一种罗汉果茎段的组培育苗方法与流程

1.本发明涉及组培快繁技术领域，特别是涉及一种罗汉果茎段的组培育苗方法。


背景技术：

2.罗汉果(siraitiagrosvenorii)属于葫芦科多年生藤本植物。罗汉果夏秋季节开花结果，果实营养丰富，不仅是一种新型的功能性甜味剂，还是具有多种功能的药食两用中药材。目前，医药行业对罗汉果的需求量在逐步增加，以添加罗汉果提取物为原料的食品、功能食品及特医食品生产企业也快速崛起，带动了罗汉果种植业的发展。
3.罗汉果种苗繁殖方式主要采用扦插或压蔓，但无性繁殖的繁殖系数低，且会随着繁殖代数的增加导致品种退化，毒素堆积，病毒病增加，从而导致产量大幅度下降。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种罗汉果茎段的组培育苗方法，利用本发明方法可快速获得罗汉果优质种苗，能够解决传统育苗受到合格繁殖材料的限制问题，同时为罗汉果产业的可持续发展提供技术支撑。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明技术方案之一，一种罗汉果茎段的组培育苗方法，包括以下步骤：
7.步骤1，将罗汉果幼嫩枝条剪成带腋芽小段，消毒，得到消毒后的带腋芽茎段；
8.步骤2，将所述消毒后的带腋芽茎段接种在芽诱导培养基中，培养，诱导出不定芽；
9.步骤3，切取诱导出的不定芽接种到芽增殖培养基中，培养，得到芽苗；
10.步骤4，将所述芽苗转移至生根培养基中，培养，得到组培苗；
11.步骤5，所述组培苗在炼苗基质中进行炼苗，之后移栽，得到罗汉果种苗。
12.进一步地，步骤1中，所述罗汉果幼嫩枝条剪成带腋芽小段之前，还包括用0.05％的高锰酸钾溶液浸泡25min后经自来水洗净的步骤；所述消毒具体为：先用无菌水冲洗，之后用0.1％的升汞消毒8min，再用无菌水冲洗，之后用体积浓度75％的酒精消毒30s，最后再用无菌水冲洗。
13.进一步地，步骤2中的芽诱导培养基以及步骤3中的芽增殖培养基的基础培养基组成均为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号。
14.进一步地，步骤2中，所述芽诱导培养基中含有1.8-2.2mg/l的丝瓜络提取物或者6-苄氨基嘌呤；丝瓜络提取物或者6-苄氨基嘌呤的含量高于或者低于上述范围，均不利于芽诱导培养。
15.步骤3中所述芽增殖培养基含有0.8-1.2mg/l的丝瓜络提取物和0.1mg/l的α-萘乙酸，或者，0.8-1.2mg/l6-苄氨基嘌呤和0.1mg/l的α-萘乙酸。丝瓜络提取物或6-苄氨基嘌呤、α-萘乙酸的含量高于或者低于上述记载的范围，均不利于芽增殖。
16.进一步优选的，步骤2中，所述芽诱导培养基中含有1.8-2.2mg/l的丝瓜络提取物；步骤3中所述芽增殖培养基中含有0.8-1.2mg/l的丝瓜络提取物以及0.1mg/l的α-萘乙酸。
17.进一步地，步骤2中，所述芽诱导培养基的组成为：ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+2.0mg/l丝瓜络提取物。
18.进一步地，步骤2中，所述培养具体为：温度26℃
±
2℃，每日光照10-12h，光照强度1000lx，培养周期为21d。
19.进一步地，步骤3中，所述芽增殖培养基的组成为：ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+1.0mg/l丝瓜络提取物+0.1mg/lα-萘乙酸。
20.进一步地，步骤3中，所述培养具体为：温度26℃
±
2℃，每日光照10-12h，光照强度1000lx，培养周期为21d。
21.进一步地，所述丝瓜络提取物的制备方法包括以下步骤：
22.将丝瓜络与水按体积比1:1混合后，先大火煮沸，之后文火煮15-20min，过滤得第一次滤液和滤渣，将滤渣与水按体积比为1:1混合后，先大火煮沸，之后文火煮15-20min，过滤得第二次滤液；将第一次滤液和第二次滤液合并后，减压浓缩为原体积的1/10-1/8，得到丝瓜络提取物。
23.丝瓜络为葫芦科植物丝瓜的干燥成熟果实的维管束，为多孔结构。在制备丝瓜络提取物过程中，水的用量以能够完全浸没丝瓜络或者滤渣为宜，因此限定水的用量为上述记载的量。
24.进一步地，步骤4中，所述生根培养基的组成为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+0.2g/l碳粉+0.1mg/l吲哚丁酸+0.1mg/lα-萘乙酸；所述培养具体为：温度26℃
