素采用0.05g/l的h3bo3、0.05g/l的zncl2、0.05g/l的cucl2、0.05g/l的mnso4、0.05g/l的(nh4)6mo7o
24
、0.05g/l的alcl3、0.05g/l的cocl2及0.05g/l的nicl2，其添加比例均为土壤重量：投加量=10000:1；
⑤
经过上述调节后，使微生物胞外高级氧化体系氧化还原电位大于+300 mv。
50.实施例5一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其包括如下步骤：
（1）培养高效降解多环芳烃复合菌系高效降解多环芳烃复合菌系是指从受多环芳烃污染的油田土壤中富配而成的复合菌群。实施例中采用的土壤采集地点为石油开采井场周边土地，该场地常年受石油开采影响，土壤中可检测出多种多环芳烃，且多为盐碱地。挖取井场周边地区表层0-10cm、表面呈棕色或深褐色、结构疏松及无明显沙质感的土壤。油田土壤取回后，因其中含有大量的无机颗粒，需在培养前进行预处理。
51.土壤培养前预处理的措施如下：将土壤置于容器中，用盐水浸润，并置于超声波清洗仪器中低功率震荡，以富集土壤颗粒上的微生物；超声震荡结束后，将土壤悬浊液混匀，快速的倒入50ml离心管中，多次漩涡并将上层悬浊液倒入另一个干净的离心管中；如此反复多次，直至所有悬浊液都转入干净的离心管中；将上述转移后的离心管置于离心机中，低温低速离心；离心结束后，离心管倒去上清液后的沉淀物作为预处理后的油田土壤转移至干净的容器中备用。
52.上述盐水盐度为1.5%；超声波功率为600w；震荡时间为10min；低温低速离心的温度为5℃，转速为2500r/min，离心时间为12min。
53.关于高效降解多环芳烃复合菌系的具体培养方法简介如下:
①
配制高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基：称取多环芳烃萘、蒽、芘分别溶于有机溶剂中，制成萘-有机溶剂溶液、蒽-有机溶剂溶液、芘-有机溶剂溶液；吸取5ml多环芳烃-有机溶剂溶液加入至装有100ml人工海水培养基的无菌锥形瓶中，使得多环芳烃-有机溶剂的终浓度为500mg/l，静置14h。待瓶中有机溶剂完全挥发后，形成高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基。配制时，称取萘、蒽、芘的重量均为0.07g，分别溶于有机溶剂中，制成10g/l的混合液；有机溶剂选用丙酮。
54.②
将高效降解多环芳烃复合菌系置于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中进行富集纯化培养：在超净台中用无菌称取约1-2g预处理后的土壤样品于灭菌离心管中，后按无菌操作将土壤完全移至高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中，在28℃温度下恒温振荡富集培养多环芳烃降解菌；培养三周之后进行两方面的操作：一方面将富集的菌悬液进行梯度稀释，使用含盐全营养固体培养基进行平板涂布并恒温培养，另一方面将富集的菌悬液再次接种于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中再次富集培养；两周之后将富集培养的菌悬液按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；两周之后再次按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；重复培养结束后，固体培养基上所得单菌落细菌根据菌落形态进行分离纯化，得到能够在高盐环境下降解多环芳烃的纯种细菌；
③
纯种细菌的保存：将纯种细菌以保种液保存于-80℃。
55.高效降解多环芳烃复合菌系的培养流程参见图1。
56.（2）构建微生物胞外高级氧化体系，实现受多环芳烃污染土壤的高效原位修复微生物胞外高级氧化体系的具体构建方法如下:
①
将制备好的高效降解多环芳烃复合菌系与与受多环芳烃污染的土壤充分混合；所述土壤为0-20cm且充分破碎的表层土壤，土壤ph调节为7.0-7.5，孔隙度为55%-65%，具有良好的通气、通水和保水性能；所述土壤含水率保持含水率保持20%-30%；
②
调节高效降解多环芳烃复合菌系中pseudomonas 菌属的菌浓度为107/kg土壤；
③
调节微量外源共代谢有机质浓度，使多环芳烃与微量外源共代谢有机质的质量比为150:1；微量外源共代谢有机质采用葡萄糖；
