一种嘧啶高效降解菌剂、制备及其应用的制作方法

1.本发明属于生物方法处理废水领域，具体涉及一种处理嘧啶类废水的复合菌剂的制备及其应用。


背景技术：

2.嘧啶亦称“间二氮杂苯”，是一种含有两个间位氮原子的六元芳杂环化合物，存在于许多药物和天然衍生化合物中。用于合成和发现抗病毒药物，如在艾滋病毒和hsv的情况下。也用于合成抑制15-脂氧合酶释放白三烯的强效抑制剂。嘧啶本身无直接用途，其衍生物胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等是核酸重要组成成分。许多药物(例如磺胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、6-巯基嘌呤)中均含有嘧啶环。嘧啶广泛用作医药原料，用于生chemicalbook产维生素b、磺胺嘧啶、磺胺异二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶；农药原料，如二嗪农、嘧啶醇、灭瘟素、除草定、喃啶草、鼠立死、环菌灵、甲菌定、乙菌定、磺嘧菌灵、比嗪农、抗蚜威、乙基虫螨磷、虫螨磷、多氧霉素、嘧啶威、嘧啶磷、氧嘧啶磷、嘧菌醇、异嘧菌醇、尿嘧啶等；染料原料，如具有三卤化嘧啶核的染料与纤维之间的反应良好，作为反应染料，已引起人们的注意。
3.目前嘧啶废水的处理方式主要采用对含嘧啶的单股废水单独进行焚烧，其他物理化学处理方式暂无报道。
4.张海涛从实验室嘧啶生化好氧池废水及其活性污泥中分离得到1株耐盐高效嘧啶降解菌md2，鉴定为柠檬酸杆菌，菌株md2降解嘧啶的最佳环境条件组合为嘧啶浓度150mg/l、盐度1％、ph值7.0、温度30℃，该条件下菌株md2对嘧啶的降解率达到67.84％。目前对磺胺类嘧啶微生物降解的研究较多，但对嘧啶的降解菌研究较少。
5.多项研究结果表明，嘧啶及其同系物和硝基、卤代衍生物具有芳香性，但氧化和亲电取代反应不活泼，亲核反应也不显著。因而嘧啶降解速率较慢，对200mg/l嘧啶及更高浓度的嘧啶降解菌种类较少。因此分离培养具有高浓度嘧啶高耐受能力和高效降解能力的菌株应用嘧啶废水生物处理显得尤其重要。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术中存在的问题，公开了一种嘧啶高效降解菌剂、制备及其应用，利用伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1)制备的微生物菌剂，通过好氧生物降解，可使嘧啶浓度为3000mg/l的嘧啶废水中的嘧啶含量降低99.5％以上。
7.本发明是这样实现的：
8.一种嘧啶高效降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述的方法具体如下：
9.步骤一、固体平板培养：将伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1)转接到固体培养基上，于25～35℃培养箱中培养36h，使菌株活化；
10.步骤二、种子液培养：将经步骤一活化的菌株接种于液体培养基中，25～35℃、150～200rpm振荡培养24～36h，至菌株处于对数生长期；
11.步骤三、菌种发酵扩大培养：将步骤二所述的培养液按照10％比例接种于发酵培养基中进行发酵培养；获得浓度为1
×
109～1
×
10
11
cfu/ml发酵产物；
12.步骤四、在步骤四获得的发酵产物中加入20％保护剂后制备成干粉状菌剂即可。
13.进一步，所述的步骤一中的固体培养基的配置如下：牛肉膏3.0g/l；蛋白胨10.0g/l；nacl5.0g/l；去离子水溶解，ph7～8，115～121℃灭菌15～30min。
14.进一步，所述的步骤二液体培养基的配制方法如下：酵母膏1～10g/l，蛋白胨5～10g/l，葡萄糖5～10g/l，nh4cl1～10g/l，k2hpo41～10g/l，去离子水溶解，ph＝7.0～8.0，115～121℃灭菌15～30min。
15.进一步，所述的步骤三菌种发酵扩大培养基如下：酵母膏1～5g/l，蛋白胨5～10g/l，葡萄糖5～10g/l，nh4cl1～5g/l，k2hpo41～5g/l，kh2po41～5g/l，微量元素溶液1～5ml，消泡剂0.2％，蒸馏水溶解，ph＝7.0～8.0，115～121℃灭菌15～30min。
