一种miR-19a-3p抑制剂在制备神经保护类药物中的应用

一种mir-19a-3p抑制剂在制备神经保护类药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及神经保护类药物制备技术领域，具体涉及一种mir-19a-3p抑制剂在制备神经保护类药物中的应用。


背景技术：

2.脑卒中是当今世界第二大致死和致残病因，其中约87％是缺血性脑卒中。缺血性脑卒中是因脑组织血液供应缺乏造成神经元损伤，进而导致神经功能发生障碍的一种疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、高经济负担五大特点，给人们的生活和社会带来沉重负担。目前临床治疗缺血性脑卒中的主要措施是采用溶栓等方式尽快恢复血液供应。但是，缺血后恢复血液供应过程中，由于钙超载、氧自由基等因素的影响会造成脑组织的再次损伤，即脑缺血再灌注损伤，严重影响患者的预后效果。如何才能有效减轻脑缺血再灌注损伤成为亟待解决的问题。尽管已有不少外源性药物(包括自由基清除剂、抗炎分子、神经营养因子等)被陆续开发用来降低脑缺血再灌注损伤，但这些药物的临床应用尚未获得理想的效果。因此，在神经保护领域急需研发新的脑细胞保护药物。
3.近年来，缺血后适应，即在脑缺血后再灌注期对特定组织进行一次或数次相对短暂的缺血再灌注，被证明是一种十分有效的内源性脑保护策略。缺血后适应通过干扰脑缺血后的再灌注过程，显著降低脑缺血再灌注后的神经损害，持续明显改善大脑功能，但其内源性的神经保护作用机制尚未完全阐明。深入探索缺血后适应保护作用的内在分子机制，可为脑保护治疗提供安全有效的新型药物。
4.微小rna是机体内源表达的非编码rna分子，可参与调控多个靶基因，其可通过完全互补或部分互补的方式与靶基因mrna特异性结合，进而调控靶基因的表达，可在病理过程中发挥重要作用。微小rna或靶向微小rna的效应剂具有小分子、易给药和作用持续时间长等特点，这些优势使其更易转化成为临床治疗的潜在药物。本发明致力于研发此类型神经保护类药物。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种mir-19a-3p抑制剂在制备神经保护类药物中的应用，所述mir-19a-3p抑制剂为：5
′‑
ucaguuuugcauagauuugcaca-3
′
。
6.进一步地，所述mir-19a-3p抑制剂能够用于制备改善脑缺血再灌注后大鼠的认知功能的药物。
7.进一步地，所述mir-19a-3p抑制剂能够用于制备减轻脑缺血再灌注后大鼠神经元的损伤的药物。
8.进一步地，所述mir-19a-3p抑制剂能够用于制备减轻脑缺血再灌注后大鼠海马ca1区神经元的损伤的药物。
9.进一步地，所述mir-19a-3p抑制剂用于降低mir-19a-3p的表达。
10.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
11.1、本发明设计的mir-19a-3p抑制剂能够显著降低mir-19a-3p的在体表达水平，减少缺血敏感区海马ca1区神经元的损伤，改善大鼠认知功能，具有制备神经保护类药物的潜力。
12.2、本发明在脑缺血再灌注损伤大鼠模型造模后30分钟注射mir-19a-3p抑制剂，即在严重的15分钟全脑缺血再灌注后30分钟注射mir-19a-3p抑制剂，可减少缺血敏感区海马ca1区神经元的延迟性死亡，并改善大鼠认知功能。
13.3、本发明拓展了当前对mir-19a-3p在脑损伤中作用的认知，为缺血性脑卒中的神经保护治疗提供了潜在靶点，也有望为缺血性脑卒中的临床诊断提供新的候选标志物，mir-19a-3p抑制剂具有用于制备神经保护治疗类药物的潜力。
14.4、本发明发现在缺血后适应神经保护模型中，大鼠海马ca1区mir-19a-3p的表达水平显著降低，缺血后适应抑制了脑缺血再灌注后海马ca1区mir-19a-3p的表达水平。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1表示本发明中急性缺血性脑卒中组血液中mir-19a-3p的相对表达水平(注：对照：健康人群血液，患者：60～75岁急性缺血性脑卒中患者血液，ap《0.05表示患者组与对照组比较，n＝8)。