±
2℃，每日光照16h，光照强度1000lx，培养周期为3-4周。
25.进一步地，步骤5中，所述炼苗基质的组成为：蛭石:珍珠岩:苔藓体积比＝2:1:1。
26.本发明公开了以下技术效果：
27.本发明利用组培快繁技术诱导罗汉果茎段芽增殖，经壮苗生根后能够培育出优质的罗汉果种苗，既能在短时间内培育出大量的优质种苗，加快推广速度，同时也是解决罗汉果病毒病的根本途径。
28.本发明以罗汉果茎段为外植体，通过优化组培快繁方法，提高增殖效率，建立高效成熟的罗汉果离体再生培育体系，为工厂产业化、规范化生产优质罗汉果种苗提供理论依据。
29.丝瓜络通常用作洗碗或者中药，本发明创造性的将丝瓜络提取物用于罗汉果组培育苗，发现丝瓜络对于罗汉果芽诱导、芽增殖具有很好的促进作用。将本发明添加了丝瓜络提取物的芽诱导培养基、芽增殖培养基用于罗汉果组培育苗的芽诱导、芽增殖阶段，能够在短时间内培育出更优质的种苗，对于罗汉果离体再生培育体系具有重要意义。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为本发明实施例1-3在不同芽诱导培养基中的芽诱导情况；其中，a为实施例2，b为实施例1，c为实施例3。
32.图2为本发明实施例1、4-5在不同芽增殖培养基中的芽增殖情况；其中，a为实施例4，b为实施例1，c为实施例5。
33.图3为本发明实施例1、6-7在不同生根培养基中的生根情况；其中，a为实施例6，b为实施例1，c为实施例7。
34.图4为本发明实施例1炼苗、移苗示意图。
具体实施方式
35.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
36.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
37.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
38.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
39.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
40.本发明实施例中所用原材料，如无特殊说明，均可通过市售途径获得。
41.本发明中实施例中所用的“花宝1号”购自莱钡特生物，成分比例：n:p:k＝7:6:19，水溶性速溶肥。
42.本发明中实施例中所用的ms培养基购自索莱宝。
43.本发明实施例中所用基础培养基“ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号”的具体制备方法为：称取ms培养基2.3g，蔗糖25g，琼脂粉7g，花宝1号0.5g，加入1000ml蒸馏水，煮沸溶解，调节ph值5.7-5.9，高压灭菌备用。
44.本发明实施例中所用丝瓜络提取物通过以下步骤制备得到：
45.将丝瓜络加入到水中(丝瓜络与水的体积比为1:1)，先大火煮沸，之后文火煮20min，过滤得第一次滤液和滤渣，将滤渣加入到水中(滤渣与水的体积比为1:1)，先大火煮沸，之后文火煮20min，过滤得第二次滤液；将第一次滤液和第二次滤液合并后，减压浓缩为原体积的1/10，得到丝瓜络提取物。
46.实施例1
47.步骤1，外植体消毒处理：将罗汉果幼嫩枝条用清水洗净，用0.05％的高锰酸钾溶液浸泡25min后经自来水洗净放入超净工作台，把罗汉果幼嫩枝条剪成0.5cm的带腋芽小
段，先用无菌水冲洗3遍后用0.1％的升汞消毒8min，用无菌水冲洗3-5遍后用体积浓度75％的酒精消毒30s，最后再用无菌水冲洗3遍，置于无菌滤纸上，吸干表面水分，得到消毒好的带腋芽茎段。
48.步骤2，芽的诱导培养：将消毒好的带腋芽茎段接种在芽诱导培养基中，芽诱导培养基的组成为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+2.0mg/l丝瓜络提取物；培养条件为26℃
±
2℃培养室瓶中培养，每瓶接种嫩茎为3个，每日光照12h，光照强度1000lx，培养周期为21d。此步骤腋芽成活率为81％，芽诱导情况如图1中b所示。
49.步骤3，继代增殖培养：切取诱导出的不定芽接种到芽增殖培养基中，芽增殖培养基的组成为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+1.0mg/l丝瓜络提取物+0.1mg/lnaa(α-萘乙酸)，培养条件为：26℃
