T细胞受体、包含T细胞受体的免疫细胞及其使用方法与流程

t细胞受体、包含t细胞受体的免疫细胞及其使用方法
技术领域
1.本发明涉及t细胞受体、包含t细胞受体的nk细胞及其使用方法。


背景技术：

2.截至2018年，癌症治疗的细胞疗法已经在市场上用于利用axicabtagene ciloleucel、tisagenlecleucel、immuncell-lc等进行的癌症治疗，其是由gilead、novartis和molmed开发的血癌疗法，以及已经进入2/3期的细胞疗法也正在进行临床试验。超过50％的全细胞疗法开发是在北美(usa)进行的(截至2018年为344例)，很大一部分研究也在中国进行(203例)。
3.各种类型的细胞疗法(例如适用于识别和激活癌细胞表面的car-t，tcr修饰的tcr-t，识别肿瘤抗原的自体t细胞和til)已经开发出来并正在进行临床前和临床研究。特别是，靶向cd19的细胞疗法开发最多，其次是taa/tsa、bcma、gd2、her2等。cd19几乎只是一种进入市场的细胞疗法，目前大多数临床和临床前研究都在进行ind过程。
4.将细胞疗法与目前使用的免疫检查点抑制剂进行比较时，免疫疗法局限性在于，既然因为肿瘤中缺乏t细胞，以及在肿瘤中的t细胞中，靶向肿瘤抗原的t细胞不到5％，从而导致免疫检查点抑制剂的疗效不是充分的。因此，可以密集攻击肿瘤的细胞疗法具有增殖和仅利用靶向肿瘤的免疫细胞的优势。
5.肺癌在世界范围内具有很高的死亡率，尤其是在亚洲肺癌患者中，egfr突变肿瘤高达50％，其中27％为l858r突变。egfr突变的特点是egfr靶向疗法的效果开始时很好，但8-10个月后，大部分患者具有获得耐受，获得耐受后再无疗法。特别是，由于已知与免疫检查点抑制剂的联合治疗没有效果，因此有必要开发新的疗法。
6.因此，需要一种专门靶向指示这些肿瘤生长的关键遗传损伤的疗法。
7.准备本发明的背景技术以进一步促进对本发明的理解。不应理解为本发明的背景技术中描述的事项作为现有技术存在。


技术实现要素：

【技术问题】
8.同时，自然杀伤细胞(nk细胞)是构成先天免疫系统主要组成部分的细胞毒性淋巴细胞。通常占循环淋巴细胞的约10％至15％的nk细胞对抗原无特异性，可以在没有预先免疫致敏的情况下靶向并结合包含病毒感染的细胞的许多恶性细胞(malignant cell)，此外，可以杀死恶性细胞。此时，靶细胞的死亡可能是由诱导细胞溶解引起的。
9.因此，出于治疗目的，从受试者的外周血淋巴细胞中分离出nk细胞，并且分离的nk细胞通过细胞培养大量获得的方法再次使用并且然后再注射到受试者中。这种nk细胞疗法，即离体和体内注射治疗，通过在感染细胞或肿瘤细胞中诱导高效细胞死亡而备受关注。然而，nk细胞注射疗法存在局限性，受限于靶点。
10.因此，本发明人关注通过基因改造的nk细胞以克服该局限性。更具体地说，传统的
基于nk细胞的细胞疗法建立了策略，例如通过fc受体的表达来诱导抗体依赖性细胞毒性反应或通过嵌合抗原受体的表达来靶向癌症。然而，这些策略在治疗实体瘤方面并不是很有效。
11.因此，为了克服上述实体瘤治疗的局限性，本发明人关注了对特定抗原特异的t细胞受体，并由此试图增强nk细胞对实体瘤的靶向性。
12.最终，本发明人确定了一种能够识别实体瘤特定分子突变的t细胞受体，并修饰了一个在nk细胞(nk-92)和细胞系中表达的基因，从而增强了nk细胞对实体瘤的靶向性。
13.此外，本发明人认识到，当上述nk细胞中进一步包含fc受体时，可以进一步改善针对靶向实体瘤的免疫应答。因此，本发明人开发了通过包含t细胞受体和fc受体而提高了对实体瘤的靶向性及其抗癌作用的nk细胞。
14.更具体地，本发明人基于癌症患者的wes和rna seq结果确定了显示抗原预测率为90％或更高的分析平台。此时，应用于分析的算法基于net-mhc算法通过neopepsee识别候选抗原。接下来，通过合成预测抗原并在dc和cd8 t细胞中处理抗原来进行验证抗原的过程。
15.因此，发现了能够识别l858r抗原的主要hla-a等位基因。因此，可以预测，针对a*33:03的hvkitdfgr抗原不仅具有高结合亲和力，而且基于neopepsee提供的10个或更多参数可以充分发挥抗原的作用。
16.在此基础上，建立了一个能够预测肿瘤特异性抗原的验证平台，以确认对抗原的反应。验证平台通过区分与hla-a匹配的正常受试者的树突状细胞(dc)和外周血单核细胞(pbmc)来识别抗原，并在此基础上测量对l858r的抗原反应。
17.结果，如前所述，在具有识别l858r的hla-a的患者中产生了对肿瘤特异性反应的t细胞，并且确认了对抗原(ifn-γelispot)的反应。
18.此外，证实了通过上述过程鉴定的t细胞的tcr可以在免疫细胞中表达。
19.本发明致力于通过为t细胞或nk-92细胞提供靶向在癌细胞表面上增加的mhc-1-l858r新抗原复合物的tcr来直接杀死癌细胞的egfr突变体靶向细胞疗法。
20.本发明还致力于通过以下方式来提供对癌细胞的杀伤功能进一步改善的细胞疗法：在具有上述tcr的t细胞或nk-92细胞中进一步包含fc受体以进一步改善对肿瘤细胞的免疫应答。
21.此外，由于上述hla-a中亚洲人的比例为20％或更多，预计具有egfr突变的相当数量的患者将受益于本发明。
22.本发明的目的不限于上述目的，本领域的技术人员根据以下的说明，能够明确上述未提及的其他目的。【技术方案】
23.根据本发明的一个实施例，提供了一种t细胞受体，其包括：
24.(i)t细胞受体(tcr)α链可变区的互补决定区(cdr)3，其包括氨基酸序列cafighggsqgnlif(seq id no:1)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassmqgamseqff(seq id no:13)或其变体，(ii)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列caatgtykyif(seq id no:2)或其
变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列casspefaraldnqpqhf(seq id no:14)或其变体，(iii)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列caygggseklvf(seq id no:3)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列casssatgtqgytf(seq id no:15)或其变体，(iv)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列calinarlmf(seq id no:4)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassftntgelff(seq id no:16)或其变体，(v)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cavnggsqgnlif(seq id no:5)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassmwqgngeqyf(seq id no:17)或其变体，(vi)tcrα链可变区的cdr3，其包括氨基酸序列camregyggatnklif(seq