17.图2表示本发明中大鼠海马ca1区mir-19a-3p在再灌注6h、12h和24h的相对表达水平(注：ap《0.05表示与假手术组比较，bp《0.05表示与脑缺血再灌注组比较，n＝4)。
18.图3表示本发明中缺血后适应对脑缺血再灌注后大鼠海马ca1区损伤神经元的影响；
19.其中，图a表示各组尼氏染色图(a～c，海马整体图；d～f，海马ca1区局部放大图；黑色方框指示局部放大部位)；
20.图b表示各组大鼠海马ca1区存活的锥体神经元密度(ap《0.01表示与假手术组比较，bp《0.01表示与脑缺血再灌注组比较，n＝5)。
21.图4表示本发明中缺血后适应对脑缺血再灌注后大鼠旷场和新物体识别行为的影响；
22.其中，图a表示各组大鼠体重(n.s.表示比较无统计学差异，n＝6)；
23.图b表示各组大鼠在旷场中央区的平均速度(n.s.表示比较无统计学差异，n＝6)；
24.图c表示各组大鼠在旷场中央区的停留时间(n.s.表示比较无统计学差异，n＝6)；
25.图d表示各组大鼠新物体认知指数(ap《0.01，bp《0.05表示与假手术组比较；cp《0.05表示与脑缺血再灌注组比较，n＝6)。
26.图5表示本发明中mir-19a-3p抑制剂对脑缺血再灌注后大鼠海马ca1区损伤神经元的影响(对照剂组：脑缺血再灌注+对照剂组，mir-19a-3p抑制剂组：脑缺血再灌注+mir-19a-3p抑制剂组)；
27.其中，图a表示各组mir-19a-3p相对表达水平(ap《0.01表示与对照剂组比较，n＝
4)；
28.图b表示各组尼氏染色图(a～b，海马整体图；c～d，海马ca1区局部放大图；黑色方框指示局部放大部位)；
29.图c表示各组大鼠海马ca1区存活的锥体神经元密度(ap《0.01表示与对照剂组比较，n＝5)。
30.图6表示本发明中mir-19a-3p抑制剂对脑缺血再灌注后大鼠旷场和新物体识别行为的影响；
31.其中，图a表示各组大鼠体重(n.s.表示比较无统计学差异，n＝6)；
32.图b表示各组大鼠在旷场中央区的平均速度(n.s.表示比较无统计学差异，n＝6)；
33.图c表示各组大鼠在旷场中央区的停留时间(n.s.表示比较无统计学差异，n＝6)；
34.图d表示各组大鼠新物体认知指数(ap《0.05表示与对照剂组比较，n＝6)。
具体实施方式
35.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.实施例1
37.一种mir-19a-3p抑制剂在制备神经保护类药物中的应用
38.一、材料与方法
39.1、mir-19a-3p抑制剂：5
′‑
ucaguuuugcauagauuugcaca-3
′
(如seq id no.1所示)；
40.mir-19a-3p抑制剂说明：mir-19a-3p抑制剂(即mir-19a-3p的antagomir)全链进行甲基化修饰，在5
′
端前2个碱基和3
′
端后4个碱基分别进行硫代修饰，并在3
′
末端连接胆固醇修饰。由申请人自己设计，并由苏州吉玛基因股份有限公司生产。
41.2、实验动物与主要试剂
42.选择成年sd雄性大鼠，体重200～300g，由徐州医科大学实验动物中心提供。实验动物使用许可证：syxk(苏)2020-0048，本研究所有实验流程均经徐州医科大学实验动物中心伦理委员会批准。
43.尼氏染色液购自上海碧云天生物技术有限公司；trizol试剂购自美国invitrogen公司；反转录试剂盒和sybr green聚合酶链反应(pcr)试剂盒购自日本takara公司。
44.mir-19a-3p引物和u6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司生产，mir-19a-3p抑制剂和对照剂由苏州吉玛基因股份有限公司生产。
45.二、实验方法
46.1、临床血液样本采集方法
47.所有受试者均使用edta抗凝管收集外周静脉血，置-80℃保存。本临床研究项目经徐州医科大学附属医院医学伦理委员会批准。