±
2℃培养室瓶中培养，每瓶接种嫩茎为2个，每日光照12h，光照强度1000lx，培养周期为21d。统计芽增值系数为2.77，芽增殖情况如图2中b所示。
50.步骤4，生根培养：将由步骤3得到的生长健壮的芽苗转移至生根培养基中，生根培养基组成为：ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+0.2g/l碳粉+0.1mg/liba(吲哚丁酸)+0.1mg/lnaa(α-萘乙酸)，培养条件为：26℃
±
2℃培养室瓶中培养，每瓶接种嫩茎为1个，每日光照16h，光照强度1000lx。培养周期为3周(3-4周均可)。生根情况如图3中b所示。
51.步骤5，炼苗、移栽：待步骤4中的组培苗长出4-5根主根，3-5片新叶，高约10cm时将瓶盖打开，温室炼苗2-3天后将生根的无菌组培苗取出，用无菌水清洗干净根部培养基并适当修剪根长和叶片，后将组培苗接种于炼苗基质中，炼苗在温室大棚中进行，自然光照和自然温度。基质组合为：蛭石:珍珠岩:苔藓体积比＝2:1:1。移栽后注意加强通风换气保湿。4周后观察并统计移栽苗的生长情况，结果成活率100％。本实施例炼苗、移苗示意图如图4所示。
52.实施例2
53.与实施例1不同之处仅在于，步骤2中，芽诱导培养基的组成为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+2.0mg/l6-ba(6-苄氨基嘌呤)。结果：芽诱导情况如图1中a所示。
54.实施例3
55.与实施例1不同之处仅在于，步骤2中，芽诱导培养基的组成为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+3.0mg/l6-ba(6-苄氨基嘌呤)。结果：芽诱导情况如图1中c所示。
56.实施例4
57.与实施例1不同之处仅在于，步骤3中，芽增殖培养基的组成为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+1.0mg/l6-ba(6-苄氨基嘌呤)+0.1mg/lnaa(α-萘乙酸)。结果：芽增殖情况如图2中a所示。
58.实施例5
59.与实施例1不同之处仅在于，步骤3中，芽增殖培养基的组成为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+1.0mg/l丝瓜络提取物+0.12mg/lnaa(α-萘乙酸)。结果：芽增殖情况如图2中c所示。
60.实施例6
61.与实施例1不同之处仅在于，步骤4中，生根培养基的组成为：ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+0.2g/l碳粉+0.1mg/liba(吲哚丁酸)+0.05mg/lnaa(α-萘乙酸)。结果：生根情况如图3中a所示。
62.实施例7
63.与实施例1不同之处仅在于，步骤4中，生根培养基的组成为：ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+0.2g/l碳粉+0.1mg/liba(吲哚丁酸)+0.15mg/lnaa(α-萘乙酸)。结果：生根情况如图3中c所示。
64.实施例8
65.与实施例1不同之处仅在于，步骤5中基质组合为：蛭石:珍珠岩体积比＝2:1。结果：移栽苗成活率62％
66.实施例9
67.与实施例1不同之处仅在于，步骤5中基质组合为：蛭石:珍珠岩:苔藓:树皮＝1:1:1:1。结果：移栽苗成活率73％
68.本发明还尝试将丝瓜络提取物用于罗汉果组培育苗的生根培养阶段，结果促生根效果不如0.1mg/liba(吲哚丁酸)+0.1mg/lnaa(α-萘乙酸)组合。
69.蛭石+珍珠岩+苔藓(苔藓覆盖表面用于保湿)的基质组合能同时达到较好的疏水和保水能力，相比较蛭石+珍珠岩基质以及蛭石+珍珠岩+苔藓+树皮基质，更有利于罗汉果的生长。
70.本发明通过组织培养手段，建立了简便、安全、高效的罗汉果组培育苗技术体系，可为工厂化生产优质罗汉果种苗提供理论依据，也为通过组织培养技术规模化生产罗汉果脱毒苗建立新的途径。