id no:6)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassvgpgttsyneqff(seq id no:18)或其变体，(vii)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列caynngdggsqgnlif(seq id no:7)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列catsrdrstdtqyf(seq id no:19)或其变体，(viii)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列catdggsarqltf(seq id no:8)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列casslglsgytf(seq id no:20)或其变体，(ix)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列catlyntdklif(seq id no:9)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr3，其包括氨基酸序列cassqsmnteaff(seq id no:21)或其变体，(x)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列camrgpwrgssgsarqltf(seq id no:10)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列casrtglsyeqyf(seq id no:22)或其变体，(xi)tcrα链可变区的cdr3，其包括氨基酸序列calsvrgfktsydkvif(seq id no:11)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassfgsayneqff(seq id no:23)或其变体，或
(xii)tcrα链可变区的cdr3，其包括氨基酸序列cavnmmdssyklif(seq id no:12)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassfptarsnteaff(seq id no:24)或其变体。
25.根据本发明的特征，所述t细胞受体能够结合被包含在由hvkitdfgr(seq id no:49)表示的氨基酸序列或其mhc结合形式中的表位，并且所述表位可以与hla-a*33:03和hla-a*31:01中的至少一种具有结合亲和力。
26.根据本发明的另一特征，所述t细胞受体可以靶向egfr l858r突变。
27.根据本发明的又一特征，所述tcrα链可变区可以由通过seq id no：55表示的氨基酸序列组成，并且所述seq id no：55可以包括由seq id no：1表示的氨基酸序列。
28.根据本发明的又一特征，所述tcrα链可变区可以由通过seq id no：57表示的氨基酸序列组成，以及所述seq id no：57可以包括由seq id no：2表示的氨基酸序列。
29.根据本发明的又一特征，所述tcrβ链可变区可以由通过seq id no：56表示的氨基酸序列组成，以及所述seq id no：56可以包括由seq id no：13表示的氨基酸序列。
30.根据本发明的又一特征，所述tcrβ链可变区可以由通过seq id no：58表示的氨基酸序列组成，以及所述seq id no：58可以包括由seq id no：14表示的氨基酸序列。
31.根据本发明的又一特征，所述t细胞受体可以是单链型，但是不受限于此。
32.根据本发明的又一特征，所述tcrα链可变区和所述tcrβ链可变区可以通过接头序列相互连接。
33.根据本发明的又一特征，提供了一种编码根据上述内容所述的t细胞受体的核酸。
34.根据本发明的又一特征，所述核酸可以包括至少一种由seq id no：51至54表示的核酸序列；或者与至少一个由seq id no:51至54表示的核酸序列具有至少80％或更多同一性的核酸序列。
35.此时，所述seq id no：51和53可以指编码tcrα链可变区的核酸序列，其中所述seq id no：52和54是编码tcrβ链可变区的核酸序列。
36.根据本发明的又一特征，所述核酸可以还包含：弗林蛋白酶、2a和ires序列，但不限于此。
37.根据本发明的又一个方面，提供了一种载体，其包含根据前述内容所述的任一项所述的核酸。
38.此时，所述载体可以是表达载体，并且可以是慢病毒载体，但不限于此，并且可以包括可以用于本技术领域中的所有表达载体。
39.根据本发明的一特征，所述载体可以包括由seq id no：50表示的核酸序列；或者与由seq id no:50表示的核酸序列具有至少80％或更多同一性的核酸序列。
40.根据本发明的又一方面，提供了一种免疫细胞，其包含根据上述内容所述的t细胞受体。
41.此时，免疫细胞可以包括根据前述内容所述的tcr、核酸和载体，并且可以是nk-92细胞。也就是说，免疫细胞可以是通过包括根据前述内容所述的tcr、核酸和载体而表达tcr的nk-92。
42.此外，免疫细胞可以是nk-92细胞，但不限于此，并且可以包括可以通过插入tcr修
饰的所有各种免疫细胞。
43.根据本发明的又一方面，提供了一种细胞疗法，其包括包含t细胞受体的免疫细胞。
44.根据本发明的一个特征，细胞疗法还可以包括效应t细胞。
45.根据本发明的另一个特征，细胞疗法可以是实体瘤疗法，但不限于此，并且可以是针对所有癌的疗法，其包括根据本发明的一个实施方案的由seq id no:49表示的hvkitdfgr抗原。
46.在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不限于这些实施例。【有益效果】
47.可以提出本发明作为具有获得性耐受的肿瘤的新疗法。更具体而言，传统的肺癌治疗最初是有效的，但在8到10个月后，大多数患者会出现获得性耐受。然而，对此没有替代疗法。
48.因此，可以提出本发明作为能够克服这些局限性的新疗法。此外，本发明具有靶向和治疗携带egfr突变和获得性耐受的作用。
49.此外，与具有半衰期的药物不同，本发明具有通过以下方式来增加对肿瘤的杀伤作用的效果：经由初始激活t细胞来增加其他免疫反应。
50.更具体地，本发明诱导记忆t细胞的分化和增殖以避开癌细胞的防御机制，从而治疗癌症或肿瘤病症并防止复发、进展和转移。
51.此外，本发明具有与传统疗法如tki和pd-1/pd-l1并行增加每种药物的作用的效果，从而提高患者的存活率。
52.本发明的效果不限于如上所述，在此预期其他各种效果。
附图说明
53.图1示出了用于预测癌症患者的抗原的系统以及基于该系统制备tcr-t或tcr-nk细胞的方法。
54.图2示出了用于验证用neopepsee预测的抗原的过程的示例。
55.图3示出了通过验证平台分析的抗原特异性t细胞的验证结果。
56.图4a和4b示出了hla-a和抗原序列靶向l858r的结果。
57.图5a至5d示出了肿瘤特异性t细胞特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的结果。