16.进一步，所述的步骤三中的发酵培养条件为：罐温为37℃，罐压为0.01～0.1mpa，通气量为1：0.6～1.2，搅拌速度150rpm、发酵时间48～72h。
17.进一步，所述的步骤五中的保护剂配方为：酵母粉35％；鱼蛋白35％；微量元素30％。
18.进一步，所述的微量元素液的配方为：mgso40.5g/l；mnso40.1g/l；h3bo30.1g/l；znso4·
7h2o0.1g/l；feso4·
7h2o0.3g/l；ph＝7。
19.本发明还公开了嘧啶高效降解菌剂的应用，是通过以下方式实现的：
20.将上述步骤生产出来的嘧啶高效降解菌剂按质量比为0.5～5
‰
投加量，葡萄糖0.5-1.5g/l(或0.5g/l葡萄糖和0.2g/l嘧啶)，自来水，ph7-8，于菌种扩培槽中25-35℃曝气(do 2-4mg/l)培养48h激活菌种；进一步，菌种激活完成后检测菌密度，镜检达到1
×
109cfu/ml即为完成激活培养，形成嘧啶高效降解菌剂激活菌悬液。
21.进一步，将嘧啶高效降解菌剂激活菌悬液按照5-10
‰
质量比投加至含有3000mg/l嘧啶的无机盐培养基中，48h好氧降解(25-35℃，do 2-4mg/l)可将嘧啶浓度降至0.2mg/l以下，嘧啶降解率大于99.5％。
22.将嘧啶高效降解菌剂激活菌悬液按照5-10
‰
投加至含有3135mg/l嘧啶的某农药生产废水中，48h好氧降解(25-35℃，do 2-4mg/l)可将嘧啶浓度可降解至1mg/l以下，嘧啶降解率大于99.5％。
23.本发明与现有技术相比的有益效果在于：
24.1、本发明提供的一种嘧啶高效降解菌剂可全生物法处理高浓度嘧啶废水，效果好、成本低、无二次污染。
25.2、本发明提供的一种嘧啶高效降解菌剂，对嘧啶耐受能力强，可快速降解高浓度嘧啶，嘧啶浓度≤3000mg/l时，好氧降解48h，嘧啶降解率可达99.5％以上。
26.用于专利程序的微生物保藏：
27.保藏日期：2023年2月27日
28.保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
29.保藏编号：cgmcc no.26675
30.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
31.分类命名：伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1)
32.序列表
33.《110》江苏蓝必盛化工环保股份有限公司
34.《120》一种嘧啶高效降解菌剂、制备及其应用
35.《160》1
36.《170》siposequencelisting 1.0
37.《210》1
38.《211》1505
39.《212》dna
40.《213》伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1'cgmcc 26675')
附图说明
41.图1为本发明实施例1中伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1)菌落形态。
42.图2为本发明实施例2中不同浓度嘧啶随时间降解情况。
具体实施方式
43.为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚，明确，以下列举实例对本发明进一步详细说明。应当指出此处所描述的具体实施仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
44.本发明的嘧啶高效降解菌剂主要组成成分为伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1)，微生物制剂有效活菌数≥10
10
cfu/g。嘧啶高效降解菌剂的制备方法，包括以下顺序和步骤：
45.步骤一、固体平板培养：将伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1)转接到固体培养基上，于25～35℃培养箱中培养36h，使菌株活化；
46.步骤二、种子液培养：将经步骤一活化的菌株接种于液体培养基中，25～35℃、150～200rpm振荡培养24～36h，至菌株处于对数生长期；
