一种乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法与流程

1.本发明涉及益生菌发酵产物溶胞物的技术领域，尤其涉及一种乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.乳酸菌发酵产物溶胞物包含菌体及在发酵过程中合成的全部活性成分，含有肽聚糖、磷壁酸、蛋白质、磷脂、甾醇、脂肪酸、各种酶类、肽和氨基酸、核苷酸、胞外多糖等，不仅为肌肤提供丰富营养，还具有良好的抗衰老效果，因此广泛应用在化妆品护肤产品领域。
3.桃胶是桃树为了让伤口更快愈合而分泌出来的一种胶状物质，主要含有葡萄糖醛酸以及半乳糖，还含有植物胶原蛋白以及脂肪、碳水化合物等，桃胶本身也是一种生物糖胶原料，也是类似于黄原胶或阿拉伯树胶类似用途的一种医美原料，可减少皱纹，嫩肤，具有一定的养颜、护肤功效。茯苓为担子菌纲多孔菌科茯苓属的一种药食两用的真菌，富含多种有效成分，包括茯苓多糖、三萜类、月桂酸、麦角甾醇、腺嘌呤及胆碱等活性物质，具有良好的美白祛斑消疣等护肤效果。基于“双向发酵”技术，研究药食同源植物桃胶和茯苓对乳酸菌液态发酵体系的协同影响，赋能开发更多兼具功效与环境友好型的产品，具有广阔的市场前景。所谓“双向发酵”是指采用具有一定活性成分的中药材或药渣作为药性基质来代替传统的营养基质，并把经过优选的菌种加入其中进行微生物转化。其双向性体现在药性基质在提供益生菌所需营养的同时，还受到益生菌中酶的影响而改变自身的组织、成分，产生新的性味功能，具有自动化程度较高、物质传递高、继承性好、人为可控性强、有效成分更容易富集、工业化生产较为容易，且发酵液可直接作为化妆品原料应用的特点。
4.但在现有技术中，作为化妆品备案目录中的原料，乳酸菌相关产品多为发酵滤液和发酵产物溶胞物，前者离心过滤掉了乳酸菌菌体，而后者将乳酸菌破壁后得到，虽保留更多的活性成分，但多为水溶性混悬液，放置过程中会出现分层、沉降，使用前需摇匀，造成配方时使用不方便且含量不均匀，最终影响产品美观及使用体验等众多问题。此外，乳酸菌为厌氧菌，生产时需要一定的厌氧条件，同时对营养要求又非常苛刻，为了提高活菌数或延长活菌的存活时间，有时需要在常用的mrs培养基中加入营养液如牛肉汤等，使其生产成本大幅提高，为此，我们提出一种乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法来解决上述提出的问题。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述现有乳酸菌发酵产物溶胞物存在的问题，提出了本发明。
7.因此，本发明目的是提供一种乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其创造性地利用乳酸菌发酵产物溶胞物与桃胶、茯苓中存在的大量植物多糖、蛋白质、
氨基酸等活性成分，再加入新型发酵产品黄原胶、瓜尔胶，通过分子中大量的羟基、羧基、氨基相互以氢键等方式物理交联緾绕形成立体网络水凝胶，从而达到增加蛋白质、多肽类活性分子及混悬液体系稳定性之目的，且无需低温储存，久置无沉淀且稳定性更高。
8.为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
9.步骤s1，5％桃胶溶液制备：取50g桃胶，洗净除杂后，加入950g0.1mol/l的naco3和nahco3溶液于80-90℃浸泡、水解4h，粉碎，减压滤过，用稀盐酸溶液调节ph值至6.0-7.0，灭菌得到5％桃胶溶液；
10.步骤s2，10％茯苓提取液的制备：取茯苓菌核粉末100g，加70％乙醇500g，于95℃水浴回流提取3h，冷却至室温，抽滤，提取2次，合并滤液并将滤液减压浓缩回收乙醇，再加水溶解，过滤，加水至1000g，灭菌得到茯苓提取液；
11.步骤s3，培养液制备：分别按5％的重量比称取5％桃胶溶液和10％茯苓提取液，加入mrs液体培养基中，灭菌，得培养液；
12.步骤s4，乳酸菌发酵产物溶胞物的制备：
13.纯种活化：取-80℃冻存的乳酸菌甘油菌并接种于mrs培养基上活化，30-42℃培养20-30h，得到种子培养基；
14.发酵培养：取活化后的种子培养基按1％-5％比例接种于含有桃胶和茯苓的培养液中，30-42℃培养20-30h，即得乳酸菌发酵产物；