58.图6示出了对抗原(egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体)具有特异性诱导活性的t细胞的溶细胞因子的结果。
59.图7示出了对抗原具有特异性诱导活性的t细胞受体的分布图(egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体)。
60.图8示出了nk-92细胞系在t瓶中培养时的结果。
61.图9示出了根据fbs和il-2的浓度的nk-92增殖效率的结果。
62.图10示出了根据培养方法的nk-92细胞系的细胞增殖效率的结果。
63.图11a和11b示出了根据培养条件的nk-92细胞系和表达fc受体的nk-92细胞系的
激活因子和毒性因子的结果。
64.图12示出了根据蛋白质表达启动子的nk-92细胞的gfp表达效率的结果。
65.图13a和13b示出了趋化因子受体在nk-92细胞中的表达结果。
66.图14a和14b示出了cd3分子和t细胞受体分子在nk-92细胞中的表达结果。
67.图15a是根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的慢病毒载体图谱。
68.图15b是根据本发明的实施方案的cd3分子和表达tcr序列t细胞受体的核酸序列示意图。
69.图16a和16b示出了根据本发明的实施方案的确认tcr的细胞活性的结果。
70.图17a和17b示出了根据本发明的实施方案验证对包含tcr的nk细胞的细胞溶解作用的结果。
71.图18是确认包含根据本发明实施方案的tcr的nk细胞的肿瘤抑制效果的结果。
具体实施方式
72.本发明的优点、特征及其实现方法，通过以下参照附图详细说明的实施方案，将会更加清楚明白。然而，本发明不限于以下阐述的实施方案，而是将以各种不同的形式实施。这些实施方案只是为了使本发明的公开完整，并且被阐述以使本发明所属领域的普通技术人员能够完整地理解本发明的范围，并且本发明仅将由权利要求的范围限定。如本文所使用的，术语“t细胞受体(tcr)”不仅包括天然tcr，还包括tcr变体、片段和构建体。因此，tcr包括多聚体和单链结构以及包含tcrα和β链的异二聚体，其任选地包括额外的结构域和/或部分(moiety)。
73.如本文所使用的，术语“表位”通常是指抗原上被结合结构域识别的位点，通常是(多)肽。此时，结合结构域是指抗原结合位点。也就是说，结合结构域是指结合抗原靶标的特定表位并与之相互作用的分子的结构域。
74.如本文所使用的，术语“自然杀伤细胞(nk细胞)”是免疫系统的一种细胞，其在没有特异性抗原刺激的情况下杀死靶细胞，不受主要组织相容性复合体(mhc)类别的限制。靶细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。nk细胞的特征在于存在cd56和不存在cd3表面标记。因此，将通过人工插入cd3-γ(gamma)、δ(delta)、ζ(zeta)等进行研究。
75.如本文所使用的，术语“载体”是指含有完整复制子的非染色体核酸，使得载体在通过转化过程位于允许细胞中时可以复制。载体可以在细菌中复制，但在哺乳动物细胞中的复制能力可能有限，并且可以是病毒或非病毒的。用于递送核酸的非病毒载体包括裸dna、与阳离子脂质单独复合或与阳离子脂质结合阳离子聚合物复合的dna、阴离子和阳离子脂质体、包含在脂质体中的阳离子聚合物、异源聚赖氨酸、确定长度的寡肽、包括与聚乙烯胺缩合的dna的dna蛋白质复合物，以及包含颗粒、病毒和聚赖氨酸dna的三元复合物。
76.如本文所使用的，术语“免疫细胞”可包括t细胞、自然杀伤t细胞(nkt)、自然杀伤细胞(nk)、人胚胎干细胞和造血干细胞(hsc)以及诱导多能干细胞(ips)。此时，t细胞可以是细胞毒性t细胞(ctl)、调节性t淋巴细胞、炎性t淋巴细胞、辅助性t淋巴细胞和γ-δt细胞、先天性淋巴细胞(ilc1、ilc2)，进一步，上述t细胞可以是cd4+、cd8+及其混合群。
77.如本文所使用的，术语“人类白细胞抗原(hla)”是指在负责调节免疫系统的细胞的表面上编码主要组织相容性复合体(mhc)蛋白的人类基因。
78.如本文所使用的，术语“树突细胞(dc)”是指在淋巴组织或非淋巴组织中发现的形态相似的细胞类型的不同群体的成员。这些细胞的特征在于其独特的形态和表面mhc i类和ii类分子的高表达水平，这些分子是将抗原肽呈递给t细胞的蛋白质。包括dc和t细胞在内的apc(巨噬细胞等)可以方便地从外周血和许多组织中分离或衍生和分化，例如从外周血衍生的外周血单核细胞(pbmc)。
79.如本文所使用的，术语“治疗”可包括但不限于改善或有益于癌症症状的任何活动。
80.如本文所使用的，术语“特异(性)结合”通常是指tcr通过其抗原结合位点比随机无关的非靶抗原更容易结合其所需的抗原靶标。此外，“特异性结合”可以指tcr与其抗原靶标的结合特异性可以是其与非靶抗原的结合特异性的至少约5倍，优选10倍，更优选25倍，甚至更优选50倍，最优选至少100倍。抗原预测和验证过程
81.在下文中，将参考图1至3b描述通过neopepsee的抗原预测和验证过程。
82.图1示出了用于预测癌症患者的抗原的系统以及基于该系统制备tcr-t或tcr-nk细胞的方法。例如，通过rna测序、全外显子组测序和正常血液中参考wes从患者肿瘤中获得患者肿瘤的体细胞突变后，来自患者的单核细胞分化为树突状细胞，通过经由暴露从先前鉴定的突变基因中鉴定出的表位的抗原呈递来增殖t细胞，确认增殖的t细胞的反应性，根据确认的反应，通过对t细胞进行tcr测序，得到tcr的cdr3序列，然后，通过包含该序列的基因递送载体将t细胞修饰为肿瘤特异性细胞。因此，可以生成和验证基于自体t细胞或nk-92细胞的细胞疗法。
83.更具体地，首先，应该最早进行抗原预测，以开发针对肿瘤或细胞疗法的疫苗。基于通过肿瘤全外显子组测序(wes)获得的异常突变蛋白的表达以及通过rna seq获得的突变抗原来验证抗原预测。当肿瘤抗原与mhc-1之间的亲和力增加时，可能意味着有可能成为可被免疫细胞识别的抗原。在该研究中，neopepsee被用作抗原分析的分析管道。
84.之后，用9个氨基酸合成/纯化95％以上纯度的预测抗原的肽，以dmso(该dmso最常用于溶解将分化成成熟的dc抗原)为溶剂，用lps暴露于树突状细胞，然后进行t细胞的培养。
85.然后，根据ifn-γ的表达水平进行验证。
86.作为现有的能够分析抗原的验证平台，最常用pvac seq，以及基于linux和python程序的开放分析平台。作为该程序的核心算法，可以量化称为netmhc-pan的hla-a的结合亲和力，并且pvac seq还包括通过rna seq的肿瘤抗原的表达水平。neopepsee还包括相同的算法，并包括12个附加参数以显示更高级的分析平台。neopepsee是一种分析平台，其即使在以前报告的抗原搜索程序之间的基准分析中也能获得优异的结果。neopepsee是最近在学术期刊上发表的开源程序和分析技术。
87.因此，本课题组进行了以egfr突变患者为对象的实验，其中确定l858r和e19del中有无突变。
88.参考图1，首先，使用匹配的正常血液作为患者肿瘤中wes的参考以及wes中的种系突变或snv进行分析。用于确定wes中是否存在突变的工具是gatk2管道，并根据hg38的映射数据进行分析。
89.取患者血液50ml，根据ifng elispot数据，通过血液中存在的dc中的t细胞验证抗原的识别率。