48.入选标准：在本院通过临床症状结合影像学ct或mri首次诊断为急性缺血性脑卒中，年龄范围60～75岁，经美国国立卫生研究院卒中量表评分为4～15分。
49.排除标准：其他类型或继发性脑卒中，例如蛛网膜下腔出血、脑肿瘤和脑血管畸形等；复发性脑卒中；肾脏及肝脏系统疾病；癌；急性传染性疾病；炎症及自身免疫性疾病；抑郁症或精神分裂症等精神疾病。
50.健康人群选择标准：年龄与急性缺血性脑卒中患者组相匹配，均符合上述排除标准，无脑卒中危险因素。
51.2、动物实验分组与处理
52.将91只sd大鼠随机分为5组：假手术组、脑缺血再灌注组、缺血后适应组、脑缺血再灌注+对照剂组与脑缺血再灌注+mir-19a-3p抑制剂组。
53.脑缺血再灌注组和缺血后适应组大鼠各23只，其余三组各15只。采取四动脉结扎法(zhu qj,kong fs,xu h,et al.tyrosine phosphorylation of gluk2 up-regulates kainate receptor-mediated responses and downstream signaling after brain ischemia)建立全脑缺血再灌注模型。大鼠在麻醉状态下分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉，24h后在大鼠清醒状态下使用动脉夹夹闭双侧颈总动脉，15min后取下动脉夹恢复血流供应。缺血时保持其直肠温度在36.5～37.5℃之间。假手术组大鼠给予相同的手术处理，但不夹闭两侧颈总动脉。缺血后适应组，即按上述全脑缺血再灌注模型制备过程，在进行15min的缺血后，再灌注10min时再次施行缺血，3min后恢复血流灌注。脑缺血再灌注+对照剂组是在造模后30min给予单侧脑室注射0.01μmol/l对照剂10μl。脑缺血再灌注+mir-19a-3p抑制剂组是在造模后30min给予单侧脑室注射0.01μmol/l mir-19a-3p抑制剂10μl。对照剂：5
′‑
caguacuuuuguguaguacaa-3
′
(如seq id no.2所示)，mir-19a-3p抑制剂：5
′‑
ucaguuuugcauagauuugcaca-3
′
。
54.3、qrt-pcr法检测临床血液样本和大鼠海马ca1区mir-19a-3p的表达水平
55.用trizol试剂提取血液样本和脑组织总rna，然后用反转录试剂盒逆转录为cdna。以获得的cdna作为模板，依据sybr premix ex taq ii说明书配制pcr反应液，在荧光定量pcr仪上进行qrt-pcr。以u6作为内参基因，采用2-δδct
法计算mir-19a-3p的相对表达水平。
56.引物信息如下：
57.mir-19a-3p逆转录引物(如seq id no.3所示)：5
′‑
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcagttt-3
′
；
58.mir-19a-3p上游引物(如seq id no.4所示)：5
′‑
ctggagtgtgcaaatctatgca-3
′
；
59.mir-19a-3p下游引物(如seq id no.5所示)：5
′‑
gtgcagggtccgaggt-3
′
；
60.u6逆转录引物(如seq id no.6所示)：5
′‑
aaaatatggaacgcttcacgaatttg-3
′
；
61.u6上游引物(如seq id no.7所示)：5
′‑
ctcgcttcggcagcacatatact-3
′
；
62.u6下游引物(如seq id no.8所示)：5
′‑
acgcttcacgaatttgcgtgtc-3
′
。
63.4、尼氏染色法观测大鼠海马ca1区神经元的形态与存活神经元密度
64.(1)组织样本制备
65.在脑缺血再灌注5d，将大鼠麻醉，并将其仰卧固定在解剖板上，打开胸腔暴露心脏，将灌注针从左心尖穿过左心室插入主动脉，再在动物心脏右心耳剪一小口，用大约300ml生理盐水快速冲洗，再灌注200ml含4％多聚甲醛的缓冲溶液，灌注结束后将大鼠断头，取出脑组织至4％多聚甲醛溶液中固定。
66.(2)石蜡切片制作与尼氏染色