④
调节外源常量元素及微量元素，常量元素采用30g/l的cacl2、25g/l的mgso4、30g/l的fecl3，其添加比例均为土壤重量：投加量=1000:1；微量元素采用0.05g/l的h3bo3、0.05g/l的zncl2、0.05g/l的cucl2、0.05g/l的mnso4、0.05g/l的(nh4)6mo7o
24
、0.05g/l的alcl3、0.05g/l的cocl2及0.05g/l的nicl2，其添加比例均为土壤重量：投加量=10000:1；
⑤
经过上述调节后，使微生物胞外高级氧化体系氧化还原电位大于+300 mv。
57.本发明从受多环芳烃污染的土壤样品中经过上述方案分离出的pseudomonas 菌属具有降解多环芳烃污染物和原位生成过氧化氢等强氧化剂的双重作用。因此，构建微生物胞外高级氧化体系时，要以活性分子（过氧化氢和羟基自由基）的浓度及土壤中多环芳烃的种类及浓度菌剂浓度为参数优化依据，保证酶催化产h2o2的稳定性和高效性。本发明的降解多环芳烃复合菌剂包括可以降解多种多环芳烃的复合菌群，可高效降解的多环芳烃包括萘、蒽、芘、菲等单一或多种多环芳烃混合污染物。
58.采用本发明方法，通过从受多环芳烃污染的土壤中获得高效降解多环芳烃的复合菌系，利用微生物胞外高级氧化体系，可实现多种多环芳烃的高效、快速降解，其萘、蒽、芘可在72h内分别达到98%、92%、87%去除率，其处理效果如图2所示。
59.对比例为了进一步探究微生物胞外高级氧化体系对多环芳烃削减潜力，挖取适量的井场周边土壤，利用土壤中的土著菌群对同种多环芳烃采取常规的原位生物降解实验。研究发现，土壤中的土著菌群对萘、蒽、芘也具有削减能力，但其削减效能和降解速率远低于微生物胞外高级氧化体系，其在72h时对三种多环芳烃的去除率分别为12%、8%、7.8%，为探究其“生化极限”，又将实验延长至480h，其去除率分别提高至47%、32%、28%，其处理效果如图3所示。

技术特征：
1.一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）培养高效降解多环芳烃复合菌系；所述高效降解多环芳烃复合菌系是指从受多环芳烃污染的油田土壤中富配而成的复合菌群；（2）构建微生物胞外高级氧化体系，实现受多环芳烃污染土壤的高效原位修复。2.根据权利要求1所述的一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述步骤（1）油田土壤是指挖取井场周边地区表层0-10cm、表面呈棕色或深褐色、结构疏松及无明显沙质感的土壤；油田土壤取回后进行培养前预处理。3.根据权利要求2所述的一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述土壤培养前预处理的措施如下：将土壤置于容器中，用盐水浸润，并置于超声波清洗仪器中低功率震荡；超声震荡结束后，将土壤悬浊液混匀，快速的倒入离心管中，多次漩涡并将上层悬浊液倒入另一个干净的离心管中；如此反复多次，直至所有悬浊液都转入干净的离心管中；将上述转移后的离心管置于离心机中，低温低速离心；离心结束后，离心管倒去上清液后的沉淀物作为预处理后的油田土壤转移至干净的容器中备用。4.根据权利要求3所述的一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述盐水盐度为0.5%-1.5%；所述超声波功率为300-600w；所述震荡时间为5-10min；所述低温低速离心的温度为3-5℃，转速为1500-2500r/min，离心时间为8-12min。5.根据权利要求4所述的一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述盐水盐度为1%；所述超声波功率为500w；所述震荡时间为8min；所述低温低速离心的温度为4℃，转速为2000r/min，离心时间为10min。6.根据权利要求3所述的一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述步骤（1）高效降解多环芳烃复合菌系的培养方法如下:
①
配制高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基：称取多环芳烃萘、蒽、芘分别溶于有机溶剂中，制成萘-有机溶剂溶液、蒽-有机溶剂溶液、芘-有机溶剂溶液；吸取多环芳烃-有机溶剂溶液加入至装有人工海水培养基的无菌锥形瓶中，使得多环芳烃-有机溶剂的终浓度为500mg/l，静置10-14h；待瓶中有机溶剂完全挥发后，形成高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基；
