生成内耳毛细胞的方法与流程

生成内耳毛细胞的方法
发明领域
1.本发明一般性涉及用于产生分化的耳细胞的方法和组合物。具体的，本发明涉及用于从多能干细胞产生内耳细胞的方法和组合物。
2.发明背景
3.以下对

背景技术：
的讨论旨在促进对本发明的理解。讨论并非承认所引用的任何材料在申请的优先权日是或曾经是公知常识的一部分。
4.感觉神经性听力缺失(snhl)是一种原因在于内耳或前庭蜗神经的听力缺失。它占所有报告的听力缺失的约90％。通常，snhl的原因是检测运动和声音的内耳毛细胞受损。内耳毛细胞受损还可导致失去平衡和/或头晕。许多因素都会对这些毛细胞造成损害，包括遗传因素、环境刺激(如噪音)以及耳毒性药物。
5.内耳(脊椎动物耳朵的最内部)，包含两个主要功能部分，即耳蜗和前庭系统。耳蜗专用于听力。它是一个螺旋形的器官，将声音引起的鼓膜和小骨的机械振动转化为流体中的压力波，然后转化为传递到大脑的神经冲动。前庭系统专用于平衡。两部分都含有毛细胞(内耳毛细胞)。
6.耳蜗含有通过响应于声音将耳蜗流体中的声音振动转化为由听觉神经携带到大脑电信号的内毛细胞，和机械放大进入耳蜗的低水平声音以使得内毛细胞感知的外毛细胞。毛细胞位于内耳耳蜗的柯蒂氏器内，由一排内毛细胞和三排外毛细胞组成。通过位于每个毛细胞顶面的立体纤毛束结构的机械刺激来实现声音检测。哺乳动物的毛细胞在发育过程中增殖，但在出生后不久就失去了再生能力，因此对儿童和成人的这些细胞的损伤是永久性的，并可以导致无法弥补的听力损失。
7.前庭系统还含有类似地将机械运动转换为在大脑中被解读为平衡感和空间定向感的电信号的毛细胞(前庭毛细胞)。
8.内耳毛细胞的发育
9.需要来自信号通路的众多发育线调节形成正确的毛细胞及其纤毛束细胞器。许多类型的遗传性耳聋可归因于内耳发育过程中信号通路的缺陷，并对毛细胞造成长期不可逆的损伤。
10.人类的内耳在受孕后大约第4周开始发育。它源自一对感觉基板(是外胚层的增厚物)，称为耳基板。耳基板向内折叠，形成凹陷，该凹陷之后从表面分离以形成充满流体的耳囊泡。然后耳囊泡分化成各种内耳结构，包括耳蜗和半规管。早期发育阶段的耳囊泡可分为前神经原性组分和前感觉(prosensory)组分。神经原性成分产生听觉和前庭神经元，前感觉组分(耳前感觉囊泡)产生支持细胞和毛细胞。
11.在内耳发育过程中，耳囊泡细胞被确定为感觉或非感觉细胞的命运，这些细胞后来产生感觉毛细胞和螺旋神经节以及非感觉支持细胞。耳囊泡的区域特化对于将耳囊泡细胞导向前感觉命运至关重要。在发育中的耳蜗管中，前感觉区域包含形成柯蒂氏器的感觉毛细胞和非感觉支持细胞的祖细胞。柯蒂氏器是一种沿着耳蜗管的长度延伸并侧接两个非感觉区域(大上皮脊(ger)和小上皮脊(ler))的特化的感觉上皮细胞。在柯蒂氏器内，感觉
毛细胞被非感觉支持细胞包围，即hensen细胞、柱状细胞和deiters细胞。
12.多种标志物参与发育过程中毛细胞的特化。sox2、eya1、six1、notch和fgf信号参与柯蒂氏器的细胞命运的特化。前感觉细胞表达jagged2(jag2)、δ样1(dll1)和δ样3(dll3)，其导致notch通路激活并通过抑制bhlh基因atoh1(毛细胞分化诱导子)来抑制毛细胞命运。notch信号的抑制导致atoh1阳性毛细胞的增加。
13.柯蒂氏器的前感觉区域以细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子p27kip1的表达为显著标志。在胚胎第12天和第14天(小鼠胚胎发育阶段e12.0至e14.0)之间祖细胞退出细胞周期并终止它们从耳蜗管顶端向耳蜗管基部的增殖。在新生的柯蒂氏器中，毛细胞分化从基部向顶端开始，因为毛细胞分化因子基因atoh1的表达始于e13.5和e14.5之间的耳蜗基部，并在e17.5左右到达顶端。小鼠外植体中eya1、six1和sox2的过度表达可诱导耳蜗中非感觉ger区域的异位atoh1表达和毛细胞再生。
14.sonic hedgehog通路
15.sonic hedgehog(shh)信号通路也参与耳细胞的发育。shh通路在许多器官的发育过程中调节上皮-间充质相互作用。shh蛋白在上皮细胞中合成，在许多情况下通过在相邻间充质细胞中表达的其受体patched 1(ptch1)充当旁分泌因子。shh信号的破坏为其在器官生成中的重要和多样的作用提供了证据。shh敲除小鼠表现出各种发育缺陷，包括独眼、神经管缺陷和远端肢体结构缺失。使用环巴胺(cyc)抑制shh信号进一步证明了shh信号在神经管、胃肠道、胰腺发育和毛囊形态发生中的作用。
16.shh信号通路包含shh、cdo、ptch1、smoothened(smo)、gli-1、gli-2和gli-3。shh是由cdo、ptch1和smo组成的受体复合物的配体。smo被认为可以转导信号，并且是shh信号通路的关键元件。gli-1、gli-2和gli-3是转录因子。
17.虽然有一些研究旨在确定shh信号通路在内耳毛细胞的发育和分化中的作用，但刺猬家族每个成员的确切作用尚不清楚。
18.内耳类器官
19.需要在体外发育毛细胞及其周围组织，以研究这些结构并用于治疗用途。
20.类器官是具有形成与人体器官的形态和功能类似物的能力的3d细胞聚集体。由于它们的再生和分化的能力，它们还可以用于疾病建模、药物筛选、组织工程以及突变机制的分析。类似于耳蜗毛细胞和功能性突触的类器官的开发也可用于开发用于听力缺失或耳聋的干细胞疗法。
21.多能干细胞为开发此类模型以及生产用于干细胞治疗的内耳毛细胞提供了一种可能的方法。
22.多能干细胞是可以增殖和分化成不同细胞类型的细胞。多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。胚胎干细胞来源于胚胎的未分化内部细胞团。诱导性多能干细胞是通过将体细胞或分化的祖细胞重新编程为多能性状态而从成体细胞产生的。尽管起源于体细胞，诱导多能干细胞能够永久生长并分化成三个胚层的细胞。
23.虽然多能干细胞的分化可以自发发生，但也可以通过在存在或不存在参与分化过程的特定分子的情况下培养细胞来诱导分化。整个分化过程中分化的阶段和细胞的身份可以通过测试已知存在于不同分化阶段的标志物的存在或不存在来识别。
24.最近的研究已经在源自人诱导多能干细胞(hipsc)的类器官中生成了功能性机械
敏感前庭或推定的耳蜗毛细胞，作为研究遗传疾病和潜在治疗方法的替代模型。例如，koehler等人，nature biotechnology,(2017),35(6)583报道了由来自人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞的内耳类器官和感觉神经元支配的感觉上皮细胞的发育。具体的，koehler等人，2017报道了通过使用三维培养系统和调节tgfβ(转化生长因子-β)、bmp(骨形态发生蛋白)、fgf(成纤维细胞生长因子)和wnt(wingless int-1)信号来发育耳囊泡样结构。这些囊泡在2个月的过程中发育成具有感觉上皮细胞的内耳类器官。koehler等人，2017报道了类器官细胞采用了前庭ii型毛细胞表型。虽然koehler等人，2017描述的过程产生内耳毛细胞、但优先诱导非感觉或未成熟的耳上皮。koehler等人，2017报道毛细胞诱导的效率似乎很低。
25.美国专利9,624,468描述了一种从多能干细胞生成内耳组织的方法。具体的，它描述了一种从人多能干细胞中生成机械敏感毛细胞的方法，其包括：(i)在导致从培养的多能干细胞形成胚状体的条件下培养多能干细胞；(ii)向胚状体添加细胞外基质蛋白；(iii)在bmp2、bmp4或bmp7和tgfβ抑制剂存在下培养胚状体以形成非神经外胚层；(iv)在不存在bmp4和tgfβ抑制剂的情况下，在存在外源fgf和bmp抑制剂的情况下，在漂浮培养物中培养在(iii)中形成的非神经外胚层，以生成前基板外胚层；(v)在不存在外源fgf和bmp抑制剂的情况下，在漂浮培养物中培养前基板外胚层，以获得耳基板和从耳基板分化的内耳感觉毛细胞；和(vi)在wnt/β-catenin信号激活剂存在下培养(v)中的前基板外胚层。该专利中鉴定的内耳感觉毛细胞包括ii型前庭毛细胞。
26.通过参考它们展示的标记来识别处于不同发育阶段的细胞。9,624,468中的hipsc表现出早期耳细胞标志物(包括耳基板的配对框8(pax8)；外胚层特征的e-钙粘蛋白(ecad)和n-钙粘蛋白(ncad)；神经外胚层的sox2和耳囊泡的配对盒2(pax2))的特征。koehler报告了这些标志物的表达，以证实内耳发育的早期阶段(koehler等人，2017)。
27.第35天后，在成熟的类器官中也发现了成熟的推定耳蜗毛细胞，类似于内耳发育的耳蜗毛细胞分化阶段(jeong等人，cell death and disease(2018)9:922)。
28.然而，内耳毛细胞，特别是内毛细胞的生成仍然很困难，并且在迄今为止描述的类器官模型中仍有提高毛细胞分化效率的空间。本发明的一个目的是克服现有技术的缺点。
29.发明概述
30.本发明基于一个意外的发现，即在内耳细胞发育过程中抑制sonic hedgehog通路可以提高内耳毛细胞分化的效率。特别地，本发明尤其提供了使用迄今已描述的类器官模型生成内耳毛细胞，特别是内毛细胞的方法。