90.然后，当计算机中呈现的候选抗原的验证完成时，分析t细胞的tcr seq以验证能够最好地识别肿瘤抗原的主要tcr。
91.接下来，通过验证t细胞的tcr seq构建针对cdr3的重组tcr，以产生能够特异性识别自体/同种异体t细胞和nk-92细胞中抗原的细胞疗法，并验证细胞疗法。
92.图2示出了用于验证用neopepsee预测的抗原的过程的示例。此时，整个抗原验证过程需要大约21天，这是能够在相当短的时间内从患者的pbmc验证对肿瘤有特异性反应的抗原的平台。用neopepsee预测的抗原与合成来自由cd14分化的idc的9-mer肽抗原一起分化为mdc，并且分化的dc与t细胞共培养，然后增殖为抗原特异性t细胞，并基于ifn-γ的表达水平进行验证。在每个步骤中，指出了细胞疗法开发的10个重要步骤，并指定了qc点。
93.更具体地，参考图2，首先，第一天，从患者血液中分离出pbmc。此时，用于分离pbmc的方案是能够获得血液中的淋巴细胞和单核细胞的方法，而cd14阳性细胞(即单核细胞)可以通过磁体和抗体-微珠法获得。
94.然后，cd14+细胞经历分化成dc的过程。此时，使用gm-csf和il-4诱导向imdc的分化。
95.接下来，cd8+细胞以同样方式从cd14-中取出，在-80℃保存，然后在能够呈递抗原的imdc进行共培养。
96.然后，在第7天和第8天，将细胞与10ug/ml先前合成的肿瘤抗原一起用lps处理并培养16小时以充分识别dc中的肿瘤抗原。
97.然后，对细胞进行洗涤处理并与cd8阳性细胞一起培养。
98.然后，将dc-cd8+细胞共培养约11天，并在用il-7/il-15处理的专用培养基中培养。
99.然后，对11天后获得的t细胞进行细胞计数，细胞计数完成后，再次处理抗原，通过elispot分析t细胞中表达的ifn-γ的表达。
100.图3示出了验证由验证平台分析的抗原特异性t细胞的结果。此时，为了确认neopepsee的抗原验证能力，在树突状细胞中识别20名患者(hla-a型为a*:24:02患者)的代表性抗原并培养t细胞后，进行elispot验证实验以确认是否真的对肿瘤抗原有反应。结果，确认存在90％以上的抗原验证能力。
101.更具体地说，实验是用a*24.02进行的，它是全球占比最大的hla-a型。对于20名患者，用neopepsee预测每个患者的特异性抗原，并且作为识别dc中总共41种抗原的结果，培养t细胞，然后检查对这些抗原的反应程度，结果是除了41种抗原中的3种之外，对每个肿瘤抗原都有反应。此外，对每种肿瘤抗原的反应可以用抗原的ifn-γ点的数量和表面积(活性)来表示，ifn-γ点的数量越多，抗原的呈递就越好，并且表面积可以表示抗原的ifn-γ的量。此外，通过截断非处理组中t细胞的ifn-γ表达水平确定为阳性。
102.因此，参考图3，正如neopepsee所预测的那样，ifn-γ对抗原的表达预测表明基于ifn-γ的表达具有90％或更高的预测率。对于20名患者，用neopepsee预测了每位患者的特异性抗原，并且作为预测对41种抗原的反应的结果，对肿瘤抗原的反应被确认为90％或更多。
103.综上所述，可以选择具有高预测能力的肿瘤特异性抗原，并以此为基础开发和验证细胞疗法。获得egfr突变肿瘤的特异性抗原
104.在下文中，将参照图4a和4b描述针对egfr突变肿瘤的特异性抗原。
105.图4a和4b示出了hla-a和靶向l858r的抗原序列的结果。
106.参考图4a，通过neopepsee选择了能够识别egfr l858r突变的抗原，制备了egfr l858r突变肽和野生型(wt)肽，并将能够识别egfr l858r突变的抗原应用于12个主要hla-as，并且9到11mer的抗原预测程度通过mhc结合亲和力得到验证。
107.通过上述过程，筛选出hla-a，其包括hla-a*2402、hla-a*0201、hla-a*3303、hla-a*1101、hla-a*0206和hla-a*3101，所有这些具有5％或者更高的频率，并且其中，选择频率为10％或者更高的hla-a*2402、hla-a*0201和hla-a*3303，以从包括egfr l858r突变的总计10个患者样本中提取抗原。
108.因此，参考图4b，总共10个含有egfr l858r突变的患者样本中普遍含有hla-a*3303，不同于hla-a*2402和hla-a*0201，因此选择hla-a*3303以鉴定其抗原。
109.最终，由于hvkitdfgr序列的抗原显示在基于hla-a*3303的患者样本中具有相同的反应(结果)，因此将egfr的l858r突变的靶标抗原选择作为hvkitdfgr。
110.综上所述，可以选择具有高预测能力的肿瘤特异性抗原，并以此为基础开发和验证细胞疗法。t细胞受体(tcr)
111.在下文中，参考图5a至7，将描述能够将特异性抗原靶向至egfr突变肿瘤的tcr。此时，为了鉴定能够将特异性抗原靶向egfr突变肿瘤的tcr，产生了egfr-l858r特异性t细胞，并使用四聚体对产生的t细胞进行分选。此外，通过单细胞rna分析技术分析分离的细胞。
112.更具体地，首先，cd14+阳性细胞从受试者的血液中分离，与egfr-mt抗原(9mer)一起培养以诱导抗原呈递，然后与同一受试者的cd8+阳性细胞共培养14天，并且此后，通过elispot确认egfr-l858r特异性t细胞的存在。此外，在使用四聚体对能够结合egfr-mt 9mer-mhc-1复合物的t细胞进行分选后，通过scrna seq/vdj获得其tcr的序列。
113.首先，参考图5a至5d，将描述对egfrl 858r突变体抗原特异的t细胞的分选过程。
114.图5a是肿瘤特异性t细胞特异性粘附到egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的结果。此时，为了便于描述，将参照图5b到5d描述该过程。此外，从包含a*33:03/a*02.06的受试者中收集样本以用于tcr的鉴定。
115.特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)的肿瘤特异性t细胞为记忆t细胞，其包括cd44+ccr7+中央记忆t细胞(tcm)、cd44+ccr7-效应记忆t细胞(tem)以及tcm和tem混合细胞(cd44+ccr7+/-)。
116.更具体地，参考图5b至5d，示出了图1a中描述的t细胞中细胞活化因子的表达结果。
117.首先，参考图5b，特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)表达cd8a、cd4、cd44和cd62l，它们是成熟的t细胞因子，因此，这可能意味着特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)是成熟的t细胞。
118.接下来，参考5c，特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)表达cd25和cd69，其是细胞激活剂，因此，其可能意味着特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)是激活的效应t细胞。
119.接下来，参考图5d，特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)表达ccr7、ifn-γ和颗粒酶(granzyme)-b.
