一株具有抑菌及降解过敏原功效的解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体地涉及一株解淀粉芽孢杆菌以及其在抑制常见病原微生物、降解过敏原中的应用。


背景技术：

2.随着经济的发展和人们生活水平的提高，人们对居家卫生环境的要求也越来越高，这也激活了清洁剂市场。目前市面上常用的清洁剂主要以化学清洁剂为主，化学清洁剂主要由表面活性剂、助洗剂和添加剂等组成。但长期使用化学清洁剂物质容易导致人体发生过敏反应，削弱人体免疫力，同时长期使用化学清洁剂，还会造成二次污染，使细菌产生抗药性，容易产生超级细菌。并且目前市面上的清洁剂其功能较为单一，仍以杀菌消毒为主要功能，对居家环境中的其它污染物如过敏原等清除效果不佳，因此开发环境友好型且具有多效性的居家环境清洁剂势在必行。
3.解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)是芽孢杆菌属的一种细菌，一般大小为0.7-0.8
×
2.0-3.0μm，为革兰氏阳性菌。解淀粉芽孢杆菌是一种多功能的微生物，通常可通过营养竞争或占位效应形成优势菌群，有效地阻止病原微生物的繁殖，在抑菌领域有一定的作用。此外，解淀粉芽孢杆菌具有较强的酶系，可以产生蛋白酶、脂肪酶等多种酶类，能有效去除环境中的蛋白类污染物(如过敏原)，因此解淀粉芽孢杆菌可有效运用于微生物型清洁剂的生产以克服化学清洁剂存在的问题。