31.在第一方面，本发明提供了产生内耳毛细胞的方法，其包括以下步骤：
32.a.在足以部分抑制shh通路的量的shh抑制剂和包含5-10％的ehs小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物的培养基存在下培养耳前感觉囊泡；
33.b.从来自步骤a的的培养物去除shh抑制剂；和
34.c.将来自步骤b的细胞在包含5-10％的ehs小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物的培养基中培养以形成内耳毛细胞。
35.优选地，本发明第一方面的步骤a至c发生在特定时间段内。最优选地，步骤a发生约10天以形成耳基板和耳囊泡；步骤b发生约15天以形成感觉上皮；步骤c发生约68天以形成毛细胞和神经支配直至成熟。
swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物的培养基中，在wnt激动剂存在的情况下，培养前基板耳上皮细胞以产生前感觉耳前感觉囊泡。优选地，wnt激动剂是chir-99021。
53.发明人已经确定通过用shh抑制剂处理耳前感觉囊泡来抑制shh途径可以增加内耳毛细胞的分化效率。本发明第一方面的优选形式中的步骤a至c涉及在shh抑制剂存在下培养耳前感觉囊泡。
54.本发明的方法中使用的shh抑制剂可以抑制shh途径中的任何分子。优选地，shh抑制剂选自环巴胺(cyc)(来自merck millipore的cat 239803)、gant58(来自stem cell technologies的cat 73984)或gant61(来自stem cell technologies的cat 73692)。shh抑制剂以足以部分抑制shh通路活性的量存在。优选地，shh抑制剂将shh途径的活性抑制50％至70％。在一个特别优选的实施方案中，shh抑制剂是环巴胺并且它以1-2μm的终浓度存在于本发明第一方面的优选形式的步骤a中。在另一个优选的实施方案中，shh抑制剂是gant61并且以1-2μm的终浓度存在于步骤a中。在另一个优选的实施方案中，shh抑制剂是gant58并且以1-2μm的终浓度存在于步骤a中。
55.在本发明第一方面的优选形式的步骤b和c中，从细胞培养基中去除shh，但在含有5-10％的ehs小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物的培养基中继续培养细胞直至成熟。优选地，使用悬滴法培养细胞。最优选地，在不振荡的情况下培养细胞。
56.优选地，本发明第一方面的优选形式的步骤aa2至c发生在特定时间线内。优选地，时间线模拟体内到达每个阶段所花费的时间。最优选地，步骤aa2至c根据以下时间线发生：
57.(i)步骤aa2发生在第0天到第3天，其中第0天是步骤aa2开始非神经外胚层形成的那一天；
58.(ii)步骤aa3从第4天到第7天发生以形成早期前耳基板上皮；
59.(iii)步骤aa4从第8天到第17天发生以形成耳基板和耳囊泡；
60.(iv)步骤b从第18天到第32天发生以形成感觉上皮；
61.(v)步骤c从第33天至第100天发生以形成毛细胞和神经支配直至成熟的。
62.优选的，成熟发生在第60-200天。
63.多能干细胞可来自任何生物。优选地，多能干细胞是人多能干细胞。在另一个优选的实施方案中，多能干细胞是诱导的人多能干细胞。该诱导的多能干细胞可来自任何细胞系。
64.本发明的方法产生的内耳毛细胞可以是任何类型的。在特别优选的实施方案中，内耳毛细胞是内毛细胞。
65.在第二方面，本发明包括组合物，该组合物包含通过本发明的方法产生的内耳毛细胞。在一些实施方案中，该组合物可以另外包含其他试剂，如防腐剂。优选地，该组合物另外包含一种或多种药学上可接受的试剂。
66.在第三方面，本发明包括治疗患有感觉神经性听力缺失的受试者的方法，其通过施用包含由本发明的方法产生的内耳毛细胞的组合物。
67.在第四方面，本发明包括用于评价测试剂的耳毒性或治疗效果的方法，其包括用测试剂处理由本发明方法产生的内耳毛细胞的群体或包含内耳毛细胞的类器官并测量该测试剂对细胞或类器官的效果的步骤。
68.在第五方面，本发明包括诊断患者耳科疾病的方法，其包括评估患者来源的内耳
毛细胞群体或患者来源的类器官中该疾病特异的标志物存在或不存在的步骤，该患者来源的内耳毛细胞群体或患者来源的类器官包含由本发明的方法产生的内耳毛细胞。
69.在第六方面，本发明包括组合物在制备用于治疗有需要的受试者的感觉神经性听力缺失的药物中的用途，所述组合物包含通过本发明的方法产生的内耳毛细胞。
70.在第七方面，本发明包括在受试者中再生内耳毛细胞的方法，其包括向受试者的内耳施用shh抑制剂的步骤。优选地，shh抑制剂选自环巴胺(cyc)(来自merck millipore的cat 239803)、gant58(来自stem cell technologies的cat 73984)或gant61(来自stem cell technologies的cat 73692)。shh抑制剂以足以部分抑制shh通路活性的量存在。优选地，shh抑制剂将shh途径的活性抑制50％至70％。在一个优选的实施方案中，以1-2μm的浓度施用shh抑制剂。
71.在第八方面，本发明包括通过本发明的方法产生的内耳毛细胞。
72.在第九方面，本发明包括类器官，所述类器官包含通过本发明的方法产生的内耳毛细胞。
73.在第十方面，提供了增强受试者中内耳毛细胞分化的方法，其包括部分抑制受试者中cdo表达的步骤。优选地，通过向受试者施用治疗有效量的sirna或crispr来抑制cdo表达。
74.通过阅读随后的描述，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员而言将变得显而易见，随后的描述参考以下说明性附图进行。
附图说明
75.下面提供的图说明了以下优选实施方案和实施例中的发明。
76.图1提供本发明优选方法的步骤概述。具体的，它提出了使用示例试剂来促进人ips细胞的毛细胞分化的本发明的方案。
77.图2在10倍放大倍数下通过使用毛细胞标志物肌动蛋白viia和支持细胞标志物sox2显示了e16.5 cdo-/-突变体的柯蒂氏器中毛细胞的额外形成和支持细胞的扩增。
78.图3在10倍放大倍数下使用毛细胞标志物肌动蛋白viia和神经标志物β-微管蛋白iii tuj1抗体标记e16.5时的毛细胞和进入耳蜗的神经支配显示了shh
+/-；cdo-/-复合突变体耳蜗中的多余毛细胞。
79.图4在20倍放大倍数下使用毛细胞标志物肌动蛋白viia和神经标志物tuj1抗体标记毛细胞和进入e16.5耳蜗的神经支配显示了shh
+/-；cdo-/-复合突变体耳蜗中具有神经支配的异位毛细胞。
80.图5在10倍放大倍数下使用柱状细胞特异性标志物p75ntr标记e16.5时的耳蜗中的柱状细胞以显示cdo-/-突变体中不存在柱状细胞。
81.图6显示了e16.5时小鼠耳蜗中支持细胞中cdo表达。
82.图7显示了从基底到顶端区域在e14.5时的cdo和cdo/shh复合突变体耳蜗中通过sox2的前感觉区域特化。
83.图8显示了从基底到顶端区域在e14.5时的cdo和cdo/shh复合突变体耳蜗中通过p27kip1的细胞周期退出。
84.图9显示了e13.5和e16.5时小鼠耳蜗中shh通路中gli基因表达。
85.图10在4倍和10倍放大倍数下显示了第1-10天时人ipsc来源的内耳类器官的总体形态。
86.图11在10倍放大倍数下显示了第20-40天时人ipsc来源的内耳类器官的总体形态。
87.图12在10倍放大倍数下通过使用ecad和pax2显示了第20天时人ipsc来源的内耳类器官中外胚层细胞的命运。
88.图13在10倍放大倍数下通过使用ncad和sox2显示了第40天时人ipsc来源的内耳类器官中的耳部身份。
89.图14在10倍放大倍数下使用毛细胞标志物肌球蛋白viia和神经标志物tuj1抗体标记毛细胞和神经支配显示了第60天时人ipsc来源的内耳类器官中具有神经支配的毛细胞。
90.图15显示了通过单细胞rna测序的第60天时人ipsc来源的内耳类器官的细胞命运分析。
91.图16显示了通过定量实时聚合酶链式反应(qrt-pcr)分析对第20天和第60天时人ipsc来源的内耳类器官进行基因表达测定。
92.图17显示了用环巴胺、gant58和gant61处理的第60天时的类器官组织切片中的肌动蛋白viia和tuj1表达，如使用共聚焦显微镜在20倍放大倍数下观察到的。
93.图18显示了用环巴胺、gant58和gant61处理的第60天时的类器官组织切片中的sox2和tuj1表达，如使用共聚焦显微镜在20倍放大倍数下观察到的。
94.发明详述
95.本发明涉及用于从多能干细胞产生内耳毛细胞的改进方法和组合物。本发明基于意外的发现，即在内耳细胞发育过程中抑制sonic hedgehog通路可以改善内耳毛细胞分化的效率。
96.为方便起见，以下部分一般性概述了本文使用的术语的各种含义。在该讨论之后，讨论了本发明的一般方面，接着是展示本发明的多个实施方案的特性的具体实例。
97.定义