120.此时，由于ccr7是记忆细胞因子，特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)是记忆t细胞，其可在体内长期存活，并可能引起二次免疫反应。
121.此外，由于ifn-γ和颗粒酶-b是细胞毒性因子，特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)可能意味着能够释放细胞因子的t细胞。
122.因此，根据本发明的实施方案，特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)意味着在对含有l858r突变的肿瘤的体内免疫反应中激活t细胞，因此，可能对含有l858r突变的肿瘤具有抗癌作用。
123.在下文中，将参考图6和7描述对egfr l858r突变抗原特异的t细胞受体(tcr)。此时，通过图5a到5d的过程，基于所选t细胞中溶细胞因子的表达，衍生出对egfr l858r突变体抗原特异的t细胞的受体序列。
124.更具体地说，图6示出了对抗原(egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体)具有特异性诱导活性的t细胞的溶细胞因子的结果。
125.首先，参考图6a，表达特异性粘附egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)中的溶细胞因子的细胞约占约800个细胞总数的10％～15％，约占活化细胞总数的27％。也就是说，当特异性粘附于egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体的肿瘤特异性t细胞(egfr-l858r-a*33:03四聚体阳性t细胞)被激活时，其可能意味着细胞毒性(细胞溶解)因子可能以高速率表达，因此，t细胞可能对肿瘤具有有效的细胞毒性(细胞溶解)作用。
126.因此，参考图6b，仅选择表达上述细胞溶解因子的t细胞中表达最高细胞溶解因子的细胞，然后分析它们之间的相关性。
127.因此，图7示出了对抗原具有特异性诱导活性的t细胞受体的分布图(egfr-mt-l858r-hvkitdfgr-a*33:03四聚体)。此时，基于图2中选择的细胞进行t细胞受体的分析，通过单细胞分析法分析t细胞受体链的v、d、j、c组成序列，并以此为基础进行cdr3序列的测序。首先，分析的t细胞受体共有295个品种，其中t细胞受体链前10位的分析结果见下表[表1]，trav23/dv6和trbv18的组合以及trav24和trbv19的组合显示具有最高频率。[表1]
[0128]
此外，基于上表1中的分析结果，生成的cdr3的序列如下表2所示，并且由于所有序列都是基于表达细胞溶解因子的t细胞选择的，因此该序列可能包括由通过seq id no：1至12表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：13至24表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3以对egfr l858r突变肿瘤具有抗癌作用。此时，[表2]的顺序是根据细胞溶解因子(ifn-γ和颗粒酶-b)的表达率排列的(等级1代表最高表达率)。
[0129]
此外，对egfr l858r突变肿瘤具有更有效抗癌作用的tcr可以为包含由通过seq id no:1至8表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：13至20表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3。
[0130]
此时，公开了细胞溶解因子的表达水平(释放能力)在包括由通过seq id no：1和2表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：13和14表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3的tcr中最高。然而，包括由通过seq id no：3至12表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：15至24表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3的tcr的细胞溶解因子的表达水平是相似的。
[0131]
因此，包括由通过seq id no：1至12表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3的tcr的细胞溶解作用可能相同，并且包含由通过seq id no：13至24表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3的tcr的细胞溶解作用也可能相同。
[0132]
具有抗egfr l858r突变肿瘤的最有效抗癌作用的tcr可能是包括由通过seq id no：1和2表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：13和14表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3的tcr。[表2]
[0133]
根据以上结果，随着根据本发明实施方案的包括由通过seq id no：1至12表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：13至24表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3的tcr包含以高频率表达的cdr3，egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)可以被更准确地靶向。此外，由于根据本发明的实施方案的tcr在细胞溶解因子的表达中非常高，因此tcr在含有egfr-l858r突变抗原的肿瘤中可以具有更有效的抗癌反应(肿瘤细胞溶解作用)。nk细胞
[0134]
在下文中，参考图8至14b，将描述包括tcr和能够将特异性抗原靶向egfr突变肿瘤的fc受体的nk细胞。
[0135]
首先，参考图8，示出了在t形瓶中培养时nk-92细胞系的结果。此时，nk细胞为nk-92细胞，使用x-vivo 10培养基或xuri t细胞培养基培养，并且更具体地说，培养基中添加在x-vivo 10或xuri t细胞培养基中的1％至10％的人ab血清、100至2000u/ml il-2、0.1至5mm l-天冬酰胺、0.1至5mm l-谷氨酰胺和0.1至5mm l-丝氨酸，并且其容量不限于此。此外，将nk-92细胞以2.5
×
105个细胞/ml的浓度进行传代培养，在t形瓶中培养，并以3天的间隔进行传代培养。此外，通过使用血细胞计数器测量细胞计数来确认细胞增殖，使用流式细胞术通过用台盼蓝或pi作为细胞死亡标志物染色来确认细胞活力，并使用流式细胞术通过用ki67(一种细胞生长因子)染色来确认细胞增殖效率。该过程以与图8和9中相同的方式进行。
[0136]
由于传代培养，nk-92细胞的细胞密度在1
×
105到1
×
106个细胞/ml之间保持恒定，直到培养22天，并且当显示倍数扩增时，nk-92细胞的数量在22天的培养期间增加了126倍。此外，直到培养22天，细胞存活率一直保持在80％至100％，并且直到培养22天，细胞增殖也一直保持在70％至85％。
[0137]
此后，参考图9，示出了对应于fbs和il-2的浓度的nk-92增殖效率的结果。
[0138]
首先，参考图9a和9b，当以5％添加fbs时，对应于fbs浓度的nk-92增殖效率最佳。此外，参考图13c和13d，当以1000u/ml添加il-2时，对应于il-2浓度的nk-92增殖效率最佳。即在nk-92细胞中，fbs和il-2越高，增殖效率越高，能够最优选提高nk-92细胞增殖效率的fbs和il-2浓度可以分别为5％和1000u/ml，但不限于此。
[0139]
参考图10，显示了对应于培养方法的nk-92细胞系的细胞增殖效率的结果。此时，使用属于细胞增殖设备的xuri w-25设备对nk-92细胞进行有效增殖培养。此时，nk-92的培养基与如上述图11至15中使用的培养基相同，在xuri w-25设备中安装2l至10l灌注袋后，接种并稳定培养基。此外，在培养基的温度和ph值稳定后，接种0.5至1.0
×
108个/袋的nk-92细胞，培养环境条件设定为2至2rpm振荡。此外，在细胞接种后每12小时测量细胞活力、细胞增殖率和细胞计数，并每隔2天通过过滤器除去一半培养基后，接种新的培养基，最后，将细胞在2l灌注袋中用1l培养基和在10l灌注袋中用5l培养基进行培养。此外，当细胞计数达到0.5至1.0
×
10
10
时，使用细胞收集设备sefia s-2000收集nk-92细胞，然后测量细胞活力、细胞增殖率和细胞计数。
[0140]
参考图10a，当以优化的10l规模培养时细胞密度最快达到1
×
102的细胞密度，此时达到100倍的时间比一般t形瓶培养短11天。此外，参考图10b，当以优化的10l规模培养时细胞密度最快达到1
×
10
10
的细胞密度，此时达到1
×
10
10