67.将脑组织置4％多聚甲醛溶液中固定12h～18h，流水冲洗0.5h～1h，然后经60％、70％、80％、90％、95％和100％梯度乙醇脱水，二甲苯透明，60℃浸蜡后包埋。包埋好的蜡块采用石蜡切片机切片(厚度为6μm)，贴片于载玻片上，63℃摊片2h，常温保存。石蜡切片经二甲苯脱蜡，100％、90％、70％梯度乙醇及超纯水浸水后，尼氏染色液染色3min～10min，水洗终止，95％乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后显微镜下观察细胞形态并计数。将大鼠海马ca1区1mm长度范围内正常形态的锥体神经元数量计为神经元密度。
68.5、行为学实验方法
69.(1)旷场实验
70.观察箱分为中央区和四周。将大鼠从饲养笼取出并迅速放置于观察箱中心，让其在箱内自由活动5min。采用行为学分析软件自动记录大鼠在箱内的活动，分析其运动速度和在中央区停留时间。每只大鼠实验结束后将观察箱用75％乙醇擦拭干净，避免干扰后续大鼠实验。
71.(2)新物体识别
72.新物体识别实验共分为三个阶段：适应期、熟悉期和测试期，分3天完成。在第一天适应期，将大鼠放入观察箱中自由活动5min。在第二天熟悉期，箱内放入完全相同、位置对称的两个物体，将大鼠从非物体区域的中点放入，让其自由探索5min，间隔1h后，再将大鼠从同一位置放入，让其再次自由探索5min。熟悉期结束24h后进入测试期，将其中一个旧物体更换为颜色和形状不同的新物体，让大鼠自由探索5min，分别记录大鼠对新物体和旧物体的探索时间。新物体与旧物体的摆放位置要求依次轮换。在不同的实验阶段和不同大鼠之间，观察箱和物体均用75％乙醇擦拭，避免对后续动物行为造成干扰。探索活动定义为：大鼠鼻子在≤2cm范围内直指向物体或者前爪等直接接触物体。新物体认知指数＝新物体探索时间/(新物体探索时间+旧物体探索时间)
×
100％。
73.6、统计学方法
74.两组间比较采用t检验，多个实验组间单因素比较采用单因素方差分析(one-way anova)，p《0.05为差异有统计学意义。血液样本数据与动物行为学数据以均数
±
标准误(mean
±
sem)表示，其它计量数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示。
75.三、结果
76.1、急性缺血性脑卒中患者血液中mir-19a-3p的表达上调
77.本发明中急性缺血性脑卒中患者均为发病24h内入院并采集外周血液，其中急性大动脉梗死与急性腔隙性梗死各4例。如图1所示，急性缺血性脑卒中组血液中mir-19a-3p的表达水平显著高于对照组(p《0.05)。
78.2、缺血后适应抑制脑缺血再灌注引发的大鼠海马ca1区mir-19a-3p的表达上调
79.用qrt-pcr法检测在脑缺血再灌注6h、12h和24h各组大鼠海马ca1区mir-19a-3p的相对表达情况，结果见图2。在再灌注6h和12h，假手术组、脑缺血再灌注组与缺血后适应组之间的mir-19a-3p表达水平未见显著不同(p》0.05)。在再灌注24h，与假手术组比较，脑缺血再灌注组的mir-19a-3p表达水平显著上升(p《0.05)，而缺血后适应组的mir-19a-3p表达水平显著下降(p《0.05)；与脑缺血再灌注组相比，缺血后适应组的mir-19a-3p表达水平也显著降低(p《0.05)。
80.3、缺血后适应减轻脑缺血再灌注后大鼠海马ca1区神经元的损伤
81.实验分为假手术组、脑缺血再灌注组和缺血后适应组。如图3(a)所示，在脑缺血再灌注5d，假手术组大鼠海马结构完整清晰，ca1区神经元胞体形态规整，胞核清楚，可见2～3层排列整齐紧密的锥体神经元；脑缺血再灌注组大鼠海马ca1区神经元大量死亡，细胞结构被破坏，可见死亡神经元残余碎片；缺血后适应组大鼠海马ca1区神经元排列稍宽松，可见散在的神经元死亡。如图3(b)所示，与假手术组相比，脑缺血再灌注组和缺血后适应组大鼠海马ca1区存活的锥体神经元密度均显著降低(p《0.01)；与脑缺血再灌注组相比，缺血后适应组的大鼠海马ca1区存活的锥体神经元密度显著增加(p《0.01)。
82.4、缺血后适应修复脑缺血再灌注后大鼠的认知功能