98.本领域的技术人员将理解，除了具体描述的之外，本文描述的本发明易于进行变化和修改。本发明包括所有此类变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及任何和所有组合或任何两个或多个步骤或特征。
99.本文中引用的每份文件、参考文献、专利申请或专利均通过引用明确整体并入本文，这意味着读者应阅读并将其并视为本文的一部分。本文中引用的文献、参考文献、专利申请或专利，为简明起见，本文中不再重复。然而，所引用的材料或该材料中包含的信息均不应被理解为公知常识。
100.本发明的范围不受本文描述的任何特定实施方案的限制。这些实施方案旨在仅用于示例的目的。功能等同的产品、制剂和方法显然在本文所述的本发明的范围内。
101.本文所述的发明可包括一个或多个数值范围(例如大小、浓度等)。数值的范围将被理解为包括该范围内的所有数值，包括定义该范围的数值，以及与该范围相邻的数值，这导致与定义范围边界的值紧邻的值相同或基本相同的结果。
102.贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或诸如“包括”的变体将被
9)、a 83-01(cas no.909910-43-6)、gw 788388(cas no.452342-67-5)、ly 364947(cas no.396129-53-6)、repsox(cas no.446859-33-2)、sb 505124(cas no.694433-59-5)、sb 525334(cas no.356559-20-1)或sd 208(cas no.356559-20-1)。优选地，tgfβ抑制剂是sb-431542并且以2μm至20μm、2.5μm至12.5μm、1μm至15μm或最优选约5-10μm的浓度存在。
120.在本发明的一些优选实施例中，步骤aa2中化学成分确定的分化培养基另外包括由engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的胶状蛋白混合物和fgf。这是为了给形成非神经外胚层和前耳基板上皮提供结构。
121.优选地，engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物是(cat a356231,corning)。在一个优选的实施方案中，engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物的浓度低，为约5-10％。在一个特别优选的实施方案中，engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物以10％的浓度存在。
122.在其他实施方案中，步骤aa2中的化学成分确定的分化培养基另外包含bmp(骨形态发生因子)。胚状体分化成非神经外胚层可以需要bmp活性的存在。在一些细胞系中，例如gibco ipsc细胞系，内源性bmp活性足以满足非神经特化，而无需向培养基中进一步添加bmp以诱导非神经外胚层形成。然而，在其他细胞系中，添加bmp以诱导非神经外胚层形成可能是必要的。优选地，bmp选自bmp2、bmp4或bmp7。优选地，bmp是bmp4。该方法中使用的bmp的浓度可以在至少约1ng/ml至约50ng/ml的范围内，例如，约2ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、12ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、32ng/ml、40ng/ml，或至少约1ng/ml至约50ng/ml的另一bmp浓度。在一些实施方案中，使用的bmp是浓度为约2.5ng/ml bmp4的bmp4。
123.非神经外胚层的形成以存在非神经外胚层标志物(如tfap2a和dlx3)和不存在神经外胚层标志物(如pax6和n-钙粘蛋白)为特征。在一些实施方案中，非神经外胚层的形成通过在开始步骤aa3之前筛选一种或多种非神经外胚层标志物的存在来确认。
124.步骤aa3
125.步骤aa3包括从步骤aa2中的非神经外胚层细胞形成前耳基板上皮。优选地，在第4-7天进行步骤aa3，即步骤aa3发生约4天。
126.在步骤aa3期间，用fgf和bmp抑制剂处理非神经外胚层细胞。fgf激活和bmp抑制对于从非神经外胚层细胞诱导前基板和耳是必需的。
127.优选地，fgf是fgf2、fgf3或fgf10。fgf以大于步骤aa2中浓度的浓度存在。优选地，fgf以5ng/ml至100ng/ml的浓度存在。最优选地，fgf是以约50-100ng/ml的终浓度存在的fgf2。该方法中使用的fgf的浓度可以在至少约40ng/ml/至约100ng/ml的范围内，例如，约40mg/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml、85ng/ml、90ng/ml、95ng/ml，或至少约50ng/ml至约100ng/ml的另一fgf浓度。最优选地，fgf以50ng/ml的终浓度存在。最优选地，fgf是以50ng/ml的终浓度存在的fgf2。
128.bmp抑制剂选自ldn-193189(cas no.1062368-24-4)、dmh1(casno.1206711-16-1)或dorsomorphin(cas no.ldn-193189)。优选地，bmp抑制剂是ldn-193189。优选地，bmp抑制剂以100-200nm的浓度存在。该方法中使用的bmp的浓度可以在至少约100nm至约200nm的范围内，例如100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm，或100nm至200nm的另一浓度。优选地，bmp抑制剂以约200nm的浓度存在。
129.前耳基板上皮的形成以标志物例如pax8、sox2、tfap2a、ecad和ncad的存在为特征。在一些实施方案中，前耳基板上皮的形成通过在开始步骤aa4之前筛选一种或多种非神经外胚层标志物的存在来确认。
130.步骤aa4
131.步骤aa4包括从步骤aa3中的前耳基板上皮细胞形成耳前感觉囊泡。优选地，在第8-17天进行步骤aa4，即步骤aa4发生约10天。
132.前耳基板上皮可发育成耳组织或鳃上的组织。wnt通路的激活已显示对耳发育是重要的，但对鳃上发育不重要。因此，在步骤aa4期间，用wnt激动剂处理来自步骤aa3的前耳基板上皮。
133.在一些实施方案中，wnt的激动剂是gsk3抑制剂。在一些实施方案中，gsk3抑制剂选自chir 99021、chir 98014、bio-丙酮肟、licl、sb 216763、sb 415286、ar a014418、1-氮杂肯帕罗酮和bis-7-吲哚基马来酰亚胺。优选地，该wnt-β抑制剂是chir99021。在优选的实施方案中，wnt激动剂在培养基中以至少约1μm至约10μm的浓度存在，例如1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、7μm、8.5μm、1.5μm至5μm、2μm至4μm，或约2μm至约10μm的另一浓度。最优选地，wnt激动剂是以2-3μm的终浓度存在的chir99021。
134.优选地，从第8-11天开始，在6孔悬浮培养板中用wnt激动剂处理细胞以形成耳基板，然后在第12天，在含有由engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物(例如)的类器官成熟培养基中重新悬浮产生的类器官。优选地，在孵育类器官一小时后更换培养基，以使ehs小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物(例如)凝固。优选地，以0.1％至20％、1％至15％或2.5％至12.5％的浓度存在。最优选地，matrigel以5-10％的浓度存在。
135.优选地，然后在第12-14天将wnt激动剂添加到培养物中，优选浓度约为2-3μm，以诱导耳窝的形成。耳窝的形成以标志物如pax2、pax8、sox2、sox10和jag1的存在为特征。在wnt激动剂存在下培养类器官直到第17天，以形成耳前感觉囊泡。在一些实施方案中，在开始下一步之前，通过筛选一个或多个耳窝标志物的存在来确认耳前感觉囊泡的形成。
136.步骤a至c-shh通路的抑制
137.在本发明的一个方面，提供了产生内耳毛细胞的方法，其包括用shh抑制剂处理耳前感觉囊泡并培养经处理的细胞直至成熟以形成内耳毛细胞。
138.本发明人已经发现在内耳毛细胞发育过程中的特定点抑制shh通路增加内耳毛细胞分化的效率。具体的，本发明人发现在毛细胞分化阶段(早期毛细胞增殖和生长期之后)抑制shh信号可以增加内耳毛细胞分化的效率。
139.不受理论的束缚，认为hedgehog配体shh(在耳蜗长出过程中由螺旋神经节神经元瞬时产生)激活前感觉细胞中的hedgehog信号。
140.认为在内耳发育的早期阶段，耳囊泡中听觉细胞的命运是由shh的直接作用建立的。这是祖细胞生长的阶段。内耳形态发生和听觉区室，包括kolliker器官和螺旋神经节细胞，都是随着hedgehog信号的激活而形成的。hedgehog信号的激活在内耳形态发生、耳蜗祖细胞增殖和前感觉形成中起着不同的作用。研究表明，在此早期阶段添加shh信号通路激动剂可促进耳细胞形成、增殖和生长。