47.步骤三、菌种发酵扩大培养：将步骤二所述的培养液按照10％比例接种于发酵培养基中进行发酵培养；获得浓度为1
×
109～1
×
10
11
cfu/ml发酵产物；
48.步骤四、在步骤四获得的发酵产物中加入20％保护剂后制备成干粉状菌剂即可。保护剂配方为：酵母粉35％；鱼蛋白35％；微量元素30％。微量元素液的配方为：mgso40.5g/l；mnso40.1g/l；h3bo30.1g/l；znso4·
7h2o0.1g/l；
49.feso4
·
7h2o0.3g/l；ph＝7。
50.一种嘧啶高效降解菌剂的应用，其特征在于，所述的处理方法中废水依次经过嘧啶高效降解菌剂激活及培养
→
废水处理，具体的实施方案如下：
51.加入质量比为0.3-1％的嘧啶高效降解菌剂，葡萄糖0.5-1.5g/l，自来水，ph7-8，于菌种扩培槽中25-35℃曝气(do 2-4mg/l)培养48h激活菌种；进一步，菌种激活完成后检测菌密度，镜检达到1
×
109cfu/ml以上即完成激活培养，形成嘧啶高效降解菌剂激活菌悬液。
52.将废水调节至ph＝7～8，系统进水嘧啶浓度小于500mg/l(或cod小于1500mg/l，
cod优先)，可补加500mg/l cod当量碳源；
53.嘧啶高效降解菌剂和聚氨酯填料固载实施方式为：将嘧啶高效降解菌剂激活菌悬液按照质量比5～10％的投加量分2-3批次投加入装有70％的聚氨酯填料的反应池中，控制停留时间为24-72h，取样测定cod、嘧啶指标等指标，嘧啶降解率大于90％后去除效果稳定5-10d，以200-500mg/l嘧啶浓度梯度(或cod梯度1000～1500mg/l，cod优先)逐步提高进水嘧啶浓度，每批换水量50-80％，直至进水负荷为目标进水嘧啶浓度；
54.采用本发明提供的嘧啶高效降解菌剂处理嘧啶废水可根据现场实际情况选择合适的生化处理工艺：嘧啶浓度≤3000mg/l，可直接采用好氧生化工艺，也可采用a/o工艺；好氧反应池及厌氧反应池均接种嘧啶高效降解菌剂及加入体积比为50～70％的聚氨酯填料。水力停留时间为：进水嘧啶小于500mg/l，hrt 12h；进水嘧啶1000～1500mg/l，hrt 24h；进水嘧啶2000～3000mg/l，hrt 48h。
55.以下列举具体的实例叙述为所述的嘧啶高效降解菌剂的应用：
56.实施例1
57.菌株获取与鉴定。菌株的获取与鉴定步骤是：
58.步骤一、样品采集与菌株驯化
59.取浙江某农药生产公司污水处理生化池的活性污泥，加入以500mg/l嘧啶为唯一碳源和氮源的无机盐培养基中，活性污泥接种量为10％(v/v)，于30℃150r/min恒温摇床中驯化培养5天，得到驯化培养液1；培养完成后，取驯化培养液1接种于含500mg/l嘧啶的无机盐培养基中，驯化培养液1接种量为10％(v/v)，培养5天得到驯化培养液2；重复上述驯化培养过程连续培养，直至嘧啶降解率大于90％，得到嘧啶降解菌驯化培养液。
60.所述无机盐培养基配方为：kh2po
4 0.5g/l，mgso4·
7h2o 0.2g/l，feso4·
7h2o0.02g/l，mnso4·
h2o 0.02g/l，cacl2·
6h2o 0.01g/l，ph7.0。
61.步骤二、菌株分离与纯化
62.取1ml所述嘧啶降解菌驯化培养液，用经高压蒸汽灭菌的去离子水将其稀释为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
倍浓度的菌液，分别涂布于含500mg/l嘧啶的无机盐固体培养基中，于30℃恒温培养箱中培养2-3天，待培养基上长出单菌落后，挑取数量最多且形态相同的单菌落，进行3次平板划线纯化菌株，得到目的菌株lbq23-1，于4℃冰箱保存。
63.步骤三、菌株lbq23-1的鉴定
64.将菌株lbq23-1接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养48h。观察到菌株lbq23-1的菌落形态呈圆形、淡黄色、光滑、半透明，菌落形态见图1；通过革兰氏染色后在显微镜下呈革兰氏阴性杆状。通过pcr技术对菌株lbq23-1进行16s rdna测序，菌株lbq23-1的16s rdna基因序列如序列表所示。使用nbci基因库中blast对比分析，菌株lbq23-1与数据库中的oceanobacillus iheyensis.strain同源性达99.93％，结合菌株lbq23-1生理生化鉴定，判定菌株lbq23-1属伊平屋桥大洋芽孢杆菌，命名为oceanobacillus iheyensis.lbq23-1。