83.在再灌注6d，将假手术组、脑缺血再灌注组和缺血后适应组大鼠分别置于旷场实验观察箱中，记录大鼠在旷场中央区运动速度和停留时间，并称量体重。如图4(a～c)所示，各组大鼠体重、在旷场中央区的运动速度和停留时间均无显著差异，说明各组大鼠的自主运动能力和焦虑程度相当。在再灌注7d～9d进行新物体识别实验，如图4(d)所示，与假手术组相比，脑缺血再灌注组和缺血后适应组大鼠认知指数均显著降低(p《0.01,p《0.05)，表明认知功能受损；与脑缺血再灌注组相比，缺血后适应组大鼠认知指数显著增加(p《0.05)(具体数据见表1)。
84.表1缺血后适应对脑缺血再灌注后大鼠旷场和新物体识别行为的影响(mean
±
sem，n＝6)
[0085][0086]
注：ap《0.01，bp《0.05表示与假手术组比较；cp《0.05表示与脑缺血再灌注组比较
[0087]
5、抑制mir-19a-3p减轻脑缺血再灌注后大鼠海马ca1区神经元的损伤
[0088]
实验分为脑缺血再灌注+对照剂组和脑缺血再灌注+mir-19a-3p抑制剂组。如图5(a)所示，在再灌注24h，与对照剂组比较，mir-19a-3p抑制剂组大鼠海马ca1区mir-19a-3p的相对表达水平显著下降。如图5(b)所示，在再灌注5d，对照剂组大鼠海马ca1区神经元数量大幅降低，细胞形态不完整，可见大量死亡细胞碎片；而抑制剂组大鼠海马ca1区神经元排列密集，神经元结构清晰，可见少量死亡神经元的残留碎片。如图5(c)所示，与对照剂组相比，mir-19a-3p抑制剂组大鼠海马ca1区存活的锥体神经元密度显著增加(p《0.01)。
[0089]
6、抑制mir-19a-3p改善脑缺血再灌注后大鼠的认知功能
[0090]
实验分为脑缺血再灌注+对照剂组和脑缺血再灌注+mir-19a-3p抑制剂组。如图6(a～c)所示，与对照剂组比较，mir-19a-3p抑制剂组大鼠体重、在旷场中央区的运动速度和停留时间均无显著差异，表明两组大鼠的自主运动能力和焦虑程度相当。如图6(d)所示，在随后进行的新物体识别实验中，与对照剂组比较，mir-19a-3p抑制剂组大鼠认知指数显著
增加(p《0.05)，提示大鼠认知能力有所改善(具体数据见表2)。
[0091]
表2 mir-19a-3p抑制剂对脑缺血再灌注后大鼠旷场和新物体识别行为的影响(mean
±
sem，n＝6)
[0092][0093]
注：对照剂组：脑缺血再灌注+对照剂组；mir-19a-3p抑制剂组：脑缺血再灌注+mir-19a-3p抑制剂组；ap《0.05表示与对照剂组比较。
[0094]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0095]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.一种mir-19a-3p抑制剂在制备神经保护类药物中的应用，其特征在于，所述mir-19a-3p抑制剂为：5
′‑
ucaguuuugcauagauuugcaca-3
′
。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-19a-3p抑制剂能够用于制备改善脑缺血再灌注后大鼠的认知功能的药物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述mir-19a-3p抑制剂能够用于制备减轻脑缺血再灌注后大鼠神经元的损伤的药物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述mir-19a-3p抑制剂能够用于制备减轻脑缺血再灌注后大鼠海马ca1区神经元的损伤的药物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述mir-19a-3p抑制剂用于降低mir-19a-3p的表达。

技术总结
本发明涉及神经保护类药物制备技术领域，具体公开了一种miR-19a-3p抑制剂在制备神经保护类药物中的应用，所述miR-19a-3p抑制剂为：5


技术研发人员：刘静
受保护的技术使用者：徐州医科大学
技术研发日：2022.10.20
技术公布日：2023/7/22