141.然而，shh通路在内耳发育后期、在前感觉阶段之后、包括在毛细胞分化阶段的作
用尚未确定。分化阶段是细胞采用支持、毛细胞或神经元构型的阶段。本发明人已确定抑制hh信号促进毛细胞分化并诱导前感觉细胞过早退出细胞周期，转而分化为毛细胞。不受理论的束缚，抑制shh通路后祖细胞分化为毛细胞可以涉及atoh1的上调，造成如图7-8和12-18所示的毛细胞分化。
142.shh通路与调节内耳毛细胞的发育密切相关。具体的，shh通路可以参与诱导耳囊泡分化为非感觉细胞或维持它们的非感觉命运，以及限制柯蒂氏器内的前感觉区域。敲除参与shh通路的分子的突变体显示出额外的毛细胞分化和减少的支持细胞分化。因此，不受理论的束缚，在耳囊泡形成后用抑制剂抑制shh通路减少了耳囊泡分化为非感觉命运(即支持细胞)，并增加了分化为感觉命运的效率，即分化为内耳毛细胞。
143.然而，完全抑制shh通路是不可取的，因为这会导致许多内耳结构发育不良。因此必须部分抑制shh通路。优选地，将shh通路抑制约50％至70％。
144.cdo(细胞粘附分子相关，由致癌基因下调)是hedgehog shh通路的新型受体。cdo突变导致前脑无裂畸形(由前脑中线缺陷确定，与shh通路活性减弱显著相关的一种人先天性异常)。cdo作为shh信号和反馈网络的组分和靶标发挥功能。cdo通过作为ptch1的共受体或通过gli转录因子的调控来增强shh信号。在内耳形态发生过程中需要gli阻遏物和激活物的适当平衡来介导shh信号。cdo纯合基因敲除小鼠有严重的听力缺失。发明人惊奇地发现，与野生型小鼠相比，cdo纯合子和shh杂合子基因敲除小鼠表现出增加的内耳毛细胞分化，表明在本发明中shh抑制剂如何起到增加内耳毛细胞分化作用的可能机制。发明人还鉴定出表现出增加的毛细胞分化的cdo纯合子和shh杂合子基因敲除小鼠表现出50％至70％之间的shh通路抑制。
145.术语“shh抑制剂”是指能够抑制shh通路中任何分子的药物。例如，shh抑制剂可以抑制smoothened(smo)、gli转录因子或shh本身。优选地，shh抑制剂选自：环巴胺(smo抑制剂)、gant61(gli抑制剂)、gant58(gli抑制剂)、cdo(shh抑制剂)、维莫德吉(vismodegiband)(smo抑制剂)、伊莫德吉(erismodegib)(smo抑制剂)、三氧化二砷(gli抑制剂)、ipi-929(smo抑制剂)、bms-833923/xl139(smo抑制剂)、pf-04449913(smo抑制剂)、ly2940680(smo抑制剂)、ru-ski(shh抑制剂)或抗shh单克隆抗体5e1(shh抑制剂)。最优选地，shh抑制剂是环巴胺(smo抑制剂)、gant58或gant61(gli抑制剂)。
146.在一个优选的实施方案中，将shh抑制剂添加到含有耳前感觉囊泡的培养基中。优选地，使用上述步骤aa1至aa4产生耳前感觉囊泡。发明人已经发现添加shh抑制剂的时间对于增强内耳毛细胞分化可以是特别重要的。优选地，在前感觉阶段之后，将shh抑制剂添加到含有耳前感觉囊泡的培养基中(优选来自步骤aa4)。最优选地，在从步骤aa2开始的第18天添加shh抑制剂。在第18天左右添加shh抑制剂对于人源细胞尤为重要。
147.shh抑制剂以足以部分抑制shh通路活性的量存在。优选地，shh抑制剂以0.5至20μm的浓度存在，例如0.5、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、7μm、8μm、9μm、10μmμm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm或约0.5μm至约20μm的另一浓度。
148.在另一个优选的实施方案中，shh抑制剂是环巴胺并且以0.5μm至3μm的终浓度存在。最优选地，shh是环巴胺并且以0.5μm
–
2μm的终浓度存在。最优选地，环巴胺以1μm的终浓度存在。在另一个优选的实施方案中，shh抑制剂是gant61并且以0.5μm至20μm的终浓度存在。最优选地，shh抑制剂是gant61并且以1μm
–
3μm的终浓度存在。最优选地，gant61以2μm的
终浓度存在。在另一个优选的实施方案中，shh抑制剂是gant58并且以0.5μm至3μm的终浓度存在。最优选地，shh抑制剂是gant58并且以0.5μm
–
2μm的终浓度存在。最优选地，gant58以1μm的终浓度存在。在另一个实施方案中，shh抑制剂抑制shh通路中的cdo。优选地，cdo的抑制剂抑制cdo的表达并且是sirna或crispr。
149.在步骤a中，将shh抑制剂与ehs小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物(例如，)一起添加。优选地，以约5-10％的浓度存在。浓度为约5-10％的的存在可改善类器官(例如来自步骤aa4的那些类器官)的悬浮。改善的类器官悬浮液允许使用本领域已知的悬滴法培养细胞，无需摇动以使类器官置于培养基中。这样做的好处是不会很快变干，并且可以更好地观察细胞运动。所用matrigel的特定浓度(5-10％)具有足以容纳三维类器官的优势。优选地，matrigel以0.1％至20％、1％至15％或2.5％至12.5％的浓度存在。最优选地，matrigel以5-10％的浓度存在。
150.优选地，在步骤a中培养细胞约10天。更优选地，将细胞培养至第32天(从步骤aa2开始)以形成感觉上皮。
151.在步骤b中，从培养基去除shh抑制剂。优选地，shh通过洗涤去除。最优选地，细胞保留在含有约5-10％的细胞培养基中。
152.在一个优选的实施方案中，步骤c发生在第33天(从步骤aa2开始)持续至少1天。
153.在步骤c中，优选在含有约5-10％的细胞培养基中培养细胞直至成熟。优选地，细胞培养基还包括类器官成熟培养基，其是用于有效建立类器官培养长期维持的无血清细胞培养基。
154.优选地，培养类器官直至成熟。在一个实施方案中，成熟发生在从步骤aa2开始的60-200天之间。优选的，成熟发生在第60-100天。通过评价细胞的形态来鉴定成熟。
155.优选地，类器官在含有5-10％和1ml类器官成熟培养基的48孔悬浮板的各个孔中成熟。优选地，每孔每天更换200μl培养基。最优选地，使用悬滴法培养类器官并且在培养过程中不摇动。
156.在一些实施方案中，在步骤aa2开始第35天之后检测内耳毛细胞。优选地，内耳毛细胞是内毛细胞。最优选地，内耳毛细胞还表现出原位神经支配。可以通过使用myoviia毛细胞和tuj1神经细胞标志物进行免疫染色来识别内耳毛细胞和神经支配的存在。可以通过单细胞rna测序分析来确定类器官中耳细胞命运的群体。
157.选择标准
158.可以在整个发育过程中对通过此处描述的过程形成的类器官进行成像和分析，以确认类器官正在显示与每个发育阶段一致的形态并表达生物标志物。类器官成像方法是本领域已知的，包括每2周评价类器官的表型表征和使用具有扩展景深(edf)的倒置显微镜、共聚焦成像系统和高内涵分析平台对3d细胞模型进行可视化以成像并分析3d内耳类器官。
159.确保细胞保持每个发育阶段预期的生理形态、表达标志物和显示活动对于确保类器官的质量很重要。测量质量的方法是本领域已知的。例如，可使用cell将经历氧化应激的细胞核标记为红色，将活细胞细胞核染成蓝色。不选择经历氧化应激的细胞(即那些经历细胞死亡的细胞)进一步成熟。还可以使用细胞毒性测定。例如，在培养过程中每2周，通过cell rox@(cat c10444 thermofisher)和活/死活力/细胞毒性测定来测定内耳类
器官中的细胞活力以评估3d细胞模型(cat l7013 thermofisher)。使用此类测定，可以选择具有活力且无细胞毒性的类器官。
160.如前所述，可以通过在接种后测试特定细胞标志物来跟踪内耳器官的发育，并选择表达特定细胞标志物的类器官进行下一步。在步骤aa1结束后约6天可以发现外胚层细胞标志物e-钙粘蛋白(cadherin)和n-钙粘蛋白；在步骤aa4期间约十二天后，可以发现耳细胞标志物pax8和耳囊泡标志物pax2。在步骤aa4结束后约18天(从aa2开始)可以找到内耳祖细胞标志物sox2。毛细胞标志物myoviia和myovi通常在步骤c的毛细胞分化33天后(从aa2开始)开始显示。内耳神经元标志物tuj1和鬼笔环肽可在步骤c后约第33天后发现。
161.通过定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)的基因表达分析，可以使用一系列内耳特异性标志物来确定内耳类器官的生长和健康。选择表达内耳特异性基因的类器官用于进一步培养以使其成熟。
162.随着功能基因组学(包括单细胞分析和高通量转录组学)的进步，可以在系统水平上研究类器官的细胞组成，以更全面地了解内耳类器官的发育和细胞组成。这些技术将是本领域技术人员已知的。
163.组合物
164.另一方面，本发明包括包含内耳毛细胞的组合物，或包含通过本发明的方法形成的内耳毛细胞的类器官。
165.本发明的组合物可以与各种其他组分组合以产生本发明的不同治疗形式。优选地，组合物与药学上可接受的载体或稀释剂组合以产生药物组合物(其可用于人或动物用途)。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。