15.乳酸菌发酵产物溶胞物制备:取乳酸菌发酵产物，用微射流高压均质机18000-20000psi先均质1次，再提高均质压力至23000-25000psi均质2次，温度控制在0℃-10℃，即得乳酸菌发酵产物溶胞物。
16.步骤s5，乳酸菌发酵产物溶胞物水凝胶的制备：
17.在乳酸菌发酵产物溶胞物中加入功能性助剂，搅拌均匀，再称取总量0.3％黄原胶和0.3％瓜尔胶，混合均匀后撒于液面，室温条件下搅拌使完全溶解即得到淡黄色透明水凝胶。
18.作为本发明所述乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的一种优选方案，其中：所述步骤s1中所述桃胶溶液的浓度为2％-8％，培养液中桃胶加入量为0.1％-0.5％。
19.作为本发明所述乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的一种优选方案，其中：所述步骤s2中所述茯苓提取液的浓度为5％-15％，培养液中茯苓提取液加入量为0.3％-0.7％。
20.作为本发明所述乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的一种优选方案，其中：所述步骤s3中所述的mrs培养基包括：维生素c、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、半胱氨酸、双歧糖、酵母浸粉、牛肉浸粉、大豆蛋白胨和牛肉蛋白胨。
21.作为本发明所述乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的一种优选方案，其中：所述步骤s4中所述种子培养基的加入量为培养液的1％-5％。
22.作为本发明所述乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的一种优选方案，其中：所述步骤s4中所述微射流高压均质次数2-5次，其中均质压力梯度增加，先用18000-20000psi均质1次，再将均质压力增加至23000-25000psi均质2次，温度控制在0-10
℃。
23.作为本发明所述乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的一种优选方案，其中：所述步骤s5中所述水凝胶材料包括黄原胶、瓜尔胶、卡波姆、羧甲基纤维素钠的一种或多种。
24.作为本发明所述乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的一种优选方案，其中：所述步骤s5中功能性助剂包括防腐剂和矫味剂。
25.作为本发明所述乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的一种优选方案，其中：所述防腐剂包括苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢醋酸钠、苯氧乙醇、乙基已基甘油的一种或多种。
26.作为本发明所述乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的一种优选方案，其中：所述矫味剂包括薄荷香精、熏衣草香精、茉莉香精、玫瑰香精的一种或多种。
27.本发明的有益效果：
28.1、本发明采用双向液体发酵技术，把我国传统的中医药优势与现代生物发酵技术相结合，开发具有中国特色的化妆品原料。
29.2、本发明选择富含多糖、植物胶原蛋白以及脂肪碳水化合物等有效成分的天然桃胶和茯苓作为药食同源的中药加入传统mrs培养基中，一方面可作为益生元即乳酸菌的营养成分，促进活菌生长(无需在mrs培养基中再添加牛肉汤等蛋白营养液)，另一方面利用乳酸菌进一步代谢、分解提取桃胶和茯苓的有效成分，达到协同增效作用。
30.3、本发明创造性地利用乳酸菌发酵产物溶胞物与桃胶、茯苓中存在的大量植物多糖、蛋白质、氨基酸等活性成分，再加入新型发酵产品黄原胶，通过分子中大量的羟基、羧基、氨基相互以氢键等方式物理交联緾绕形成立体网络水凝胶，从而达到增加蛋白质、多肽类活性分子及混悬液体系稳定性之目的，且无需低温储存，久置无沉淀且稳定性更高。
31.4、本发明方法制备水凝胶，可逆且水溶性好，方便配方直接使用，生产工艺简单，可规模化大生产。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
33.图1为本发明乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的不同桃胶加入量对乳酸菌生长的影响示意图；