的时间比一般t形瓶培养短11天。因此，当在xuri w-25设备中以优化的10l规模培养nk-92细胞时，可以在更快的时间内获得大量细胞。
[0141]
参考图11a和11b，示出了根据培养条件的nk-92细胞系和表达fc受体的nk-92细胞系的激活因子和毒性因子的结果。此时，为了鉴定nk-92细胞的细胞活性表面因子、细胞毒性因子和趋化因子受体，用每种抗体对nk-92细胞进行染色，然后使用流式细胞仪进行确认。更具体地说，使用nkg2d、nkp30、nkp44和nkp46鉴定细胞活性表面因子，并通过cd107、颗粒酶b和穿孔素(perforin)鉴定细胞毒性因子。
[0142]
参考图11a，示出了根据培养条件的nk-92细胞系的激活因子和毒性因子的结果。当nk-92在xuri培养基中培养时，细胞活性表面因子nkg2d、nkp30、nkp44和nkp46以及细胞毒性因子cd107、颗粒酶b和穿孔素均得到表达。同样，当nk-92在x-vivo培养基中培养时，细胞活性表面因子nkg2d、nkp30、nkp44和nkp46以及细胞毒性因子cd107、颗粒酶b和穿孔素均得到表达。
[0143]
此外，参考图11b，示出了根据培养条件表达fc受体的nk-92细胞系的激活因子和毒性因子的结果。当在xuri培养基中培养表达fc受体的nk-92时，细胞活性表面因子nkg2d、nkp30、nkp44和nkp46以及细胞毒性因子cd107、颗粒酶b和穿孔素均得到表达。同样，当在x-vivo培养基中培养表达fc受体的nk-92时，细胞活性表面因子nkg2d、nkp30、nkp44和nkp46以及细胞毒性因子cd107、颗粒酶b和穿孔素均得到表达。
[0144]
根据以上结果，nk-92细胞系和表达fc受体的nk-92细胞系可能在xuri培养基和x-vivo培养基两者中培养时同时表现出细胞活性和细胞毒性。
[0145]
参考图12，示出了根据蛋白质表达启动子的nk-92细胞的gfp表达效率的结果。此时，为了选择用于在nk-92细胞中表达t细胞受体的启动子，确认了根据每个启动子的蛋白质表达。更具体地说，使用电穿孔和pcag-gfp、pef-1α-gfp和pcmv-gfp质粒转化nk-92细胞。此时，质粒的浓度可以是2ug/1
×
106个细胞，但不限于此。然后，转导24小时后，使用流式细
胞术和cag、ef-1α、cmv等确认gfp蛋白的表达。
[0146]
由于pcmv启动子对gfp的表达率最高，因此pcmv可能是nk-92细胞中t细胞受体表达的最佳启动子。
[0147]
图13a和13b示出了趋化因子受体在nk-92细胞中的表达结果。此时，通过流式细胞术和趋化因子受体ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6和cx3cr1以与图11a和11b相同的方式证实了趋化因子受体的表达。首先，参考图13a，根据上述培养条件和方法培养的nk-92细胞显示出表达趋化因子受体ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8和ccr9。
[0148]
此外，参考图13b，nk-92细胞显示表达趋化因子受体cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6和cx3cr1。
[0149]
因此，根据上述培养条件和方法培养的nk-92细胞可通过表达趋化因子受体激活获得性免疫反应。
[0150]
图14a和14b示出了cd3分子和t细胞受体分子在nk-92细胞中的表达结果。此时，使用电穿孔以及pcmv-cd3γt2aδf2aεp2aξ和pcmv-tcrαt2aβ质粒转化nk-92细胞。此时，质粒的浓度可以是2ug/1
×
106个细胞，但不限于此。然后，在转导24小时后，使用流式细胞术确认cd3分子和t细胞受体分子的表达。
[0151]
首先，参考图14a，表达cd3分子的nk-92细胞占nk-92细胞总数的28.8％。也就是说，这可能意味着由于cd3(t细胞抗原受体的辅助蛋白链)在nk-92细胞中表达，tcr通过上述过程稳定地转导到nk-92细胞中。
[0152]
接下来，参考图14b，表达t细胞受体的nk-92细胞占nk-92细胞总数的8.3％。也就是说，这可能意味着由于t细胞抗原受体在nk-92细胞中表达，tcr通过上述过程稳定地转导到nk-92细胞中。
[0153]
通过上述过程，本发明可以提供能够更有效靶向实体瘤，特别是含有egfr突变的肺癌的tcr，以及含有该tcr的免疫细胞，即nk细胞，从而提高抗癌效果。
[0154]
结果，本发明的免疫细胞通过包含上述tcr可以更有效地靶向含有egfr突变的肺癌，从而进一步增强对靶向癌细胞的抗癌作用。根据本发明的实施方案的tcr和包括tcr的nk细胞
[0155]
在下文中，参考图15a和15b，根据本发明的一个实施方案的tcr(包括由通过seq id no：1至12表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：13至24表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3的tcr)的构型和包括tcr的nk细胞将详细描述。
[0156]
图15a是根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的慢病毒载体图谱。
[0157]
此时，为了转导至nk-92细胞(表达具有egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)特异性诱导活性的tcr序列)，使用了慢病毒载体，以及可以用于转导的载体不限于慢病毒载体，并且本技术领域可以用于转导的各种载体都可以使用。
[0158]
根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的慢病毒载体序列：aaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagctg-3’(seq id no:50)
[0159]
此外，该载体可以包括cd3分子的成分和tcrα和β的成分。
[0160]
因此，参考图15b，示出了根据本发明的实施方案的表达tcr序列的cd3分子和t细胞受体的核酸序列的示意图。
[0161]
根据本发明的实施方案的表达tcr序列的cd3分子和t细胞受体的核酸序列的组分分别连接弗林蛋白酶(furin)+x2a序列和ires序列以独立表达。
[0162]
根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的tcrα核酸序列(trav23/dv6)：根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的tcrα核酸序列(trav23/dv6)：根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的tcrα核酸序列(trav23/dv6)：
[0163]
根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的tcrβ核酸序列(trbv18)：
[0164]
此时，seq id no：51和52包括由通过seq id no：1和13表示的氨基酸序列的核酸序列(seq id no：25和37)，其是分别根据本发明的实施方案的tcr，并且由seq id no：51和52表示的氨基酸序列与下面由seq id no：55和56表示的那些相同(下划线和粗体标记)。
[0165]
根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的tcrα氨基酸序列(trav23/dv6)：
[0166]
用于表达根据本发明的实施方案的tcr序列的tcrβ氨基酸序列(trbv18)：
[0167]
根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的tcrα核酸序列(trav24)：
[0168]
根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的tcrβ核酸序列(trbv19)：
[0169]
此时，seq id no：53和54包括由seq id no：2和14表示的氨基酸序列的核酸序列(seq id no：26和38)，它们分别是根据本发明的一个实施方案的tcr，并且由seq id no：53和54表示的氨基酸序列与下面由seq id no：57和58表示的那些相同(下划线和粗体标记)。
[0170]
根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的tcrα氨基酸序列(trav24)：
[0171]
根据本发明的实施方案的用于表达tcr序列的tcrβ氨基酸序列(trbv19)：
[0172]
上述根据本发明的实施方案的tcr序列可以在多种免疫细胞中表达和使用，不仅包括nk细胞，还包括t细胞、自然杀伤t细胞(nkt)、人胚胎干细胞、造血干细胞(hsc)和诱导多能干细胞(ips)。因此，包含根据本发明的实施方案的tcr序列的免疫细胞可对包含egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的各种肿瘤细胞具有更有效的免疫应答和抗癌作用。根据本发明的实施方案的tcr和包含tcr的nk细胞