166.如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充活性成分也可掺入该组合物。参见，例如，remington's pharmaceutical sciences,19th ed.(1995,mack publishing co.,easton,pa.)，其通过引用并入本文。
167.药物组合物的优选形式取决于预期的给药方式和治疗应用。根据本发明制备的药物组合物可以通过造成本发明的组合物与受试者的内耳接触的任何方式施用。
168.根据所需的制剂，组合物还可以包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，它们被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的载体。选择不影响肽的生物活性的稀释剂。这种稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液。另外，药物组合物或制剂还可以包含其他载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。
169.另外，组合物中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、ph缓冲物质等。药物组合物的其他成分是动物油、植物油或合成油的那些成分，例如花生油、大豆油和矿物油。通常，二醇如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。
170.本文所述的给药途径仅旨在作为指导，因为熟练的从业者将能够容易地确定任何特定患者的最佳施用途径。
171.治疗方法和用途
172.在另一方面，本发明提供了用于治疗有需要的受试者的感觉神经性听力缺失的方
法，所述方法包括以下步骤：向患者施用有效量的包含通过本发明的方法产生的内耳毛细胞的组合物。
173.如本文所用，术语“患者”通常包括哺乳动物，如：人类；农场动物如绵羊、山羊、猪、牛、马、美洲驼；伴侣动物如狗和猫；灵长类动物和鸟。优选地，患者是人。
174.可以通过本领域已知的多种测试来诊断受试者的感觉神经性听力缺失。例如，可使用识别受试者听力阈值水平的纯音测听诊断感觉神经性听力缺失。可用于诊断和/或测量感觉神经性听力缺失的任何改善或恶化的其他测试包括耳声发射测试和听性脑干反应测试。
175.本发明的组合物可用于再生医学应用，从而替换或再生患者的受损组织。在一个实施方案中，本发明的组合物可以移植到有需要的患者体内。例如，通过本发明的方法产生的内耳毛细胞和类器官可以直接移植到有需要的患者体内。在另一个实例中，包含内耳毛细胞的内耳类器官可以使用患者自己的ipsc通过本发明的方法产生。一旦产生了内耳毛细胞，就可以将这些细胞送回患者的耳蜗中供发育和应用。本领域已知的移植技术可用于将包含内耳毛细胞的本发明的组合物递送到患者的耳蜗中。
176.或者，本发明的组合物可用于细胞治疗、生物打印和组织工程应用。例如，3d生物打印可用于将本发明方法产生的患者来源的内耳毛细胞和类器官生物打印成特定形状的纳米颗粒材料，并将修复的毛细胞送回患者耳蜗，用于治疗发育和应用。
177.在治疗应用中，药物组合物或药物以足以至少部分地阻止疾病及其并发症的症状的量施用于疑似或已经患有这种疾病的患者。足以实现这一点的量被定义为治疗有效剂量或药物有效剂量。
178.在本发明的另一个方面，提供了治疗有需要的受试者的感觉神经性听力缺失的方法，包括向受试者的内耳施用shh抑制剂的步骤。
179.在本发明的另一方面，提供了使受试者的内耳中毛细胞再生的方法，包括向受试者的内耳施用shh抑制剂的步骤。优选地，内耳中的细胞选自内耳毛细胞，或耳蜗或前庭系统的支持细胞。
180.在本发明该方面的一些实施方案中，受试者可以患有感觉神经性听力缺失。在其他实施方案中，受试者可以患有前庭系统的病症。
181.优选地，shh抑制剂选自环巴胺(smo抑制剂)、gant58或gant61(gli抑制剂)。
182.shh抑制剂以足以部分抑制shh通路活性的量施用。优选地，shh抑制剂以0.5至20μm的浓度施用，例如0.5、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、7μm、8μm、9μm、10μmμm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm或约0.5μm至约20μm的另一浓度。最优选地，shh抑制剂以受试者0.5mg/kg至20mg/kg的剂量施用，每天一次。
183.用于治疗上述病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、目标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、其他施用的药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但在一些实施方案中，患者可以是表现出感觉神经性听力缺失的动物。需要滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。
184.优选地，将足够数量的包含通过本发明的方法产生的内耳毛细胞的类器官植入受试者以治疗感觉神经性听力缺失。优选地将1至1000个类器官移植到需要治疗的受试者体内。最优选地，将使用环巴胺、gant58和gant61中的每一种通过本发明的方法产生的1至100
个类器官移植到需要治疗的受试者中。
185.本发明的组合物还可以用于鉴定设计为作用于受试者内耳的其他治疗剂的最佳剂量。例如，可以将治疗剂应用于通过本发明的方法产生的内耳毛细胞群体或包含内耳毛细胞的类器官，并可以确定治疗剂的期望效果的最佳剂量。
186.在本发明的一些实施方案中，本发明的组合物与另外的治疗剂一起施用。例如，本发明的组合物可以与抗炎药物一起施用，其可以上调内耳中的细胞因子和止血离子。优选地，抗炎药物选自泼尼松或地塞米松。最优选地，泼尼松或地塞米松以约4-10mg/ml的浓度施用。
187.发明人惊奇地发现，与野生型小鼠相比，cdo纯合子和shh杂合子基因敲除小鼠表现出增加的内耳毛细胞分化，这提示了在本发明中shh抑制剂如何起到增加内耳毛细胞分化作用的可能机制。发明人还鉴定出表现出增加的毛细胞分化的cdo纯合子和shh杂合子基因敲除小鼠表现出50％至70％之间的shh通路抑制。
188.因此，在本发明的另一实施方案中，提供了增强受试者内耳毛细胞分化的方法，包括在受试者中部分抑制cdo表达的步骤。优选地，通过施用治疗有效量的sirna或crispr来抑制cdo表达。
189.在本发明的另一实施方案中，提供了增加受试者内耳毛细胞数量的方法，包括在受试者中部分抑制cdo表达的步骤。优选地，通过施用治疗有效量的sirna或crispr来抑制cdo表达。
190.在本发明的另一个实施方案中，提供了增加受试者内耳毛细胞数量的方法，包括在受试者中通过抑制cdo来部分抑制shh通路的步骤。优选地，通过施用治疗有效量的sirna或crispr来抑制cdo。
191.在本发明的另一实施方案中，提供了增强受试者内耳毛细胞数量的方法，包括在受试者中部分抑制cdo的步骤。优选地，通过施用治疗有效量的sirna或crispr来抑制cdo。
192.在另一实施方案中，本发明包括本发明的组合物在制备用于在有需要的受试者中治疗感觉神经性听力缺失的药物的用途。
193.上述方法的修改对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的上述实施方案仅仅是示例性的，不应被解释为以任何方式进行限制。
194.筛选方法和模型
195.在本发明的又一方面，通过本发明的方法产生的内耳毛细胞和类器官可用于评价测试剂的耳毒性。另一方面，通过本发明的方法产生的内耳毛细胞和类器官也可用于评价被设计为靶向内耳毛细胞的治疗化合物的安全性和功效。通过本发明的方法使用患者特异性ipsc或从成人干细胞或祖细胞产生的患者来源的内耳毛细胞和类器官可以用作药物筛选的患者特异性临床模型，或诊断患者特定病症的模型。
196.通过本发明的方法产生的内耳毛细胞和包含内耳毛细胞的类器官能够以类似于活体的方式模拟生物组织。在一方面，提供用于评估测试剂的耳毒性或治疗效果的方法，其包括用测试剂处理通过本发明的方法产生的内耳毛细胞群体或包含内耳毛细胞的类器官的步骤。
197.测试剂可以选自任何生物活性物质，并且可以选自小分子化学品、肽、蛋白质(例如，抗体或其他蛋白质药物)，或核酸分子或提取物(例如，动物或植物提取物)。该方法可用
于筛选对耳科疾病如感觉神经性听力缺失具有治疗效果的测试剂。或者，该方法可以用于筛选具有某些其他治疗效果的测试剂以评价其耳毒性。
198.可以使用已知方法评价测试剂对耳毒性的影响或试剂的治疗效果。在一个实施方案中，用测试剂处理根据本发明的方法产生的类器官或内耳毛细胞群体。将类器官或内耳毛细胞的活力与未经处理的对照类器官或内耳毛细胞群体的活力进行比较，以表征候选化合物的毒性或治疗效果。或者，对照群体可以是用具有已知水平的毒性或治疗效果的测试剂处理的类器官或内耳毛细胞群体。