34.图2为本发明乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的含0.25％桃胶mrst培养液中不同茯苓提取物加入量对乳酸菌生长的影响示意图；
35.图3为本发明乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的mrs培养液中加入中药前后乳酸菌发酵产物平板活菌检测结果示意图；
36.图4为本发明乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的乳酸菌发酵产物均质前后显微镜照片示意图；
37.图5为本发明乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的乳酸菌发酵
产物均质前后平板活菌检测结果示意图；
38.图6为本发明乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的乳酸菌发酵产物溶胞物及其水凝胶照片；
39.图7为本发明乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的不同样品对dpph自由基的清除率示意图；
40.图8为本发明乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法的不同样品对超氧阴离子自由基的清除率示意图。
具体实施方式
41.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
42.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
43.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
44.再其次，本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。
45.实施例1
46.考察mrs培养液中桃胶的加入量对乳酸菌生长的影响：
47.(1)5％桃胶溶液的制备：取50g桃胶，洗净除杂后，加入950g0.1mol/l的naco3和nahco3溶液(重量比1：1，ph10-11)于80-90℃浸泡、水解4h，粉碎，减压滤过，用稀盐酸溶液调节ph值至6.0-7.0，灭菌得到5％桃胶溶液；
48.(2)培养液制备：分别取0，0.5，1.5，5，10g的5％桃胶溶液，加入mrs液体培养基至100g，灭菌，得mrst培养液；
49.(3)纯种活化：取-80℃冻存的乳酸菌甘油菌并接种于mrs培养基上活化，30-42℃培养24h，得到种子培养基；
50.(4)发酵培养：取活化后的种子培养基1g，接种于上述不同100gmrst培养液中，30-42℃培养24h，即得不同桃胶加入量的乳酸菌发酵产物。
51.结果发现，随着5％桃胶溶液加入量的增加，肉眼观察到底部沉积的乳酸菌量明显增加，进一步在分光光度计上测定不同培养时间的od600数值(见图1)，发现培养24h后，加入不同量的桃胶溶液后的mrst培养基均较单独mrs培养基的od600数值有明显增加，当在mrs培养基中加入5％桃胶溶液5％(占培养液重量0.25％)以上即可明显促进乳酸菌生长，继续增加桃胶用量，od600数值增加不明显。
52.进一步将上述培养24h样品采用不同稀释度在培养基上进行活菌的厌氧培养，计算活菌数，见表1：
53.表15％桃胶溶液不同加入量促进活菌生长结果
54.5％桃胶溶液加入量od600活菌数(个)01.0241.0
×
1090.51.3291.2
×
1091.51.5041.6
×
1095.01.8952.8
×
10910.01.9233.1
×
10955.结果发现培养24h后，加入桃胶溶液的样品均较单独rms培养基的样品的活菌数有明显增加，说明在培养基中加入质量浓度为0.25％桃胶溶液可明显促进乳酸菌生长并提高活菌数。
56.实施例2
57.考察mrst培养液中茯苓提取物的加入量对乳酸菌生长的影响：
58.(1)10％茯苓提取物的制备：取茯苓菌核粉末100g，加70％乙醇500g，于95℃水浴回流提取3h，冷却至室温，抽滤，提取2次，合并滤液并将滤液减压浓缩回收乙醇，再加水溶解，过滤，加水至1000g，灭菌得到茯苓提取液。