[0173]
在下文中，参考图16a至18，将详细描述根据本发明的实施方案的tcr(其包括由通过seq id no：1至12表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：13至24表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3)的抗癌作用以及包含该tcr的nk细胞。
[0174]
此时，在nk细胞中表达的tcr已与包括由通过seq id no：1和2表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：13和14表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3的tcr一起使用。此外，包括由通过seq id no：1至12表示的氨基酸序列组成的tcrα链可变区的cdr3和由通过seq id no：13至24表示的氨基酸序列组成的tcrβ链可变区的cdr3的tcr没有细胞溶解作用，因此，可以选择性地使用tcr。
[0175]
图16a和16b示出了根据本发明的实施方案的确认tcr的细胞活性的结果。
[0176]
首先，参考图16a，在比较例1中，使用敲除的jurkat细胞(对照，tcr ko)，以及在比较例2中，使用在使用慢病毒的敲除的jurkat细胞中的表达对ny-eso-1_hla-a 02:01抗原特异的tcr的细胞(ny-eso-12:01tcr)。此外，在实施例1(l858r 1 33:03tcr)和2(l858r 2 33:03tcr)中，使用了使用慢病毒的敲除的jurkat细胞中表达根据本发明实施方案的tcr的细胞。更具体地，实施例1(l858r 1 33:03tcr)对应于表达基于由seq id no：51和52所代表的核酸序列的tcr的细胞，其包括由seq id no：1和13所代表的氨基酸序列(对于trav23/dv6和trbv18，由seq id no：25和37所代表的核酸序列)。实施例2(l858r 2 33:03tcr)对应
于表达基于seq id nos:53和54所代表的核酸序列的tcr的细胞，其包括由seq id no：2和14所代表的氨基酸序列(对于trav24和trbv19，由seq id no：26和38所代表的核酸序列)。
[0177]
此外，在实施例1和2(l858r 1 33:03tcr和l858r 2 33:03tcr)的情况下，由于通过与egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)四聚体特异性反应可以释放细胞溶解因子，例如ifn-γ，因而通过将比较例1和2以及实施例1和2暴露于ny-eso-1_hla-a 02:01抗原四聚体和egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)四聚体来测量ifn-γ的表达。
[0178]
因此，参考图16b，在比较例1(tcr ko jurkat t细胞)的情况下，由于t细胞不包含能够识别抗原的tcr，因此不存在ifn-γ表达细胞(ifn-γ阳性细胞)，并且在比较例2(ny-eso-1-tcr jurkat t细胞)的情况下，由于t细胞包含只能识别ny-eso-1_hla-a 02:01抗原的tcr，因此ifn-γ表达细胞仅存在于ny-eso-1_hla-a 02:01抗原上。
[0179]
此外，在实施例1和2(l858r 1 33:03tcr和l858r 2 33:03tcr)的情况下，由于能够识别egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的本发明的实施方案的tcr被包括在内，因此ifn-γ通过与egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)四聚体特异性反应来表达。
[0180]
也就是说，这可能意味着根据本发明的实施方案的tcr在免疫细胞中表达并且特异性地与egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)反应以释放细胞溶解因子(细胞因子)，例如ifn-γ。
[0181]
此外，由于根据本发明的实施方案的tcr不会诱导除egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)以外的ny-eso-1_hla-a 02：01抗原中ifn-γ的表达，这可能意味着对本发明要靶向的egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的高度靶向是可能的。
[0182]
因此，由于根据本发明的实施方案的tcr可以更有效地靶向包含egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的肿瘤，因此包含根据本发明的实施方案的tcr的免疫细胞可以具有增强的抗癌作用。
[0183]
图17a和17b示出了根据本发明的实施方案确认对包括tcr的nk细胞的细胞溶解作用的结果。此时，为了确认细胞溶解作用，使用实时细胞分析仪(rtca)，并且作为肿瘤细胞样品，使用yu1154(抗原特异性靶细胞)和yu1094(抗原非特异性靶细胞，egfr
mut hla11:01
)，它们是表达egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的患者来源的肿瘤细胞系。更具体而言，将肿瘤细胞(靶细胞，t)(其是上述患者来源的肿瘤细胞株)在分析仪的细胞培养板上培养，与nk-92细胞(效应细胞，e)以一定的比例(t:e比例)共培养，并根据培养时间测量细胞溶解度。此时，nk-92细胞包括野生型(wt)nk-92细胞和根据本发明的实施方案的包含tcr(egfr
mut hla33:03-tcr,daan-01)的nk-92细胞，以及比较它们相互之间的细胞溶解度。此外，在下文中，为了描述方便，将描述根据本发明的实施方案的包含tcr的nk-92细胞命名为实施例，并且野生型(wt)nk-92细胞被命名为比较例。
[0184]
首先，参考图17a，说明了对yu1154(抗原特异性靶细胞)的细胞溶解作用，包括根据本发明的实施方案的tcr的nk细胞(tcr-nk)，即实施例具有比比较例(野生型nk细胞)更高的细胞溶解作用。
[0185]
更具体地，参考图17a(a)，当以10和50(tcr-nk1:10、1:50)的比例与靶细胞(肿瘤细胞)1共培养时，本发明的实施例具有约60％或更大的细胞溶解作用达6小时。相反，所有比较例都显示出50％或更小的细胞溶解作用，而与靶细胞(肿瘤细胞)的比率无关。
[0186]
此外，参考图17a(b)，当以10和50(tcr-nk 1:10，1:50)的比例与靶细胞(肿瘤细
胞)1共培养时，本发明的实施例具有约70％或更大的细胞溶解作用达12小时。相反，所有比较例都显示出50％或更小的细胞溶解作用，而与靶细胞(肿瘤细胞)的比率无关。
[0187]
此外，参考图17a(c)，当以10和50(tcr-nk 1:10，1:50)的比例与靶细胞(肿瘤细胞)1共培养时，本发明的实施例具有约85％或更大的细胞溶解作用达72小时。另一方面，除了当以50(wt-nk 1:50)与靶细胞(肿瘤细胞)1的比例共培养时，所有比较例都具有10％或更小的细胞溶解作用，甚至当以50(wt-nk 1:50)与靶细胞(肿瘤细胞)1的比例共培养，比较例仅具有约80％的细胞溶解作用，其低于上述的本发明的实施例的细胞溶解作用.
[0188]
因此，根据本发明的实施方案的包含tcr的nk细胞可以更有效地诱导egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的细胞溶解，从而对含有egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)显示增强的抗癌作用。
[0189]
接下来，参考图17b，示出了对yu1094(抗原非特异性靶细胞)的细胞溶解作用，包括根据本发明的实施方案的tcr的nk细胞(tcr-nk)，即实施例具有比比较例(野生型nk细胞)更高的细胞溶解作用。
[0190]
更具体地，参考图17b(a)，当以10和50(tcr-nk 1:10，1:50)的比例与靶细胞(肿瘤细胞)1共培养时，本发明的实施例具有约40％或更大的细胞溶解作用达6小时。相反，所有比较例都显示出40％或更小的细胞溶解作用，而与靶细胞(肿瘤细胞)的比率无关。
[0191]
此外，参考图17b(b)，当以10和50(tcr-nk 1:10，1:50)的比例与靶细胞(肿瘤细胞)1共培养时，本发明的实施例具有约50％或更大的细胞溶解作用达12小时。另一方面，除了当以50(wt-nk 1:50)比靶细胞(肿瘤细胞)1的比例共培养时，所有比较例都具有40％或更小的细胞溶解效果，甚至当以50(wt-nk1:50)比靶细胞(肿瘤细胞)1的比例共培养时，比较例仅具有约5％的细胞溶解作用，其低于上述本发明的实施例的细胞溶解作用.