②
将高效降解多环芳烃复合菌系置于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中进行富集纯化培养：在超净台中用无菌称取预处理后的土壤样品于灭菌离心管中，后按无菌操作将土壤完全移至高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中，在28℃温度下恒温振荡富集培养多环芳烃降解菌；培养三周之后进行两方面的操作：一方面将富集的菌悬液进行梯度稀释，使用含盐全营养固体培养基进行平板涂布并恒温培养，另一方面将富集的菌悬液再次接种于高盐的以多环芳烃为唯一碳源的液体培养基中再次富集培养；两周之后将富集培养的菌悬液按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；两周之后再次按照上述方法重复进行固体培养基培养和液体培养基培养；重复培养结束后，固体培养基上所得单菌落细菌根据菌落形态进行分离纯化，得到能够在高盐环境下降解多环芳烃
的纯种细菌；
③
纯种细菌的保存：将纯种细菌以保种液保存于-80℃。7.根据权利要求6所述的一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述有机溶剂为丙酮或乙腈。8.根据权利要求1所述的一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述步骤（2）微生物胞外高级氧化体系的构建方法如下:
①
将制备好的高效降解多环芳烃复合菌系与与受多环芳烃污染的土壤充分混合；所述土壤为0-20cm且充分破碎的表层土壤，土壤ph调节为7.0-7.5，孔隙度为55%-65%，具有良好的通气、通水和保水性能；所述土壤含水率保持15%-45%；
②
调节高效降解多环芳烃复合菌系中pseudomonas 菌属的菌浓度为10
6-109/kg土壤；
③
调节微量外源共代谢有机质浓度，使多环芳烃与微量外源共代谢有机质的质量比为（50:1）-（150:1）；
④
调节外源常量元素及微量元素，常量元素采用30g/l的cacl2、25g/l的mgso4、30g/l的fecl3，其添加比例均为土壤重量：投加量=1000:1；微量元素采用0.05g/l的h3bo3、0.05g/l的zncl2、0.05g/l的cucl2、0.05g/l的mnso4、0.05g/l的(nh4)6mo7o
24
、0.05g/l的alcl3、0.05g/l的cocl2及0.05g/l的nicl2，其添加比例均为土壤重量：投加量=10000:1；
⑤
经过上述调节后，使微生物胞外高级氧化体系氧化还原电位大于+300 mv。9.根据权利要求8所述的一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述多环芳烃与微量外源共代谢有机质的质量比为100:1，微量外源共代谢有机质采用葡萄糖或乙酸钠。10.根据权利要求8所述的一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其特征在于，所述土壤含水率保持20%-30%；所述pseudomonas菌属的菌浓度为107/kg土壤。

技术总结
本发明涉及土壤污染修复技术领域，公开了一种利用微生物胞外高级氧化体系高效削减油田土壤多环芳烃污染物的方法，其包括如下步骤：（1）培养高效降解多环芳烃复合菌系；（2）构建微生物胞外高级氧化体系：将制备好的高效降解多环芳烃复合菌系与与受多环芳烃污染的土壤充分混合，合理调节高效降解多环芳烃复合菌系中Pseudomonas菌属的菌浓度、微量外源共代谢有机质浓度、外源常量元素及微量元素。本发明通过从受多环芳烃污染的土壤中获得高效降解多环芳烃的复合菌系，并构建微生物胞外高级氧化体系，对土壤中多环芳烃难降解有机污染物进行高效原位削减，实现油田污染土壤的彻底无害化修复。害化修复。害化修复。


技术研发人员：王晓慧 宋春燕 张琼 时宪 杜海鹏 张卫东 张彦博 孙敬伟 张楠 李媛 孟照瑜 刘晓
受保护的技术使用者：中国石油化工股份有限公司胜利油田分公司技术检测中心 胜利油田检测评价研究有限公司
技术研发日：2022.01.06
技术公布日：2023/7/22