59.(2)培养液制备：分别取0，1.0，2.5，5，10g的10％茯苓提取液，加入mrst液体培养基至100g，灭菌，得mrstf培养液。
60.(3)纯种活化：取-80℃冻存的乳酸菌甘油菌并接种于mrs培养基上活化，30-42℃培养24h，得到种子培养基。
61.(4)发酵培养：取活化后的种子培养基1g，接种于上述不同100gmrstf培养液中，30-42℃培养24h，即得不同桃胶加入量的乳酸菌发酵产物。
62.分别取各个样品直接在分光光度计上测定od600数值，进一步将上述各个样品采用不同稀释度在培养基上进行活菌的厌氧培养并计算活菌数，详见图2、图3和表2：
63.表210％茯苓提取液不同加入量促进活菌生长结果
64.10％茯苓水提液加入量od600活菌数(个)01.8842.0
×
1091.01.9244.0
×
1092.52.0236.0
×
1095.02.1058.0
×
10910.02.1108.0
×
10965.结果发现培养24h后，加入不同量的茯苓提取物的样品均较单独rmst培养基的样品的od600数值和活菌数有明显增加，但增长趋势先快后慢，说明在培养基中加入质量浓度为0.25％桃胶合并0.5％茯苓提取物可明显促进乳酸菌生长并提高活菌数。
66.实施例3
67.考察不同破菌工艺对乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物的影响：
68.(1)纯种活化：取-80℃冻存的乳酸菌甘油菌并接种于mrs培养基上活化，30-42℃培养24h，得到种子培养液。
69.(2)发酵培养：在mrs液体培养基中各加入5％的5％桃胶溶液和10％茯苓提取物，混合均匀，灭菌，得mrstf培养液；每100g接种1g种子培养液，30-42℃培养24h，即得乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物(mrstf)，分别取上述发酵产物，采用高压微射流均质机，h10z均质腔在
不同均质压力，不同均质次数均质后，测定均质前后od600数值，结果见表3：
70.表3不同均质压力和均质次数对od600值的影响
[0071][0072][0073]
从表3中1-5号样品的结果发现，在均质次数相同条件下随着均质压力提高，od600值随之减小，可能是由于乳酸菌具有比较结实的细胞壁，只有当均质压力达到20000psi以上才能有效破坏其细胞壁，但均质压力高，仪器损耗大，此外，因乳酸菌发酵液中菌体较多，均质过程中极易沉降，即使不停搅拌也难以避免沉降物堵塞均质腔，为了便于工业化大生产，6-8号样品均先采用相对低的压力均质1次后，再分别用高的压力均质不同次数以优化工艺，结果发现，7号和8号样品的od600基本相当。
[0074]
进一步选择均质前及均质后7号样品，革兰氏染色后显微镜观察活菌情况，结果见图4，从图4均质前后乳酸菌显微镜照片可以看出，均质前明显观察到紫色乳酸菌短杆状活菌，而均质后仅有乳酸菌细胞碎片，很难再找到活菌，充分说明7号样品破碎工艺已经能满足乳酸菌破菌要求。
[0075]
更进一步地将7号和8号均质后样品稀释5倍，以均质前样品稀释107倍作为对照，分别取0.1μl铺平板观察活菌数，结果见图5，从图5可以发现，均质前活菌数为2.7
×
109个，均质后活菌数仅50个，基本达到破壁要求，为了方便工业化生产，最终采用7号样品的破壁工艺，即先采用18000-20000psi压力均质1次后，再增大压力至23000-25000psi均质2次。
[0076]
实施例4
[0077]
考察乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶制备工艺：
[0078]
(1)纯种活化：取-80℃冻存的乳酸菌甘油菌并接种于mrs培养基上活化，30-42℃培养24h，得到种子培养液；
[0079]
(2)发酵培养：在mrs液体培养基中各加入5％的5％桃胶溶液和10％茯苓提取物，混合均匀，灭菌，得mrstf培养液，每100g接种1g种子培养液，30-42℃培养24h，即得乳酸菌/
桃胶、茯苓发酵产物(lrstf-lf)；
[0080]
(3)发酵产物溶胞物：分别取上述乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物用微射流高压均质机先采用18000-20000psi压力均质1次后，再增大压力至23000-25000psi均质2次，温度控制在0℃-10℃，即得乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物溶胞物(mrstf-lfl)。