199.本文所述的内耳毛细胞和类器官可用作耳聋的临床模型，并且可用于研究特定遗传标志物在耳聋中的作用。来自ipsc或成人干细胞或祖细胞的患者来源的类器官可作为药物筛选的患者特异性临床模型以及诊断工具。在一个方面，提供诊断患者耳科疾病的方法，其包括评估患者来源的内耳毛细胞的群体或患者来源的类器官中是否存在该疾病特异的标志物，该类器官包含由本发明的方法产生的内耳毛细胞。优选地，标志物是与听力损失相关的遗传标志物。最优选地，标志物选自gjb2、strc、otof、slc26a4、myo7a、tecta、myo15a、cdh23、ush2a和wfs1。
实施例
200.实施例1：使用示例试剂来促进人ips细胞的毛细胞分化的方案
201.图1说明了从诱导多能干细胞生成内耳毛细胞的方法。发明人在内耳类器官培养物的发育阶段添加了试剂和抑制剂的组合，从而产生了本发明。具体的：
202.(i)在悬浮培养的ipsc中加入rock抑制剂(y-27632)，以促进立体胚状体形成约3天。
203.(ii)在第0至3天以低浓度fgf添加tgf-β抑制剂(sb-431542)以驱动非神经外胚层的发育。
204.(iii)然后在第4-7天将培养物转移到含有高浓度fgf和bmp抑制剂(ldn-193189)的培养基中，这会促进早期前耳基板上皮/前基板外胚层的发育。
205.(iv)接下来，添加wnt激动剂(chir-99021)以刺激第8-11天的耳基板发育、第12-14天的耳窝形成和第15-17天的耳感觉前泡。
206.(v)从第18-32天，添加hedgehog信号抑制剂(cyc、gant58或gant61)以促进感觉上皮囊泡的形成，并在这些条件下继续培养，导致从第33天起形成具有神经支配的感觉毛细胞。
207.实施例2：实施例1的方案的应用
208.(i)形成胚状体
209.细胞系gibco human episomal ipsc系，thermo fisher a18945的人诱导多能干细胞在有rock抑制剂(cat y-27632stem cell technologies，终浓度为10μm)的培养基(stem cell technologies)中培养2天以维持人多能干细胞并形成人胚状体。
210.(ii)形成非神经外胚层
211.来自(i)的胚状体在第0天被转移到含有化学成分确定的培养基的6孔悬浮培养板中。化学成分确定的培养基包含表1中的试剂：
212.表1
[0213][0214]
在第0天形成胚状体后，将成纤维细胞生长因子2(fgf2)(来自stemcell technologies的cat 78003.2)添加到化学成分确定的培养基中以达到4ng/ml的终浓度。tgfβ抑制剂sb-431542(来自stemcell technologies的cat 72232)也被添加到化学成分确定的培养基中以达到10μm的终浓度。
[0215]
将细胞培养至第3天以形成非神经外胚层。通过免疫染色和qrt-pcr分析确认了非神经外胚层的存在。
[0216]
(iii)形成耳前神经囊泡
[0217]
在第4天，添加fgf2(来自stemcell technologies，cat 78003.2)到化学成分确定的培养基中以达到50ng/的终浓度。bmp抑制剂ldn-193189(来自stemcell technologies，cat 72146)也被添加到化学成分确定的培养基中以达到200nm的终浓度。在6孔悬浮培养板中培养类器官以形成前耳基板上皮直到第7天。
[0218]
在第8天，将wnt激动剂chir-99021(来自stemcell technologies，cat 72052)添加到包埋在10％中的类器官中以达到3μm的终浓度。为了形成耳基板，在6孔悬浮培养板中培养类器官。
[0219]
在第12天，通过将类器官重悬于含有10％加chir99021的类器官成熟培养基中，将1-6个类器官转移到48孔悬浮板(gbo，677102)的每个孔中。将类器官孵育一小时后更换培养基，使凝固。
[0220]
从第12天到第17天，将chir-99021添加到培养物中以维持3μm的终浓度并使耳窝形成。第17天观察到耳前感觉囊泡。通过免疫染色和共聚焦成像确认了耳前感觉囊泡的存在。
[0221]
(iv)通过添加环巴胺形成内耳毛细胞
[0222]
在第18天，将shh抑制剂chir-99021(来自merck millipore，cat 239803)添加到包埋在10％中的类器官中，以达到1μm的终浓度。还将添加到细胞培养物中以达到10％的浓度。在类器官成熟培养基中培养细胞至第33天。
[0223]
在第33天，通过洗涤从培养基中去除环巴胺，在含有10％的细胞培养物中保留液滴聚集体。
[0224]
然后将细胞在含有10％的类器官成熟培养基中培养长达200天。每孔每天更换200μl培养基。培养细胞至第60-100天，直至细胞形态的检查确定成熟。选择具有内耳感觉细胞基因表达标志物的活的、中等大小和圆形3d形状的类器官进行分析。
[0225]
第35天后检测内耳毛细胞和神经支配。通过免疫染色和共聚焦成像捕获检测内耳毛细胞的存在和数量。
[0226]
实施例3：实施例1的方案的替代应用
[0227]
(iv)通过添加gant58形成内耳毛细胞
[0228]
按照实施例2进行步骤(i)至(iii)。
[0229]
在第18天，将shh抑制剂gant58(来自stemcell technologies，cat 73984)添加到细胞培养物中，以达到1μm的终浓度。还将添加到细胞培养物中以达到10％的浓度。在类器官成熟培养基中培养细胞至第33天。
[0230]
在第33天，通过洗涤从培养基中去除gant58，在含有10％的细胞培养物中保留液滴聚集体。
[0231]
然后将细胞在含有10％的类器官成熟培养基中培养长达200天。每孔每天更换200μl培养基。培养细胞至第60-100天，直至细胞的形态检查确定成熟。选择具有内耳感觉细胞基因表达标志物的活的、中等大小和圆形3d形状的类器官进行分析。
[0232]
第35天后检测内耳毛细胞和神经支配。通过免疫染色和共聚焦成像捕获检测内耳毛细胞的存在和数量。
[0233]
实施例4：实施例1的方案的替代应用
[0234]
(vi)通过添加gant61形成内耳毛细胞
[0235]
按照实施例2进行步骤(i)至(iii)。
[0236]
在第18天，将shh抑制剂gant61(来自stemcell technologies的cat 73692)添加到细胞培养物中，以达到1μm的终浓度。还将添加到细胞培养物中以达到10％的浓度。在类器官成熟培养基中培养细胞至第33天。
[0237]
在第33天，通过洗涤从培养基中去除环巴胺，在含有10％的细胞培养物中保留液滴聚集体。
[0238]
然后将细胞在含有10％的类器官成熟培养基中培养长达200天。每孔每天更换200μl培养基并培养60-100天，直到细胞形态的检查确定成熟。选择具有内耳感觉细胞基因表达标志物的活的、中等大小和圆形3d形状的类器官进行分析。
[0239]
第35天后检测内耳毛细胞和神经支配。通过免疫染色和共聚焦成像捕获检测内耳毛细胞的存在和数量。
[0240]
实施例5：cdo基因在内耳毛细胞分化中的影响
[0241]
为了显示cdo基因在内耳毛细胞分化中的影响，发明人对来自发育阶段e16.5的小鼠的内耳柯蒂氏器的组织切片进行了免疫组织化学检测。在这方面，图2在10倍放大倍数下通过使用毛细胞标志物肌动蛋白viia和支持细胞标志物sox2显示了e16.5 cdo-/-突变体的柯蒂氏器中毛细胞的额外形成和支持细胞的扩增。
[0242]
在图2中，使用毛细胞特异性标志物肌球蛋白viia(myoviia)标记耳蜗毛细胞，并使用支持细胞特异性标标志物sox2标记支持细胞。所有细胞的细胞核都用dapi复染。
[0243]
左侧的三幅图像来自具有正常听力的野生型(wt)小鼠，而右侧的三幅图像来自具有严重听力缺失的cdo-/-纯合敲除小鼠。
[0244]
如cdo-/-小鼠中sox2阳性细胞的增加所指示，小鼠中cdo基因的两个拷贝的敲除导致e16.5时支持细胞群的扩增。
[0245]
实施例6：shh信号对内耳毛细胞分化中cdo功能的影响
[0246]
为了显示shh信号对内耳毛细胞分化中cdo功能的影响，对来自发育阶段e16.5的小鼠的内耳柯蒂氏器的组织切片进行了免疫组织化学检测。如图所示，发明人将耳蜗分为耳蜗螺旋的三个不同区域：基底、内侧和顶端。
[0247]
图3在10倍放大倍数下使用毛细胞标志物肌动蛋白viia和神经标志物β-微管蛋白iii tuj1抗体标记e16.5时的毛细胞和进入耳蜗的神经支配显示了shh
+/-；cdo-/-复合突变体耳蜗中的多余毛细胞。使用毛细胞特异性标志物肌球蛋白viia(myoviia)标记耳蜗毛细胞并使用神经元特异性标志物beta-微管蛋白iii克隆tuj1(tuj1)标记神经元。所有细胞的细胞核都用dapi复染。
[0248]
图3共显示了五种不同的小鼠模型：
[0249]
1.野生型小鼠(wt)；
[0250]
2.缺少cdo基因的两个拷贝的cdo纯合基因敲除小鼠(cdo-/-)；
[0251]
3.仅表达一个shh基因拷贝的shh杂合小鼠(shh
+/-)；