65.所述牛肉膏蛋白胨固体培养基为在牛肉膏蛋白胨培养基中加入20g/l琼脂；牛肉膏蛋白胨培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl 5g，蒸馏水1l，ph值调至7.5
±
0.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
66.步骤四、菌株oceanobacillus iheyensis.lbq23-1的保藏
67.菌株oceanobacillus iheyensis.lbq23-1已于2023年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26675。
68.实施例2
69.将本发明提供的嘧啶高效降解菌剂按照质量比为1
‰
的接种量接种至含200mg/l嘧啶和1g/l葡萄糖的无机盐培养基中激活培养菌种，接种后置于30℃，150r/min的摇床中培养48h，培养至菌密度1
×
109cfu/ml，形成嘧啶高效降解菌剂激活混悬液。
70.将前述嘧啶高效降解菌剂激活混悬液按5％(v/v)接种量分别接种至包含嘧啶浓度为500mg/l、1000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、2500mg/l、3000mg/l、3500mg/l、4000mg/l的无机盐培养基中。37℃摇床培养，不同时间段取样，测定剩余嘧啶含量。结果如图2所示，500mg/l嘧啶浓度下，12h可降解至1mg/l以下；1000～1500mg/l嘧啶浓度下，24h可降解至1mg/l以下；2000～3000mg/l嘧啶浓度下，48h可降解至1mg/l以下。具体的结果图示如图1所示。
71.在一些实施例中，无机盐培养基可以包括(nh4)2so4、nh4cl、k2hpo4、kh2po4、nacl、na2so4、mgso4·
7h2o、mnso4·
h2o、feso4·
7h2o中任意一种或其组合。实施例2中，无机盐培养基配方为：nh4cl 0.3g/l，kh2po
4 0.5g/l，mgso4·
7h2o 0.2g/l，feso4·
7h2o 0.02g/l，mnso4·
h2o 0.02g/l，cacl2·
6h2o0.01g/l，ph7.0。
72.实施例3
73.将本发明提供的嘧啶高效降解菌剂投加至含嘧啶的废水中，废水取自安徽某农药生产公司，废水原水cod6479mg/l，嘧啶3044mg/l，初始进水嘧啶浓度为500mg/l，调节ph至7.5，加入70％聚氨酯填料，加入质量比为1％的嘧啶高效降解菌剂，30℃好氧曝气培养(do 2-4mg/l)，取样测定cod、嘧啶等指标，批次换水量80％，hrt 24-48h，嘧啶降解率大于90％且去除效果稳定4-6d，进水按500mg/l嘧啶浓度梯度逐步提高至原水嘧啶3044mg/l，每一负荷进水维持6-8天，处理原水嘧啶3044mg/l 3批效果稳定后，换水95％，换水后不同时间段取样，测定剩余嘧啶含量。结果显示，原水嘧啶3044mg/l，48h嘧啶浓度可降解至1mg/l以下，去除率99.5％以上，出水cod降解至114～162mg/l，cod去除率约97％。
74.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1)，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.26675，保藏日期为2023年2月27日。2.一种嘧啶高效降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述的嘧啶高效降解菌剂中含有伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1)，所述的制备方法为：步骤一、固体平板培养：将伊平屋桥大洋芽孢杆菌(oceanobacillus iheyensis.lbq23-1)转接到固体培养基上，于25～35℃培养箱中培养36h，使菌株活化；步骤二、种子液培养：将经步骤一活化的菌株接种于液体培养基中，25～35℃、150～200rpm振荡培养24～36h，至菌株处于对数生长期；步骤三、菌种发酵扩大培养：将步骤二所述的培养液按照10％比例接种于发酵培养基中进行发酵培养；获得浓度为1