技术实现要素：

4.本发明一方面保护解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)yhx002j，该菌株于2022年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022265，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
5.本发明另一方面保护解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)yhx002j在抑制常见病原微生物中的应用，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及黑曲霉。
6.本发明还保护解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)yhx002j在降解过敏原类物质中的应用，所述的过敏原包括粉尘螨过敏原、屋尘螨过敏原、猫过敏原、狗过敏原。
7.本发明的有益效果包括以下几个方面：(1)解淀粉芽孢杆菌yhx002j对常见病原微生物具有较强的抑菌活性，包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉；(2)解淀粉芽孢杆菌yhx002j能有效降解室内常见过敏原(屋尘螨过敏原、粉尘螨过敏原、猫过敏原、狗过敏原)，降低室内过敏原导致的过敏风险。
附图说明
8.图1为解淀粉芽孢杆菌yhx002j菌落形态图。
9.图2为解淀粉芽孢杆菌yhx002j营养细胞的显微形态图。
10.图3为解淀粉芽孢杆菌yhx002j芽孢的显微形态图。
具体实施方式
11.实施例1解淀粉芽孢杆菌yhx002j的分离
12.所用培养基为营养琼脂培养基，配制方法如下：分别称取蛋白胨10.0g，牛肉浸粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15.0g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/l氢氧化钠溶液或1mol/l盐酸溶液将ph值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角瓶，121℃高压灭菌20min，冷却后倒制平板备用。
13.解淀粉芽孢杆菌yhx002j为发明人采用稀释平板涂布法从有机农场土壤中分离筛选得到的，具体步骤如下：从有机农场采集土质肥沃、作物生长健康的土壤于无菌采样袋中，带回实验室后，称取5g土壤样品放入装有适量玻璃珠的无菌250ml三角瓶中并加入45ml无菌水，制成土壤悬液，将其置于37℃恒温振荡器上振荡2h，随后80℃水浴热处理15min。用微量移液器吸取1ml土壤悬液于无菌试管中，加入9ml无菌水，混匀后从中吸取1ml稀释液加入第2根无菌试管中并加入9ml无菌水，以此类推，制成10-1
、10-2
、10-3
、10-4
稀释梯度的土壤悬液。分别吸取100μl 10-2
、10-3
、10-4 3个稀释梯度的土壤悬液均匀涂布在营养琼脂培养基上，置于37℃生化培养箱中倒置培养48小时。培养72小时后，挑选长势良好、菌落形态相似且数目最多的菌落，分离纯化直至菌落形态一致的单菌，将菌株的编号命名为yhx002j。
14.实施例2解淀粉芽孢杆菌yhx002j的菌株鉴定
15.菌体形态特征：在营养琼脂平板培养基上，该菌落呈米黄色不透明菌落，表面有晕环无凸起，边缘不规则(图1所示)。显微镜下该菌细胞为杆状，革兰氏阳性菌，体长为0.5-0.8
×
1.8-3.0μm(图2)。培养24h后可看到芽孢，呈椭圆形，两端钝圆，芽孢囊不膨大，中生到次端生(图3所示)。
16.菌株的分子生物学鉴定：将菌株交武汉金开瑞生物工程有限公司进行分子生物学鉴定，分别测定其16s rrna和gyra基因序列，测序结果如seq id no.1和2所示，根据序列比对，确定菌株为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)，2022年3月15日提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为cctcc no：m 2022265。
17.实施例3解淀粉芽孢杆菌yhx002j对病原微生物的抑制作用
18.所用培养基如下：
19.营养琼脂培养基：同实施例1，用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活化及平板计数。
20.营养肉汤培养基：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/l氢氧化钠或1mol/l盐酸将ph值调节为7.2～7.4，分装到500ml三角瓶，每瓶装98ml，塞上透气塞子。121℃高压灭菌20min备用，用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的单独液体培养以及大肠杆菌与解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌与解淀粉芽孢杆菌的共培养。
21.结晶紫中性红胆盐琼脂(vrba)：分别称取蛋白胨7.0g、酵母膏3.0g、乳糖10.0g、氯化钠5.0g、胆盐1.5g、中性红0.03g、结晶紫0.002g、琼脂粉15g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000ml使其溶解，用1mol/l氢氧化钠或1mol/l盐酸将ph值调节为7.3～7.5，煮沸2min，将培养基融化并恒温至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3小时，用于大肠杆
菌的计数。
22.金黄色葡萄球菌3m测试片：用于金黄色葡萄球菌的菌落计数。
23.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：分别称取马铃薯浸出粉12g、葡萄糖20g，琼脂15g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，分装后，121℃高压灭菌20min，用于白色念珠菌和黑曲霉的活化及平板计数，使用前加入34μg/ml的卡那霉素。
24.沙氏葡萄糖液体培养基(sdb)：分别称取牛肉膏5g、蛋白胨5g、葡萄糖20g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，分装到500ml三角瓶，每瓶装98ml，塞上透气塞子，121℃高压灭菌20min备用，用于白色念珠菌、黑曲霉的单独液体培养以及白色念珠菌与解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉与解淀粉芽孢杆菌的共培养。
25.大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌实验操作如下：
26.(1)菌悬液的制备：取解淀粉芽孢杆菌yhx002j、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌分别接种到已灭菌的100ml营养肉汤培养基中，置于37
±
1℃条件下培养24小时。用接种环将培养好的菌悬液划线于营养琼脂平板上，置于37
±
1℃条件下培养24小时。取各菌的单菌落至已灭菌的营养肉汤培养基中混合均匀，置于37
±
1℃条件下培养24小时。
27.(2)菌悬液的稀释计数：分别对培养后的菌液进行稀释计数，菌悬液先保存在4℃冰箱中备用，待计数结果出来后，分别将三种菌调整至10
6-107cfu/ml。