[0081]
取上述溶胞物各100g,分别加入0.5％乙基已基甘油和0.5％苯甲酸钠，搅拌使完全溶解，再分别将0.6，0.7，0.8g黄原胶粉末撒于液面，室温静置1-2h待溶胀后，转速200转/分搅拌使完全溶解，最后加入0.05g熏衣草香精搅拌使完全溶解，得到透明的淡黄色水凝胶(mrstf-lfl-hg)。
[0082]
分别肉眼观察其外观性状、测定ph值、黏度及采用4000转/分离心15min比较其稳定性，结果见表4和图6。
[0083]
表4不同黄原胶用量对水凝胶稳定性的影响
[0084][0085]
从表4数据可以看出，不加黄原胶的溶胞物离心后即明显分层及出现沉淀物，而随着黄原胶加入量的增加，黏度相应增加，离心稳定性也相应增加，当黄原胶用量达0.7％以上即可满足要求，继续增加黄原胶用量，黏度太大，反而不方便后续配方操作，图6乳酸菌发酵产物溶胞物及其水凝胶照片也可以看出，不加黄原胶的溶胞物为淡黄色混悬液，静置即分层，底部有明显的白色沉淀，而加入黄原胶后为黏稠凝胶，无分层及沉淀出现。
[0086]
实施例5
[0087]
与实施例4不同的是，采用卡波姆作为水凝胶材料，加入量为总重量的0.7％，精氨酸作为ph调节剂。取依法制备的乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物溶胞物200g，加入1％苯甲酸钠，搅拌使完全溶解，将1.4g卡波姆粉末撒于液面，室温静置1-2h待溶胀后；转速200转/分搅拌使完全溶解，再加入3gl-精氨酸，边加边搅拌使完全溶解，调节ph值为6.0-7.5，最后加入0.05g茉莉精油搅拌使完全溶解，得到透明的淡黄色水凝胶。
[0088]
实施例6
[0089]
与实施例5不同的是，采用羧甲基纤维素钠作为水凝胶基质，加入量为总重量的2％。取依法制备的乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物溶胞物200g，加入1％苯甲酸钠，搅拌使完全溶解，将4.0g羧甲基纤维素钠粉末撒于液面，室温静置1-2h待溶胀后；转速200转/分搅拌使完全溶解，最后加入0.05g玫瑰香精搅拌使完全溶解得到透明的淡黄色水凝胶。结果发现，
采用2％用量的羧甲基纤维素钠作为水凝胶基质，产品粘性大，使用体验稍差。
[0090]
实施例7
[0091]
与实施例6不同的是，采用瓜尔胶为水凝胶基质，加入量为总重量的1.0％。取依法制备的乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物溶胞物200g，加入1％苯甲酸钠，搅拌使完全溶解，加入2.0g瓜尔胶粉末，转速200转/分搅拌使完全溶解，最后加入0.05g薄荷精油搅拌使完全溶解得到透明的淡黄色水凝胶。结果发现瓜尔胶水溶性好，不需要溶胀即可制备水凝胶，可节省时间。
[0092]
实施例8
[0093]
与实施例7不同的是，采用黄原胶和瓜尔胶作为水凝胶基质，二者的加入量均为总重量的0.3％。取依法制备的乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物溶胞物200g，加入1％苯甲酸钠，搅拌使完全溶解，再加入预先混合均匀的黄原胶和瓜尔胶各0.6g混合粉末，转速200转/分搅拌使完全溶解，最后加入0.05g熏衣草搅拌使完全溶解得到透明的淡黄色水凝胶。
[0094]
实施例9
[0095]
作为对比例，mrs培养液中不加入桃胶及茯苓。分别依法制备乳酸菌发酵产物溶胞物(实施例9-1，mrs-lfl)和乳酸菌发酵产物溶胞物水凝胶(实施例9-2，mrs-lfl-hg)。
[0096]
分别取实施例4-1，4-3、实施例5，6，7，8以及实施例9-1、9-2样品对其各项指标进行测定并比较，结果见表5：
[0097]
表5乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物溶胞物及其水凝胶各项性能比较
[0098][0099]
从表5可以看出，乳酸菌溶胞产物(lf)，不管是否含有桃胶及茯苓(实施例4-1及实施例9-1)均为易分层沉降的混悬液，而制备成水凝胶后物理稳定性大大提高，4000转/分离心15min及室温放置均不分层。另外，采用常用的卡波姆作为凝胶材料(实施例5)，因其在ph6.0-7.5范围内黏度最大，因此用碱性物质调节ph值导致乳酸含量降低，其它各项指标包括黏度、固含量和氮含量均无明显差别。