[0252]
4.每个基因只表达一个拷贝的shh和cdo复合杂合小鼠(shh
+/-；cdo
+/-)；和
[0253]
5.表达一个shh基因拷贝并缺失两个cdo基因拷贝的shh杂合cdo纯合敲除复合突变小鼠(shh
+/-；cdo-/-)。
[0254]
shh
+/-；cdo-/-复合突变小鼠的耳蜗毛细胞数量显著增加，并恢复了这些毛细胞的神经支配。
[0255]
实施例7：量化shh
+/-；cdo
+/-复合突变耳蜗中形成的神经支配的异位毛细胞数量
[0256]
为了量化shh
+/-；cdo-/-复合突变耳蜗中形成的具有神经支配的异位毛细胞的数量，发明人使用imagej软件对从发育阶段为e16.5的小鼠解剖的耳蜗基底和内侧区域的内耳柯蒂氏器的组织切片免疫组织化学进行了细胞计数分析。图4在20倍放大倍数下使用毛细胞标志物肌动蛋白viia和神经标志物tuj1抗体标记毛细胞和进入e16.5耳蜗的神经支配显示了shh
+/-；cdo-/-复合突变体耳蜗中具有神经支配的异位毛细胞。使用毛细胞特异性标志物肌球蛋白viia(myoviia)标记耳蜗毛细胞并使用神经元特异性标志物beta-微管蛋白iii克隆tuj1(tuj1)标记神经元。所有细胞的细胞核都用dapi复染。
[0257]
实施例8：cdo-/-突变体中柱细胞支持细胞的变化
[0258]
为了观察cdo-/-突变体中柱细胞支持细胞的任何变化，发明人用柱状细胞特异性标志物p75ntr对胚胎第16.5天野生型(wt)和敲除cdo(cdo-/-)小鼠的切片和耳蜗组织全貌进行了免疫染色。细胞核已用dapi复染，并以20倍放大倍数捕获图像。图5显示了cdo-/-突变体中柱细胞的缺失。柱细胞在内耳中的表达和分布在cdo敲除耳蜗中明显受到破坏。通常位于野生型中的内毛细胞和外毛细胞之间的柱细胞在敲除小鼠中不存在。
[0259]
实施例9：e16.5时小鼠耳蜗中支持细胞中的cdo表达
[0260]
柯蒂氏器源自一个前感觉区域，该区域沿着耳蜗管的长度延伸，并由两个非感觉区域(神经侧大上皮脊(ger)上的科利克氏器(kolliker’sorgan)和非神经侧小上皮脊(ler)上的外沟)界定。在耳蜗管中建立感觉和非感觉区域的机制尚不清楚，但shh信号可能发挥重要作用。
[0261]
为了研究cdo是否参与非感觉细胞类型的特化，检查了cdo基因在耳上皮细胞中的表达。图6显示了e16.5时小鼠耳蜗中支持细胞中cdo表达。通过rna原位杂交，观察到cdo在e16.5的耳蜗hensen细胞中特异性表达，在通过全貌myoviia染色标记的感觉毛细胞中不表达。cdo在非感觉上皮细胞中表现出差异表达，并且hensen细胞和柱细胞中特异性表达。cdo在非感觉区域中的表达表明可能需要它来维持非感觉细胞命运和/或参与调节柯蒂氏器的分化。
[0262]
为了识别内耳耳蜗中的cdo表达谱，显示了发育日e16.5的野生型小鼠耳蜗切片的横向和纵向切片和全貌。在图6中，明场图像显示cdo表达(暗)，荧光图像显示用毛细胞特异性标志物肌球蛋白viia(myo7a)进行免疫标记。标记指示大上皮脊(ger)、内毛细胞(ihc)、外毛细胞(ohc)和小上皮脊(ler)的位置。叠加表明cdo表达的位置相对于内耳和外毛细胞没有表达。
[0263]
实施例10：cdo和cdo/shh复合突变体的前感觉区域特化
[0264]
为了观察早期前感觉区域特化的任何变化，对第14.5天胚胎的野生型(wt)和一系列突变小鼠的耳蜗不同区域的切片进行了免疫染色。用sox2抗体进行免疫染色以指示前感觉区域。图7显示了cdo和cdo/shh复合突变体中的前感觉区域特化。此处总共显示了六种不同的小鼠模型：
[0265]
1.野生型小鼠(wt)；
[0266]
2.仅表达一个shh基因拷贝的shh杂合小鼠(shh
+/-)；
[0267]
3.仅表达一个cdo基因的拷贝的cdo杂合小鼠(cdo
+/-)；
[0268]
4.缺少cdo的两个拷贝的cdo敲除小鼠(cdo-/-)；
[0269]
5.每个基因只表达一个拷贝的shh和cdo复合杂合小鼠(shh
+/-；cdo
+/-)；和
[0270]
6.表达一个shh基因拷贝并缺失cdo基因的两个拷贝的shh杂合cdo纯合敲除复合突变小鼠(shh
+/-；cdo-/-)。
[0271]
实施例11：cdo和cdo/shh复合突变体中通过p27kip1的细胞周期退出
[0272]
为了观察e14.5时耳蜗的表皮中的细胞周期退出，对来自胚胎第14.5天的野生型(wt)和一系列突变小鼠的耳蜗不同区域的切片进行了免疫染色。用p27
kip1
抗体进行免疫染色以指示前感觉区域特化。图8显示了cdo和cdo/shh复合突变体中通过p27kip1的细胞周期退出。此处总共显示了六种不同的小鼠模型：
[0273]
1.野生型小鼠(wt)；
[0274]
2.仅表达一个shh基因拷贝的shh杂合小鼠(shh
+/-)；
[0275]
3.仅表达一个cdo基因的拷贝的cdo杂合小鼠(cdo
+/-)；
[0276]
4.缺少cdo的两个拷贝的cdo敲除小鼠(cdo-/-)；
[0277]
5.每个基因只表达一个拷贝的shh和cdo复合杂合小鼠(shh
+/-；cdo
+/-)；和
[0278]
6.表达一个shh基因拷贝并缺失cdo基因的两个拷贝的shh杂合cdo纯合敲除复合突变小鼠(shh
+/-；cdo-/-)。
[0279]
如图8所示，数据显示cdo/shh复合突变体中耳蜗上皮中的未成熟细胞周期退出。
[0280]
实施例12：e13.5和e16.5时小鼠耳蜗中shh通路中gli基因表达
[0281]
为了鉴定e13.5和e16.5时小鼠耳蜗中shh信号通路中gli1、gli2和gli3基因的表达模式，发明人对野生型耳蜗全貌进行了rna原位杂交和免疫染色。图9显示了e13.5和e16.5时小鼠耳蜗中shh通路中gli基因表达。这组图像是在不同发育阶段采集的野生型小鼠的耳蜗组织切片，并进行染色以显示gli1、gli2和gli3在e13.5时前感觉特化阶段和e16.5时毛细胞分化阶段的胚胎发育中的表达。
[0282]
gli1和gli2是hh信号的读出。已知gli3是hh信号传导的阻遏物。在e13.5时，sox2在以深色显示的前感觉区域中表达。在前感觉区域中gli2和gli3与sox2共表达，但是，在前感觉上皮区域未检测到gli1。重要的是，在e13.5-16.5的耳蜗发育过程中检测到耳蜗区域的gli2和gli3表达。
[0283]
在e16.5时，atoh1在e16.5的耳蜗毛细胞中表达。gli1在耳蜗的螺旋神经节中表达。重要的是，作为shh激活剂的gli2不在感觉毛细胞中表达，而是限制在大上皮脊(ger)和hensen细胞(he)中，这是atoh1的相互表达模式。gli3作为shh阻遏物在与atoh1表达重叠的感觉毛细胞中特异性表达。
[0284]
实施例13：第0-10天时人ipsc来源的内耳类器官的总体形态。
[0285]
为了评价第0-10天类器官培养物随时间推移的总体形态，根据实施例1中描述的方案，通过使用相差显微镜观察不同阶段的类器官的大小和形态。
[0286]
图10显示了第0-5天的胚状体形成，该聚集体呈三维球形结构。在第10天，对来自正常gibco细胞的全貌内耳类器官进行免疫染色。用pax8和sox2抗体进行免疫染色以指示前感觉区域。
[0287]
实施例14：第20-40天人ipsc来源的内耳类器官-外胚层细胞命运
[0288]
比较使用以下方法发育的人ipsc来源的内耳类器官的总体形态:
[0289]
(a)koehler等人(2017)中描述的方法；
[0290]
(b)实施例1所述的方法，在步骤(v)中使用环巴胺作为shh抑制剂；
[0291]
(c)实施例1所述的方法，在步骤(v)中使用gant58作为shh抑制剂(实施例3)；和
[0292]
(d)实施例1所述的方法，在步骤(v)中使用gant61作为shh抑制剂。
[0293]
图11在10倍放大倍数下显示了第20-40天时人ipsc来源的内耳类器官的总体形态。通过使用耳pax8和ecad阳性上皮在第20天表征内耳类器官，其形态与发育中的耳结构相似。通过聚集体表面可以清楚地看到上皮重组。图11显示，使用koehler方法，细胞重组的效率约为90-95％。然而，使用环巴胺、gant58或gant61的实施例1的方法揭示了高于koehler方法的细胞重组效率，具有约95-100％的聚集体。
[0294]
为了确定第20-40天时内耳类器官的外胚层细胞命运，通过使用共聚焦显微镜观察类器官中的ecad和pax2表达，比较使用(a)没有hh抑制剂的koehler方法，(b)用环巴胺作为shh抑制剂的实施例1的方法(实施例2)，(c)用gant58作为shh抑制剂的实施例1的方法(实施例3)和(d)用gant61作为shh抑制剂的实施例1的方法(实施例4)。e-cadherin和pax2染色的类器官显示外胚层细胞命运。与koehler方法相比，使用shh抑制剂后内耳类器官的外胚层细胞命运发育得更好。图12显示，与koehler方法相比，使用实施例1的方法(包括步骤(v)中的hh抑制剂)发育的类器官显示出更多数量的表达外胚层细胞命运的细胞。外胚层