28.(3)共培养：在无菌操作下，实验组吸取大肠杆菌或者金黄色葡萄球菌悬液1ml分别接种至98ml营养肉汤培养基，混合均匀后，再加入1ml解淀粉芽孢杆菌。对照组吸取大肠杆菌或者金黄色葡萄球菌悬液1ml分别接种至98ml营养肉汤培养基，混合均匀后，再加入1ml无菌水。将两组混合培养物放置于37
±
1℃条件下静置培养24小时，计数大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量。
29.(4)结果计算：
[0030][0031]
式中：
[0032]
x——抑菌率％；
[0033]
a——共培养后空白对照组的平板菌落数；
[0034]
b——共培养后试验组的平板菌落数。
[0035]
白色念珠菌和黑曲霉的抑菌实验操作如下：
[0036]
(1)菌悬液的制备：取解淀粉芽孢杆菌yhx002j、白色念珠菌、黑曲霉，分别接种到已灭菌的100ml沙氏葡萄糖液体培养基中，置于30
±
1℃条件下培养24小时。用接种环将培养好的菌悬液划线于pda培养基平板上，置于30
±
1℃条件下培养24小时。取各菌单菌落至已灭菌的沙氏葡萄糖液体培养基中混合均匀，置于30
±
1℃条件下培养24小时。
[0037]
(2)菌悬液的稀释计数：分别对培养后的菌液进行稀释计数，菌悬液先保存在4℃冰箱中备用，待计数结果出来后，分别将三种菌调整至10
6-107cfu/ml。
[0038]
(3)共培养：在无菌操作下，实验组吸取白色念珠菌或黑曲霉菌悬液1ml接种至98ml沙氏葡萄糖液体培养基，混合均匀，再加入1ml解淀粉芽孢杆菌作为试验组。对照组取1ml白色念珠菌或黑曲霉菌悬液接种至98ml沙氏葡萄糖液体培养基，混合均匀后再加入1ml无菌水。将两组混合培养物放置于30
±
1℃条件下静置养48小时，计数白色念珠菌和黑曲霉
的数量。
[0039]
(4)结果计算：
[0040][0041]
式中：
[0042]
x——抑菌率％；
[0043]
a——共培养后空白对照组的平板菌落数；
[0044]
b——共培养后试验组的平板菌落数。
[0045]
表1解淀粉芽孢杆菌yhx002j的抑制效果
[0046][0047]
从表1中可以看出，解淀粉芽孢杆菌yhx002j对常见的病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉具有很强的抑制作用。
[0048]
实施例4解淀粉芽孢杆菌yhx002j对室内常见过敏原的降解作用
[0049]
屋尘螨过敏原der f1、粉尘螨过敏原der p1、猫过敏原fel d1、狗过敏原can f1检测试剂盒购自indoor biotechnologies，屋尘螨过敏原检测试剂盒der f1产品货号为el-dp1，粉尘螨过敏原检测试剂盒der p1产品货号为el-df1，猫过敏原检测试剂盒fel d1产品货号为el-fd1，狗过敏原can f1检测试剂盒产品货号为el-cf1。具体操作方法如下：将甘油管中保存的解淀粉芽孢杆菌yhx002j划线接种至营养琼脂平板上，置于37
±
1℃条件下培养24小时，随后挑取单菌落接种于营养肉汤培养基中培养过夜12-14h。随后取90μl培养过夜的菌液(活菌数为2
×
108cfu/ml)至无菌试管中，再加入10μl配制好的过敏原溶液，初始过敏原浓度为25ng/ml，置于37
±
1℃下静置作用72h。对照组取90μl无菌水加入10μl配制好的过敏原溶液，作用相同的时间。作用72h后，参照检测试剂盒说明，采用双抗体夹心elisa方法测试溶液中的过敏原浓度。结果按下式计算：
[0050]
p＝(t
c-t
t
)/tc×
100％
[0051]
p：过敏原去除率(％)；tc：作用72h后对照组中过敏原的浓度(ng/ml)；t
t
：作用72h后试验组中过敏原溶液的浓度(ng/ml)。
[0052]
表2过敏原降解效果
[0053][0054]
从表2中可以看出，解淀粉芽孢杆菌yhx002j对常见尘螨过敏原(屋尘螨过敏原、粉尘螨过敏原)和宠物过敏原(猫过敏原、狗过敏原)具有较好的降解作用。
[0055]
实施5解淀粉芽孢杆菌yhx002j菌液制剂的制备方法
[0056]
(1)菌种活化：使用营养琼脂培养基对保存的解淀粉芽孢杆菌yhx002j进行划线活化，温度为37℃，培养时间24h，营养琼脂培养基配方同实施例1；
[0057]
(2)种子液的制备：将活化的单菌落接种于营养肉汤培养基中，置于37℃条件下振荡培养24-48h，取样进行染色等鉴定，防止污染；
[0058]
(3)发酵：使用60l不锈钢发酵罐进行发酵培养，接种量为3％，37℃条件下发酵24h，在显微镜下观察芽孢率，当芽孢率达到90％以上时，停止发酵；发酵培养基组成如下：葡萄糖10g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，磷酸二氢钾1.36g/l，十二水和磷酸氢二钠1.79g/l，六水氯化镁0.27g/l，四水氯化锰0.17g/l，氯化钙0.4g/l。
[0059]
(4)膜过滤浓缩：发酵结束后将发酵液转移至膜过滤(滤膜孔经为200nm)设备物料桶中，对菌体进行膜过滤和浓缩得到浓缩液并进行芽孢计数；
[0060]
(5)稀释与灌装：根据膜过滤浓缩液的芽孢计数结果及最终灌装终浓度(4
×
106cfu/ml)，确定合适的稀释倍数后，量取适量的浓缩液加入灭菌纯化水进行稀释并采用小型灌装机分装成小瓶(100ml/瓶或300ml/瓶)。
[0061]
综上所述，解淀粉芽孢杆菌yhx002j对常见病原微生物大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉具有较强的抑制作用，对室内常见过敏原(屋尘螨过敏原、粉尘螨过敏原、猫过敏原、狗过敏原)具有良好的降解效果，因此该菌株在居家清洁产品中具有较大的应用潜力。

技术特征：
1.解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）yhx002j，其特征在于，保藏编号为cctcc no：m 2022265。2.解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）yhx002j在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌或黑曲霉中的应用。3.解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）yhx002j在降解过敏原类物质中的应用，其特征在于，所述的过敏原包括粉尘螨过敏原、屋尘螨过敏原、猫过敏原、狗过敏原。4.一种解淀粉芽孢杆菌液体制剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为cctcc no：m 2022265。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，公开了一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）YHX002J及其应用，该菌株具有较好地抑菌及降解过敏原功效，具体体现在：（1）解淀粉芽孢杆菌YHX002J具有很强的抑菌活性，对常见病原微生物如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌与黑曲霉具有较强的抑制作用；（2）解淀粉芽孢杆菌YHX002J能有效降解室内常见过敏原，降低室内过敏原导致的过敏风险，因此该解淀粉芽孢杆菌可用于制备家居环境微生物清洁剂。菌可用于制备家居环境微生物清洁剂。


技术研发人员：王桂龙 曾宪勤 彭婧
受保护的技术使用者：武汉悦呼吸科技有限公司
技术研发日：2022.11.04
技术公布日：2023/7/22