×
109～1
×
10
11
cfu/ml发酵产物；步骤四、在步骤四获得的发酵产物中加入20％保护剂后制备成干粉状菌剂即可。3.根据权利要求2所述的一种嘧啶高效降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤一中的固体培养基的配置如下：牛肉膏3.0g/l；蛋白胨10.0g/l；nacl5.0g/l；去离子水溶解，ph7～8，115～121℃灭菌15～30min。4.根据权利要求2所述的嘧啶高效降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤二液体培养基的配制方法如下：酵母膏1～10g/l，蛋白胨5～10g/l，葡萄糖5～10g/l，nh4cl1～10g/l，k2hpo41～10g/l，去离子水溶解，ph＝7.0～8.0，115～121℃灭菌15～30min。5.根据权利要求2所述的嘧啶高效降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤三菌种发酵扩大培养基如下：酵母膏1～5g/l，蛋白胨5～10g/l，葡萄糖5～10g/l，nh4cl1～5g/l，k2hpo41～5g/l，kh2po41～5g/l，微量元素溶液1～5ml，消泡剂0.2％，蒸馏水溶解，ph＝7.0～8.0，115～121℃灭菌15～30min；所述的微量元素液的配方为：mgso40.5g/l；mnso40.1g/l；h3bo30.1g/l；znso4·
7h2o0.1g/l；feso4·
7h2o0.3g/l；ph＝7；所述的步骤三中的发酵培养条件为：罐温为37℃，罐压为0.01～0.1mpa，通气量为1:0.6～1.2，搅拌速度150rpm、发酵时间48～72h。6.根据权利要求2所述的嘧啶高效降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤五中的保护剂配方为：酵母粉35％；鱼蛋白胨35％；微量元素30％；所述的微量元素液的配方为：mgso40.5g/l；mnso40.1g/l；h3bo30.1g/l；znso4·
7h2o0.1g/l；feso4·
7h2o0.3g/l；ph＝7。7.一种如权利要求2～6任一所述的制备方法制得的嘧啶高效降解菌剂。8.根据权利要求7所述的嘧啶高效降解菌剂，其特征在于，所述的活性微生物中微生物制剂有效活菌数量≥10
10
cfu/g。9.一种如权利要求7所述的嘧啶高效降解菌剂在化工废水中的应用。10.根据权利要求9所述的嘧啶高效降解菌剂在化工废水中的应用，其特征在于，将嘧啶高效降解菌剂按照0.5～5％比例投加至含500～3000mg/l嘧啶的无机盐培养基中；500mg/l嘧啶浓度下，12h可降解至1mg/l以下；1000～1500mg/l嘧啶浓度下，24h可降解至1mg/l以下；2000～3000mg/l嘧啶浓度下，48h可降解至1mg/l以下；将嘧啶高效降解菌剂按照05～5
‰
比例投加至含有3044mg/l嘧啶的某农药生产废水中，48h可将嘧啶降解至1mg/l
以下，嘧啶去除率超过99.5％。

技术总结
本发明公开了一种嘧啶高效降解菌剂、制备及其应用，属于生物技术领域，本发明处理嘧啶废水的微生物菌剂主要组成成分为伊平屋桥大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis.LBQ23-1)，经16S rDNA序列测序鉴定为Oceanobacillus iheyensis.已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26675，保藏日期2023年2月27日。本发明的嘧啶降解菌剂能以嘧啶为唯一碳源和氮源进行生长，48h能将3000mg/L嘧啶降解至1mg/L以下，嘧啶去除率达到99.5％以上。本发明制备的菌制剂按质量比0.5～5


技术研发人员：赵振华 邵汝英 夏娇 徐卫东 高峰
受保护的技术使用者：江苏蓝必盛化工环保股份有限公司
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/7/25