[0192]
此外，参考图17b(c)，当以10和50(tcr-nk 1:10，1:50)与靶细胞(肿瘤细胞)1的比例共培养时，本发明的实施例具有约70％或更大的细胞溶解作用达72小时。另一方面，与上述本发明的实施例(tcr-nk 1:10、1:50)相比，所有比较例都具有较低的细胞溶解作用。
[0193]
因此，根据本发明的实施方案的包含tcr的nk细胞可以更有效地诱导egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的细胞溶解，从而对含有egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)显示出增强的抗癌作用。
[0194]
图18是确认根据本发明的实施方案的包含tcr的nk细胞的肿瘤抑制作用的结果。此时，在诱导表达egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的源自患者的肿瘤动物模型(植入肺腺癌的nog小鼠)中证实了肿瘤抑制作用。在肿瘤动物模型中，植入含有egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的源自患者的肿瘤组织，然后培育4-5个月，使肿瘤大小达到100-150mm3或更大，然后在达到目标大小时注射根据本发明的实施方案的含有tcr的nk-92细胞。此外，根据本发明的实施方案的含有tcr的nk细胞的注射每周进行两次，共计4周，并且每次注射的注射量选自1
×
107至5
×
107的范围。可以根据细胞疗法的用途不同地选择和使用根据本发明实施方案的包括tcr的nk细胞的注射剂量。此外，作为比较例，分别注射和使用野生型nk-92细胞和竞争药物，即cd16-nk-92细胞。
[0195]
参考图18，当注射根据本发明的实施方案的含有tcr的nk细胞(daan nk细胞疗法)时，动物模型的肿瘤体积约为200％或更小，其低于用竞争药物和野生型nk细胞治疗的肿瘤体积。
[0196]
也就是说，这可能意味着根据本发明的实施方案的含有tcr的nk细胞比注射常规抗癌药物和一般免疫细胞更有效地抑制肿瘤。特别地，这可能意味着由于根据本发明的实施方案的含有tcr的nk细胞与注射正常免疫细胞相比具有统计学上的显著差异(p《0.001)，因此目标抗癌(免疫)作用是在含有egfr-l858r突变抗原(hvkitdfgr-a*33:03)的肿瘤中显著改善(*＝p《0.05，***＝p《0.001)。
[0197]
尽管已经参考附图详细描述了本发明的实施方案，但是本发明不限于此并且可以在不脱离本发明的技术构思的情况下以许多不同的形式实施。因此，本发明的实施方案仅供说明之用，并不用于限制本发明的技术构思。本发明的技术构思的范围不限于此。因此，应当理解，上述实施方案在所有方面都是示例性的而不是限制性的。本发明的保护范围应以所附权利要求为基础解释，其等同范围内的所有技术精神均应解释为落入本发明的范围内。

技术特征：
1.一种t细胞受体，其包括：(i)t细胞受体(tcr)α链可变区的互补决定区(cdr)3，其包括氨基酸序列cafighggsqgnlif(seq id no:1)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassmqgamseqff(seq id no:13)或其变体，(ii)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列caatgtykyif(seq id no:2)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列casspefaraldnqpqhf(seq id no:14)或其变体，(iii)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列caygggseklvf(seq id no:3)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列casssatgtqgytf(seq id no:15)或其变体，(iv)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列calinarlmf(seq id no:4)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassftntgelff(seq id no:16)或其变体，(v)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cavnggsqgnlif(seq id no:5)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassmwqgngeqyf(seq id no:17)或其变体，(vi)tcrα链可变区的cdr3，其包括氨基酸序列camregyggatnklif(seq id no:6)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassvgpgttsyneqff(seq id no:18)或其变体，(vii)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列caynngdggsqgnlif(seq id no:7)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列catsrdrstdtqyf(seq id no:19)或其变体，(viii)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列catdggsarqltf(seq id no:8)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列casslglsgytf(seq id no:20)或其变体，(ix)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列catlyntdklif(seq id no:9)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr3，其包括氨基酸序列cassqsmnteaff(seq id no:21)或其变体，(x)tcrα链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列camrgpwrgssgsarqltf(seq id no:10)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列casrtglsyeqyf(seq id no:22)或其变体，(xi)tcrα链可变区的cdr3，其包括氨基酸序列calsvrgfktsydkvif(seq id no:11)或其变体，和tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassfgsayneqff(seq id no:23)或其变体，或(xii)tcrα链可变区的cdr3，其包括氨基酸序列cavnmmdssyklif(seq id no:12)或其变体，和
tcrβ链可变区的cdr 3，其包括氨基酸序列cassfptarsnteaff(seq id no:24)或其变体。2.根据权利要求1所述的t细胞受体，其中所述t细胞受体能够结合被包含在由hvkitdfgr(seq id no:49)表示的氨基酸序列或其mhc结合形式中的表位。3.根据权利要求2所述的t细胞受体，其中所述表位与hla-a*33:03和hla-a*31:01中的至少一种具有结合亲和力。4.根据权利要求1所述的t细胞受体，其中所述t细胞受体靶向egfr l858r突变。5.根据权利要求1所述的t细胞受体，其中所述tcrα链可变区由通过seq id no：55表示的氨基酸序列组成，并且seq id no：55包括由seq id no：1表示的氨基酸序列。6.根据权利要求1所述的t细胞受体，其中所述tcrα链可变区由通过seq id no：57表示的氨基酸序列组成，以及所述seq id no：57包括由seq id no：2表示的氨基酸序列。7.根据权利要求1所述的t细胞受体，其中所述tcrβ链可变区由通过seq id no：56表示的氨基酸序列组成，以及所述seq id no：56包括由seq id no：13表示的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的t细胞受体，其中所述tcrβ链可变区由通过seq id no：58表示的氨基酸序列组成，以及所述seq id no：58包括由seq id no：14表示的氨基酸序列。9.根据权利要求1所述的t细胞受体，其中所述t细胞受体是单链型。10.根据权利要求2所述的t细胞受体，其中所述tcrα链可变区和所述tcrβ链可变区通过接头序列相互连接。11.一种编码权利要求1至10中任一项所述的t细胞受体的核酸。12.根据权利要求11所述的核酸，其中所述核酸包括至少一种由seq id no：51至54表示的核酸序列；或者与至少一个由seq id no:51至54表示的核酸序列具有至少80％或更多同一性的核酸序列。13.根据权利要求12所述的核酸，其中所述seq id no：51和53是编码tcrα链可变区的核酸序列。14.根据权利要求12所述的核酸，其中所述seq id no：52和54是编码tcrβ链可变区的核酸序列。15.根据权利要求11所述的核酸，其还包含：弗林蛋白酶、2a和ires序列。16.一种载体，其包含根据权利要求11至15中任一项所述的核酸。17.根据权利要求16所述的载体，其中所述载体是表达载体。18.根据权利要求17所述的载体，其中所述表达载体是慢病毒载体。19.根据权利要求16所述的载体，其中所述载体包括由seq id no：50表示的核酸序列；或者与由seq id no:50表示的核酸序列具有至少80％或更多同一性的核酸序列。
20.一种免疫细胞，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的t细胞受体。21.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是nk-92细胞。22.一种细胞疗法，其包含含有根据权利要求1至10中任一项所述的t细胞受体的免疫细胞。23.根据权利要求22所述的细胞疗法，其还包括：效应t细胞。24.根据权利要求22所述的细胞疗法，其中所述细胞疗法是实体瘤疗法。

技术总结
本说明书不仅提供了抗原特异性T细胞受体，还提供了包含该T细胞受体的核酸、载体和免疫细胞，以及使用它们的方法。以及使用它们的方法。以及使用它们的方法。


技术研发人员：赵炳哲 表庚镐 金宰焕 边英善 金英燮 辛春峰
受保护的技术使用者：多安生物治疗有限公司
技术研发日：2021.10.07
技术公布日：2023/7/22