71.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将罗汉果幼嫩枝条剪成带腋芽小段，消毒，得到消毒后的带腋芽茎段；步骤2，将所述消毒后的带腋芽茎段接种在芽诱导培养基中，培养，诱导出不定芽；步骤3，切取诱导出的不定芽接种到芽增殖培养基中，培养，得到芽苗；步骤4，将所述芽苗转移至生根培养基中，培养，得到组培苗；步骤5，所述组培苗在炼苗基质中进行炼苗，之后移栽，得到罗汉果种苗。2.根据权利要求1所述的罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，步骤2中的芽诱导培养基以及步骤3中的芽增殖培养基的基础培养基组成均为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号。3.根据权利要求2所述的罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，步骤2中，所述芽诱导培养基中含有1.8-2.2mg/l的丝瓜络提取物或者6-苄氨基嘌呤；步骤3中所述芽增殖培养基中含有0.8-1.2mg/l的丝瓜络提取物和0.1mg/l的α-萘乙酸，或者，0.8-1.2mg/l6-苄氨基嘌呤和0.1mg/l的α-萘乙酸。4.根据权利要求3所述的罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，步骤2中，所述芽诱导培养基的组成为：ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+2.0mg/l丝瓜络提取物。5.根据权利要求1所述的罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，步骤2中，所述培养具体为：温度26℃
±
2℃，每日光照10-12h，光照强度1000lx，培养周期为21d。6.根据权利要求3所述的罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，步骤3中，所述芽增殖培养基的组成为：ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+1.0mg/l丝瓜络提取物+0.1mg/lα-萘乙酸。7.根据权利要求1所述的罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，步骤3中，所述培养具体为：温度26℃
±
2℃，每日光照10-12h，光照强度1000lx，培养周期为21d。8.根据权利要求3所述的罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，所述丝瓜络提取物的制备方法包括以下步骤：将丝瓜络与水按体积比1:1混合后，先大火煮沸，之后文火煮15-20min，过滤得第一次滤液和滤渣，将滤渣与水按体积比为1:1混合后，先大火煮沸，之后文火煮15-20min，过滤得第二次滤液；将第一次滤液和第二次滤液合并后，减压浓缩为原体积的1/10-1/8，得到丝瓜络提取物。9.根据权利要求1所述的罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，步骤4中，所述生根培养基的组成为ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.5g/l花宝1号+0.2g/l碳粉+0.1mg/l吲哚丁酸+0.1mg/lα-萘乙酸；所述培养具体为：温度26℃
±
2℃，每日光照16h，光照强度1000lx，培养周期为3-4周。10.根据权利要求1所述的罗汉果茎段的组培育苗方法，其特征在于，步骤5中，所述炼苗基质的组成为：蛭石:珍珠岩:苔藓体积比＝2:1:1。

技术总结
本发明涉及组培快繁技术领域，特别是涉及一种罗汉果茎段的组培育苗方法。方法包括以下步骤：步骤1，将罗汉果幼嫩枝条剪成带腋芽小段，消毒，得到消毒好的带腋芽茎段；步骤2，将所述带腋芽茎段接种在芽诱导培养基中，培养，诱导出不定芽；步骤3，切取诱导出的不定芽接种到芽增殖培养基中，培养，得到芽苗；步骤4，将所述芽苗转移至生根培养基中，培养，得到组培苗；步骤5，所述组培苗在炼苗基质中进行炼苗，之后移栽，得到罗汉果种苗。本发明以罗汉果茎段为外植体，通过优化组培快繁方法，提高增殖效率，建立高效成熟的罗汉果离体再生培育体系，为工厂产业化、规范化生产优质罗汉果种苗提供理论依据。据。据。


技术研发人员：席培宇 李安定 吴凤婵 郭玉琳 彭熙
受保护的技术使用者：贵州省生物研究所
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/7/25