[0100]
其中，实施例8合并使用黄原胶和瓜尔胶作为凝胶基质，其中黄原胶是从黄单孢菌中提取的一种阴离子型胞外多糖，在低温和/或高离子强度下呈双螺旋结构，具有较强的刚性，故具有强抗盐能力，而瓜尔胶是从瓜尔豆的胚乳中提取的一种天然非离子型半乳甘露聚糖。二者均为天然物质，且分子中均存在大量亲水性基团，如黄原胶带有羟基、乙酰基和丙酮酸基等，瓜尔胶则带有大量羟基，且分子间存在较强的氢键作用，可显著提高水溶液或分散体系的黏度和稳定性等，且二者混合使用不仅具有明显的协同增效作用，而且大大改善黄原胶在水中分散能力，提高工作效率。
[0101]
进一步地，取上述实施例4-1，8，9-1，9-2样品，并以目前国际医美市场流行的同类
产品德国产乳酸菌发酵溶胞产物clr为阳性对照，0.25％桃胶加0.5％茯苓取取物的空白mrs培养液为阴性对照，进行抗氧化作用研究。
[0102]
①
dpph自由基清除率测定：
[0103]
在试管中分别依次加入1ml dpph溶液和0.5ml不同浓度的待测样品，混匀后黑暗处放置60min，将上述溶液转移至比色皿中，以无水乙醇为基准(调零)在517nm波长处测吸光值，吸光值记为a1；另在试管中分别依次加入1ml无水乙醇和0.5ml不同浓度的待测样品，黑暗处放置60min，将上述溶液转移至比色皿中，以无水乙醇为基准(调零)在517nm波长处测吸光值，吸光值记为a2；另在试管中加入1ml dpph溶液和0.5ml无水乙醇，混匀后黑暗处放置60min，将上述溶液转移至比色皿中，以无水乙醇为基准(调零)在517nm波长处测吸光值，吸光值记为a0。根据以下公式计算自由基清除率：
[0104]
清除率(％)＝[1-(a1-a2)/a0]
×
100％
[0105]
试验重复三次，取其平均值作为最后结果，结果见图7；
[0106]
其中，图7结果表明，实施例4-1和9-1为含中药和不含中药的乳酸菌溶胞产物，其dpph自由基清除率均比市售clr阳性对照高3.5倍和4.0倍，实施例8和9-2制成水凝胶后其dpph自由基清除率均略有增加，比市售clr阳性对照高4.3倍和4.6倍，而加入桃胶、茯苓后，不管是乳酸菌发酵溶胞产物还是水凝胶，其dpph自由基清除率均得至提高，充分说明桃胶及茯苓的加入不仅可有益于乳酸菌的生长，而且可协同增加其抗氧化效果。
[0107]
②
超氧阴离子自由基清除率测定
[0108]
取4.5ml三羟甲基氨基甲烷(tris)-hcl缓冲液于试管中，25℃水浴预热20min后，加入0.5ml不同浓度样品溶液和0.5ml 25mmol/l邻
[0109]
苯三酚溶液，混匀，25℃水浴反应5min后，立即加入100μl 8mol/l hcl来终止反应，然后测定反应液在335nm处的吸光度，按下式计算超氧阴离子自由基清除率，结果见图8；
[0110]
清除率(％)＝[1-(ai-aj)/a0]
×
100％
[0111]
注：a0为不加样品(用蒸馏水代替样品)的反应液吸光度；ai为加入样品和邻苯三酚的反应液吸光度；aj为加入样品，不加邻苯三酚(用蒸馏水代替邻苯三酚)的反应液吸光度。
[0112]
结果表明，实施例4-1、8，9-1、9-2四个产品的超氧阴离子自由基清除率均比市售clr阳性对照及空白培养液要高很多，最高的超氧阴离子自由基清除率比对照组clr提高9倍多，而加入桃胶、茯苓后，不管是乳酸菌发酵产物溶胞物还是水凝胶，其超氧阴离子自由基清除率均得至显著提高，充分说明桃胶及茯苓的加入不仅可有益于乳酸菌的生长，而且可协同增加其抗氧化效果。
[0113]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤s1，5％桃胶溶液制备：取50g桃胶，洗净除杂后，加入950g0.1mol/l的naco3和nahco3溶液于80-90℃浸泡、水解4h，粉碎，减压滤过，用稀盐酸溶液调节ph值至6.0-7.0，灭菌得到5％桃胶溶液；步骤s2，10％茯苓提取液的制备：取茯苓菌核粉末100g，加70％乙醇500g，于95℃水浴回流提取3h，冷却至室温，抽滤，提取2次，合并滤液并将滤液减压浓缩回收乙醇，再加水溶解，过滤，加水至1000g，灭菌得到茯苓提取液；步骤s3，培养液制备：分别按5％的重量比称取5％桃胶溶液和10％茯苓提取液，加入mrs液体培养基中，灭菌，得培养液；步骤s4，乳酸菌发酵产物溶胞物的制备：纯种活化：取-80℃冻存的乳酸菌甘油菌并接种于mrs培养基上活化，30-42℃培养20-30h，得到种子培养液；发酵培养：取活化后的种子培养基按1％-5％比例接种于含有桃胶和茯苓的培养液中，30-42℃培养20-30h，即得乳酸菌发酵产物；乳酸菌发酵产物溶胞物制备:取乳酸菌发酵产物，用微射流高压均质机18000-20000psi先均质1次，再提高均质压力至23000-25000psi均质2次，温度控制在0℃-10℃，即得乳酸菌发酵产物溶胞物。