细胞的形成似乎是连续的，从第7天开始直到约第20-40天。在第20天，cyc、gant58和gant61处理的聚集体含有更高丰度的ecad/pax2阳性囊泡，其管腔直径大于50μm。
[0295]
实施例15.第14-40天时人ipsc来源的内耳类器官-耳细胞命运
[0296]
为了确定第14-40天内耳类器官的耳细胞命运，使用共聚焦显微镜观察了类器官中的ncad和sox2表达。结果显示在图13中，显示了没有hh抑制剂的koehler方法、具有环巴胺的实施例1的方法(实施例2)、具有gant58的实施例1的方法(实施例3)和具有gant61的实施例1的方法的结果(实施例4)。图13显示，与koehler方法相比，使用实施例1的方法(包括步骤a中的hh抑制剂)发育的类器官显示出更多数量的表达耳细胞命运的细胞。即与koehler方法相比，使用shh抑制剂后内耳类器官的耳细胞命运发育得更好。
[0297]
实施例16.第33-60天时人ipsc来源的内耳类器官
[0298]
为了确定第33-60天内耳类器官感觉毛细胞的发育，使用共聚焦显微镜观察了类器官中肌球蛋白viia和tuj1的表达。结果显示在图14中，该图比较了使用(a)用环巴胺的实施例1的方法(实施例2)和(b)用gant58的实施例1的方法(实施例2)发育的类器官。图14显示感觉毛细胞和支持细胞存在于使用两种shh抑制剂发育的类器官中。在使用每种shh抑制剂发育的类器官中发现指示完全重组的不透明的外细胞团。相比之下，在使用koehler方法发育的类器官中发现较少的半透明上皮，指示不完全或部分重组。在使用每种shh抑制剂发育的类器官中发现了穿过聚集表面的感觉毛细胞上皮。这些结果表明shh信号抑制可以增加源自前基板外胚层的内耳毛细胞的数量。
[0299]
实施例17：通过单细胞rna测序对人ipsc衍生的内耳类器官进行细胞命运分析。
[0300]
为了验证rnaseq转录组分析中的毛细胞标记基因，在内耳类器官中进行定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)以确定毛细胞基因表达水平。图15说明通过单细胞rna测序转录组分析进行第60天时的人ipsc来源的内耳类器官的感觉毛细胞特异性基因表达分析。图16说明通过qrt-pcr分析第20天时内耳类器官中的耳上皮特异性基因表达和第60天时内耳类器官中的内耳感觉细胞特异性基因表达。myovi的存在代表内耳毛细胞分化。单细胞rna测序分析确定毛细胞和神经元标志物在使用gant58发育的类器官中占～91.88％，在使用cyc发育的类器官中占～74.48％，在使用koehler方法发育的类器官中占～57.88％。因此，图15和16中的rna测序和qrt-pcr结果表明，与使用koehler方法发育的类器官相比，使用cyc、gant58和gant61发育的类器官中的内耳毛细胞分化程度更高。因此，这些结果表明shh信号抑制可以增加源自前基板外胚层的内耳毛细胞和神经细胞的数量。
[0301]
使用具有错误发现率校正的程序gitools进行基因的基因本体功能富集分析。结果如图16所示。
[0302]
实施例18：内耳类器官的感觉毛细胞在第33-60天时的发育
[0303]
为了确定第33-60天内耳类器官感觉毛细胞的发育，使用共聚焦显微镜观察了类器官中肌球蛋白viia和tuj1的表达。结果显示在图17中，其比较了使用(a)用环巴胺的实施例1的方法(实施例2)和(b)用gant58(实施例3)和gant61(实施例4)的实施例1的方法发育的类器官。图17显示感觉毛细胞和神经细胞存在于使用两种shh抑制剂发育的类器官中。在使用每种shh抑制剂发育的类器官中发现指示完全重组的不透明的外细胞团。在使用每种shh抑制剂开发的类器官中发现了穿过聚集体表面的感觉毛细胞上皮。这些结果表明shh信
号抑制可以增加源自前基板外胚层的内耳毛细胞的数量。
[0304]
为了确定第33-60天内耳类器官感觉毛细胞的发育，使用共聚焦显微镜观察了类器官中肌球蛋白viia和tuj1的表达。结果显示在图18中，其比较了使用(a)用环巴胺的实施例1的方法(实施例2)和(b)用gant58(实施例3)和gant61(实施例4)的实施例1的方法发育的类器官。图18显示存在于使用两种shh抑制剂发育的类器官中的感觉毛细胞和支持细胞。

技术特征：
1.产生内耳毛细胞的方法，其包括以下步骤：a.在足以部分抑制shh通路的量的shh抑制剂和包含5-10％的ehs小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物的培养基存在下培养耳前感觉囊泡；b.从来自步骤a的培养物去除所述shh抑制剂；和c.将来自步骤b的细胞在包含5-10％的所述ehs小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物的培养基中培养以形成内耳毛细胞。2.权利要求1所述的方法，其中所述耳前感觉囊泡通过以下步骤产生：aa1.在导致从培养的多能干细胞形成胚状体的条件下培养诱导多能干细胞；aa2.在浓度为2-4ng/ml的fgf和浓度为5-10μm的tgf-β抑制剂存在下培养来自步骤aa1的所述胚状体以形成非神经外胚层细胞；aa3.在浓度为50-100ng/ml的fgf和浓度为100-200nm的bmp抑制剂存在下培养来自步骤aa2的所述非神经外胚层细胞以形成前耳基板上皮细胞；和aa4.在浓度为2-3μm的wnt激动剂和包含5-10％的engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物的培养基存在下培养来自步骤aa3的所述前耳基板上皮细胞以形成耳前感觉囊泡。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述shh抑制剂选自环巴胺、gant58或gant61。4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述shh抑制剂是环巴胺，其中所述环巴胺以1-2μm的终浓度存在于步骤a中。5.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述shh抑制剂是gant61，其中所述gant61以1-2μm的终浓度存在于步骤a中。6.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述shh抑制剂是gant58，其中所述gant58以1-2μm的终浓度存在于步骤a中。7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内耳毛细胞是内毛细胞。8.权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述fgf是fgf2。9.权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述tgf-β抑制剂是sb-431542。10.权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述bmp抑制剂是ldn-193189。11.权利要求2至10中任一项所述的方法，其中所述wnt激动剂是chir-99021。12.权利要求2至11中任一项所述的方法，其中步骤aa1包括在合适的培养基中与rock抑制剂一起培养所述多能干细胞。13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中：a.步骤a发生约10天以形成耳基板和耳囊泡；b.步骤b发生约15天以形成感觉上皮；且c.步骤c发生约68天以形成毛细胞和神经支配直至成熟。14.权利要求2至13中任一项所述的方法，其中：a.步骤aa2从第0天到第3天的胚状体形成发生，其中第0天是步骤aa2开始形成非神经外胚层的那一天；b.步骤aa3从第4天到第7天发生以形成早期前耳基板上皮；c.步骤aa4从第8天到第17天发生以形成耳基板和耳囊泡；d.步骤b从第18天到第32天发生以形成感觉上皮；且
e.步骤c从第33天至第100天发生以形成毛细胞和神经支配直至成熟。15.权利要求13或14所述的方法，其中成熟发生在第60-200天之间。16.组合物，其包含通过前述权利要求中任一项的方法产生的内耳毛细胞。17.在有需要的受试者中治疗感觉神经性听力缺失的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求16所述的组合物。18.用于评估测试剂的耳毒性或治疗效果的方法，其包括用测试剂处理通过权利要求1至15中任一项的方法产生的内耳毛细胞的群体或包含通过权利要求1至15中任一项的方法产生的内耳毛细胞的类器官的步骤。19.权利要求16所述的组合物在制备用于在有需要的受试者中治疗感觉神经性听力缺失的药物中的用途。20.在受试者中再生内耳毛细胞的方法，其包括向所述受试者的内耳施用shh抑制剂的步骤。

技术总结
本发明涉及用于产生分化的耳细胞的方法和组合物。具体的，本发明涉及用于从多能干细胞产生内耳细胞的方法和组合物。本发明还涉及治疗感觉神经性听力缺失。治疗感觉神经性听力缺失。


技术研发人员：Y
受保护的技术使用者：澳大利亚耳科学研究所
技术研发日：2021.10.14
技术公布日：2023/7/22