一种IL-17信号通路相关基因作为血液中高NEFA标志物及应用

一种il-17信号通路相关基因作为血液中高nefa标志物及应用
技术领域
1.本发明涉及奶牛血液高nefa含量筛查技术领域，尤其涉及一种il-17信号通路相关基因作为血液中高nefa标志物及应用。


背景技术：

2.伴随着我国牛奶总产量呈现出节节升高的现状，产奶量大幅提高的同时，奶牛围产期营养代谢性疾病的高发，导致了奶牛淘汰率的升高，奶牛繁殖能力、免疫能力的降低，这给我国奶牛业的蓬勃发展蒙上了一层阴翳。围产期奶牛经历从妊娠晚期到早期泌乳适应期的变化，使得机体分泌及代谢水平发生显著改变。因此，围产期是奶牛营养介导的代谢性疾病(例如高nefa血症、脂肪肝病等)的高发阶段。血液中高nefa会导致奶牛食欲下降，造成酮体沉积的恶性循环，从而导致围产期奶牛产奶量下降。它还会导致奶牛更易患各种感染和疾病。
3.如何预测奶牛血液中nefa含量高的风险，使奶牛平安渡过免疫力低下的围产期，进而提高奶牛养殖场的经济效益，成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种il-17信号通路相关基因作为血液中高nefa标志物及应用，预测奶牛血液中nefa高含量风险，使奶牛平安渡过免疫力低下的围产期。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种il-17信号通路相关基因作为血液中高nefa标志物及应用，所述标志物包括s100a8基因、mmp9基因、s100a9基因、il-1β基因和lcn2基因。
7.作为优选，所述s100a8基因、mmp9基因、s100a9基因、il-1β基因和lcn2基因来自于奶牛外周血cd4
+
t细胞。
8.本发明还提供了所述标志物在制备降低奶牛血液中高nefa含量制剂中的应用。
9.作为优选，所述s100a8基因、mmp9基因、s100a9基因、il-1β基因和lcn2基因的检测试剂为mrna检测试剂。
附图说明
10.图1为差异基因富集在il-17信号通路；
11.图2为差异基因的mrna表达水平。
具体实施方式
12.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
13.实验动物基本信息
14.实验动物选取：本实验奶牛选自黑龙江大庆市某集约化大型奶牛养殖场产后一周内的荷斯坦牛。
15.所有奶牛信息见表1。
16.表1健康奶牛与高nefa血症奶牛详细信息
[0017][0018]
血液样品采集：实验奶牛于清晨未进食前经尾静脉采血，血液样品20ml于肝素钠抗凝管中用于分离cd4
+
t细胞。(实验用到的主要试剂和仪器如表2和表3所示)
[0019]
表2主要试剂及生产厂家
[0020][0021]
表3主要仪器及生产厂家
[0022]
[0023][0024]
分离cd4
+
t细胞
[0025]
1、取新鲜抗凝全血(肝素钠抗凝)，使用等体积的全血及组织稀释液或者pbs稀释全血；
[0026]
2、在50ml离心管中加入15ml分离液，将15ml稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰；(当稀释后血液体积小于3ml时，加入3ml分离液；大于等于3ml，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否者会影响分离效果)
[0027]
3、室温，水平转子1000
×
g，离心30min；
[0028]
4、离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞，离心管底部是红细胞与粒细胞；
[0029]
5、小心的吸取白膜层细胞到15ml洁净的离心管中，10mlpbs或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，水平转子400
×
g，离心10min。
[0030]
6、若细胞未完全离下来，则吸取一半洗涤液弃掉后再次补满洗涤液，水平转子400
×
g，离心10min。
[0031]
7、弃上清，加入2ml红细胞裂解液，4℃冰箱中放置15min后，加入细胞洗涤液终止红细胞裂解液的作用，水平转子300
×
g，离心5分钟；
[0032]
8、弃上清，1ml rmpi-1640培养基重悬，转移至1.5ml离心管中，水平转子300
×
g，离心5分钟；
[0033]
9、弃上清，加入100μl分选buffer重悬，加入2μl cd4monoclonalantibody，4℃冰箱中孵育25min；
[0034]
10、离心管中补加1ml分选buffer，水平转子300
×
g，离心5分钟；
[0035]
11、弃上清，加入80μl分选buffer重悬，加入25μlanti-mouse igg2a+b microbeads，4℃冰箱中孵育15min；
[0036]