步骤s5，乳酸菌发酵产物溶胞物水凝胶的制备：在乳酸菌发酵产物溶胞物中加入功能性助剂，搅拌均匀，再称取总量0.3％黄原胶和0.3％瓜尔胶，混合均匀后撒于液面，室温条件下搅拌使完全溶解即得到淡黄色透明水凝胶。2.根据权利要求1所述的乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中所述桃胶水溶液的浓度为2％-8％，培养液中桃胶加入量为0.1％-0.5％。3.根据权利要求1所述的乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中所述茯苓提取液的浓度为5％-15％，培养液中茯苓提取液加入量为0.3％-0.7％。4.根据权利要求1所述的乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中所述的mrs培养基包括：维生素c、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、半胱氨酸、双歧糖、酵母浸粉、牛肉浸粉、大豆蛋白胨和牛肉蛋白胨。5.根据权利要求1所述的乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中所述种子培养基的加入量为培养液的1％-5％。6.根据权利要求1所述的乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中所述微射流高压均质次数2-5次，其中均质压力梯度增加，先用18000-20000psi均质1次，再将均质压力增加至23000-25000psi均质2次，温度控制在0-10℃。7.根据权利要求1所述的乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s5中所述水凝胶材料包括黄原胶、瓜尔胶、卡波姆、羧甲基纤维素钠的一种
或多种。8.根据权利要求1所述的乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤s5中功能性助剂包括防腐剂和矫味剂。9.根据权利要求8所述的乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述防腐剂包括苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢醋酸钠、苯氧乙醇、乙基已基甘油的一种或多种。10.根据权利要求8所述的乳酸菌桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，其特征在于：所述矫味剂包括薄荷香精、熏衣草香精、茉莉香精、玫瑰香精的一种或多种。

技术总结
本发明公开了一种乳酸菌/桃胶、茯苓发酵产物溶胞物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)含桃胶、茯苓培养液制备；(2)菌种活化；(3)乳酸菌发酵培养得发酵产物；(4)高压微射流均质得发酵产物溶胞物；(5)制备发酵产物溶胞物水凝胶。本发明创造性地利用乳酸菌发酵产物溶胞物与桃胶、茯苓中存在的大量植物多糖、蛋白质、氨基酸等活性成分，再加入新型发酵产品黄原胶，通过分子中大量的羟基、羧基、氨基相互以氢键等方式物理交联緾绕形成立体网络水凝胶，从而达到增加蛋白质、多肽类活性分子及混悬液体系稳定性之目的，且无需低温储存，久置无沉淀且稳定性更高。淀且稳定性更高。淀且稳定性更高。


技术研发人员：查建生 吴琼珠 徐根兴 李新岗 郑云云 吴鑫 郑庆香 朱宪杰 王会玉 吴培培 童莉
受保护的技术使用者：南京斯拜科生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/7/25