12、孵育时将500μl分选buffer加至ms型细胞磁珠分选柱内，使其自然流尽，重复2～3次；
[0037]
13、孵育结束后体系中补加1ml分选buffer，水平转子300
×
g，离心5分钟；
[0038]
14、弃上清，加入500μl分选buffer重悬细胞，将细胞悬液转入分选柱内自然流尽，加入500μl分选buffer洗涤，重复2次，加入2ml分选buffer将细胞快速推出，水平转子300
×
g，离心5分钟；
[0039]
15、用1ml rmpi-1640培养基重悬cd4
+
t细胞，计数，进行后续实验。
[0040]
rna提取
[0041]
根据trizol法提cd4
+
t细胞内总rna，其具体过程如下(注意：该过程所用到都是无rna酶的枪头)：
[0042]
1、cd4
+
t细胞加入1000μltrizol，放置在-80℃冰箱1小时，使细胞与trizol充分结
合；
[0043]
2、加入200μl氯仿，振荡器剧烈震荡20s，室温静止10min后，可观察到样品开始分层；
[0044]
3、4℃条件下，12000rpm离心10min，此过程结束后，样品会分成三层；
[0045]
4、吸收最上层液体，转移到新的1.5ml无rna酶的ep管中(注意：实验过程中枪头不要碰到中层液体，否则会影响rna纯度)；
[0046]
5、加入500μl异丙醇，缓慢倒置，充分混匀，置于冰上10min；
[0047]
6、4℃条件下，12000rpm离心10min，去除上清液，加入1000μl预冷75％酒精(ddh2o：无水乙醇1:3)；
[0048]
7、4℃条件下，9600rpm离心8min，弃上清，该步骤重复两次；
[0049]
8、将1.5ml无rna酶的ep管内液体吸干净，勿倒置，放在干净通风处晾干40min，根据rna量加入depc水(焦碳酸二乙酯)；接下来用超微量核酸蛋白检测仪测定rna浓度，最后用agilent 2100检测rna的完整性，rin数＞7.0即为合格。
[0050]
rna纯化和反转录
[0051]
通过olidgo(dt)磁珠法获取携带polya(聚腺苷酸)的纯化mrna，mrna的3’端的polya与磁珠在binding buffer的作用下相结合，在加热条件下解离洗脱到溶液中。
[0052]
纯化后的mrna加入fragmentbutter 70℃作用1.5min，使用stop butter终止反应，通过沉淀剂(naac糖原无水乙醇)沉淀酶切产物，被切割的mrna逆转录成cdna，再利用大肠杆菌dna聚合酶ⅰ和rnase h使dna和rna复合双链转化为dna双链。
[0053]
接下来将dna双链的末端变成平末端，在每条链的平末端添加a碱基，方便连接索引接头，使用磁珠法筛选和纯化片段大小。经过udg酶处理后，利用pcr形成dna大小在250～350bp之间作为文库。根据供应商的建议，我们在abi 3500上对200bp双端进行测序；
[0054]
使用bioanalyzer 2100对总rna样品进行质检，根据18s和28s两个核糖体rna的电泳峰的高低和尖锐程度反应rna的质量；
[0055]
对转录组学结果进行分析，首先使用cutadapt软件得到cleandata，然后使用hisat2把cleandata与基因组进行对比，接下来使用stringgtie软件初始组装转录本，使用gffcompare软件将所有样本的所有转录组进行合并，最后找到差异基因，通过使用r包edger分析显著样本间差异，将差异因子fc》2倍或fc《0.5倍且p值《0.05的基因定义为差异基因，进行go和kegg富集，分析发现il-17信号通路差异基因，如图1所示。
[0056]
qpcr
[0057]
利用qpcr技术对il-17通路上的差异基因进行mrna水平的验证；
[0058]
首先合成差异基因的上下游引物序列，通过ncbi查找差异基因的全部序列，接下来使用premier5.0软件设计出特异性引物序列，如表4所示。
[0059]
表4差异基因特异性引物序列
[0060]
[0061][0062]
其次合成cdna，提取的rna用超微量核酸蛋白测定仪检测其浓度，其浓度范围最好在150～2000ng/μl之间，过大或过小都会导致所加的rna体积不准确，同时保证260/280和260/230的比值在1.8～2.0之间，若超出就不能保证实验数据的可靠性；
[0063]
每个样品加入1μg的rna，同时使rna的体积与depc水的体积之和是7μl，加入1μl dnaeraser，加入2μl 5x gdnaeraser buffer，混合均匀后，瞬离5s左右，放置在反转录pcr仪里，根据设置好的程序2min后暂停程序，同时取出样品；
[0064]
每管加入1μlprime script rt enzyme mix i，1μl rt primermix，4μl 5x prime script buffer 2(for real time)，4μl rnase free dh2o，混合均匀后，瞬离5s左右，放置在反转录pcr仪里，继续程序，具体反应条件见表5；
[0065]
表5反转录条件及体系
[0066]
[0067][0068]
最后按照sybr荧光定量试剂盒说明书进行差异基因的mrna表达水平检测，具体反应体系如表6所示。
[0069]
表6pcr反应体系和程序
[0070][0071]
利用2-δδct
法计算并分析结果，结果如图2所示：
[0072]
数据分析：所有数据均使用ibm spss 26.0软件进行统计分析，结果以均数
±
标准差表示，采用独立样本t检验分析组间均值差异显著性；采用pearson直线相关性分析各差异指标与血液nefa含量的相关性，p《0.05为显著相关，p《0.01为极显著相关；采用roc曲线对显著性指标的预警值进行分析，曲线下面积大于0.5表示指标具有预警意义，在0.7～0.9之间表示具有一般的预警作用，大于0.9可以作为金指标进行预测。
[0073]
表7il-17通路相关性指标
[0074]
项目皮尔逊相关性(k值)p值s100a80.795**0.006s100a90.815**0.004mmp90.5090.133il-1β0.749*0.013lcn20.5800.079
[0075]
附注：*(p《0.05)表示差异显著，**(p《0.01)表示差异极显著。
[0076]
在炎症过程中，s100a8/a9被主动释放并通过刺激白细胞募集和诱导细胞因子分泌在调节炎症反应中发挥关键作用。s100a8/a9作为主要的候选生物标志物，以及炎症相关疾病治疗反应的预测指标。mmp9调节炎症并促进炎症细胞因子白细胞介素1β(il-1β)的释放。白细胞介素-1β(il-1β)是一种促炎细胞因子。脂质运载蛋白2(lcn2)是一种先天性免疫蛋白，通过调节免疫反应在促进无菌性炎症中发挥关键作用。
[0077]
利用roc曲线分析s100a8、s100a9、il-1β指标对奶牛血液中nefa含量的预警作用，结果如表8所示。
[0078]
表8cd4
+
t细胞s100a8、s100a9、il-1β预测参数
[0079][0080]
s100a8、s100a9和il-1β曲线下面积分别为0.720、0.760、0.9722和0.840，表明s100a8、s100a9和il-1β对奶牛高nefa含量具有较好的预警作用。当s100a8的基因表达量》51.48时预测奶牛患高nefa含量的敏感度60％，特异性1；当s100a9的基因表达量》84.13时预测奶牛高nefa含量的敏感度80％，特异性0.8；当il-1β的基因表达量》1.95时预测奶牛患高nefa含量的敏感度80％，特异性0.8。
[0081]
由以上实施例可知，本发明提供了一种il-17信号通路相关基因作为血液中高nefa标志物及应用，所述标志物包括s100a8、mmp9、s100a9、il-1β、lcn2。本发明以健康和高nefa血症奶牛为模型，对外周血cd4
+
t细胞进行rna-seq测序，筛选出差异基因，通过kegg途径发现差异基因富集在il-17信号通路，通过qpcr技术检测差异基因在中性粒细胞mrna的表达水平，pearson相关性分析以及roc曲线预警分析，s100a8、s100a9、il-1β可作为预测奶牛血液中高nefa含量的指标。本发明可以预测奶牛血液中高nefa含量对奶牛本身造成的风险，使奶牛平安渡过免疫力低下的围产期，进而提高奶牛养殖场的经济效益。
[0082]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种il-17信号通路相关基因作为血液中高nefa标志物及应用，其特征在于，所述标志物包括s100a8基因、mmp9基因、s100a9基因、il-1β基因和lcn2基因。2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述s100a8基因、mmp9基因、s100a9基因、il-1β基因和lcn2基因来自于奶牛外周血cd4
+
t细胞。3.权利要求1或2所述标志物在制备降低奶牛血液nefa含量制剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述s100a8基因、mmp9基因、s100a9基因、il-1β基因和lcn2基因的检测试剂为mrna检测试剂。

技术总结
本发明涉及奶牛血液NEFA含量筛查技术领域。本发明提供了一种IL-17信号通路相关基因作为血液中高NEFA标志物及应用，所述标志物包括S100A8基因、MMP9基因、S100A9基因、IL-1β基因和LCN2基因。本发明以健康和高NEFA血症奶牛为模型，对外周血CD4


技术研发人员：张冰冰 徐闯 杨威 李铭 王晶晶 温佳楠 夏成
受保护的技术使用者：黑龙江八一农垦大学
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/25