GLP-1和GDF15的融合蛋白及其用途的制作方法

glp-1和gdf15的融合蛋白及其用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及glp-1和gdf15的融合蛋白及其用途。


背景技术：

2.生长分化因子15(gdf15)，又名巨噬细胞抑制细胞因子-1(mic-1)、胎盘转化生长因子-β(ptgf-β)、胎盘骨形态发生因子(plab)、前列腺衍生因子(pdf)、非甾体抗炎药活化基因(nag-1)，是转化生长因子(tgf
‑ꢀ
)超家族分支成员。成熟的gdf15多肽包含112个氨基酸，而体内循环的具有生物活性的gdf15则是两条多肽通过链间二硫键形成的同源二聚体蛋白(24.5kd)。
3.已报道gdf15循环水平升高与晚期癌症患者食物摄入量减少和体重降低相关(johnen h等人，nat med,2007)。并且，转基因高表达gdf15的小鼠以及施用重组gdf15的小鼠均表现出体重减低和食物摄入量减少，并且具有改善的糖耐受水平(xiong y等人，sci transl med，2017)，表明gdf15具有治疗肥胖症、2型糖尿病(t2d)、非酒精性脂肪肝炎(nash)等疾病的潜力。
4.胰高血糖素样肽-1(glp-1)是肠道l细胞分泌的一种肽类激素，能够通过促进胰岛素分泌而降低血糖，同时还能够通过抑制食欲、延缓胃排空等作用机制来降低体重。glp1的主要生物活性片段是源自胰高血糖素原肽的翻译后加工的30或31个氨基酸的肽片段(glp 1的氨基酸7 36或7 37)。基于上述生物学效果，glp-1类似物在临床上已经成功用于治疗2型糖尿病和肥胖。
5.gdf15和glp-1虽然都能够通过抑制食欲来降低体重并且改善代谢综合征，但从作用机制上分析，这两个分子的作用通路可能并不重叠。因此，需要改进的技术方案以同时发挥两个分子的作用，获得更好的减重和改善代谢综合征功效。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种glp-1和gdf15的融合蛋白及其用途，本发明构建了一种具有glp-1和gdf15双靶点活性的融合蛋白，该融合蛋白整体具有优良的理化性质和稳定性，glp-1和gdf15两个靶点分子具有良好的活性和药代动力学的平衡性，有利于双靶效应的发挥。
7.为此，第一方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括a)第一多肽片段，其包括胰高血糖素样肽-1(glp-1)多肽；b)第二多肽片段，其包括免疫球蛋白fc区；c)第三多肽片段，其包括生长分化因子15(gdf15)活性结构域；所述第一多肽片段、第二多肽片段和第三多肽片段沿氨基端至羧基端方向通过连接肽依次连接。
8.进一步，所述glp-1多肽包含以下氨基酸序列之一：seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4；或者，
9.所述glp-1多肽包含与下组序列之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4；或者，
10.所述glp-1多肽相对于seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4具有不超过6、5、4、3、2、1个突变同时保留突变前多肽的基本生物活性。
11.在一些实施方式中，所述glp-1多肽包含下组突变中的一种或不同位置的两种以上的组合：a8g、g22e、i29v、a30e、a30q、r36g。其中，所述突变位点的位置遵循seq id no：1(glp-1(1-37))中的位置编号。
12.在一些实施方式中，所述glp-1多肽包含下组突变中的一种：a8g，g22e，r36g；或者a8g，g22e，a30e，r36g；或者a8g，g22e，a30q，r36g；或者a8g，g22e，i29v，a30q，r36g。
13.在某实施方式中，所述具有突变的glp-1多肽包含以下氨基酸序列：seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7或seq id no：8。
14.在另一实施方式中，所述glp-1多肽包含与下组序列之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7或seq id no：8。
15.表1胰高血糖素样肽-1(glp-1)多肽
[0016][0017][0018]
注：表1中，表示氨基酸位置的数字编号遵循seq id no：1(glp-1(1-37))中的位置编号，即，以seq id no：1的n末端第一个氨基酸为第一位，依次向c末端方面进行编号。
[0019]
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白fc区为igg fc；进一步地，其选自igg1 fc、igg2、igg3 fc、igg4 fc中的一种。
[0020]
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白fc区为人免疫球蛋白fc区。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白fc区为人igg fc，例如人igg1 fc或人igg4 fc等。
[0021]
进一步，所述免疫球蛋白fc区为天然的免疫球蛋白fc区，或者免疫球蛋白fc区变体。
[0022]
在某实施方式中，所述免疫球蛋白fc区的氨基酸序列包括seq id no：9、seq id no：10；或者，所述免疫球蛋白fc区包含与下组序列之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：9、seq id no：10；或者，所述免疫球蛋白fc区相对于seq id no：9、seq id no：10具有不超过6、5、4、3、2、1个突变同时保留突变前多肽的基本生物活性。
[0023]
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白fc区变体包含以下突变：依照eu编号将igg fc的第356位的氨基酸取代为：除d、e和c以外的氨基酸。例如，将igg fc的第356位的氨基酸取代为下组中的一种：g、s、a、t、v、n、l、i、q、y、f、h、p、m、k、r。
[0024]
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白fc区变体包含以下突变：依照eu编号将igg fc的第439位的氨基酸取代为：除r、h、k和c以外的氨基酸。例如，将igg fc的第439位的氨基酸取代为下组中的一种：g、s、a、t、v、d、n、l、i、e、q、y、f、p、m。
[0025]
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白fc区变体依照eu编号在igg fc中包含以下突变：e356g、e356s、e356a、e356t、e356v、e356n、e356l、e356i、e356q、e356y、e356f、e356h、e356p、e356m、e356k、e356r中的一种，和/或k439g、k439s、k439a、k439t、k439v、k439d、k439n、k439l、k439i、k439e、k439q、k439y、k439f、k439h、k439p、k439m中的一种。
[0026]
在优选的实施方式中，所述免疫球蛋白fc区变体依照eu编号在igg fc中包含以下突变：e356k、e356r、e356q、e356a、e356n中的一种，和/或k439d、k439e、k439q、k439a、k439n中的一种。
[0027]
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白fc区变体还包含以下突变：依照eu编号将igg fc的第234位和第235位的氨基酸取代为aa，和/或将第447位的氨基酸删除。例如，对于igg1 fc，还包含以下突变：l234a和l235a，和/或第447位的氨基酸删除；对于igg4 fc，还包含以下突变：f234a和l235a，和/或将第447位的氨基酸删除。
[0028]
在某实施方式中，所免疫球蛋白fc区变体依照eu编号在igg fc中的氨基酸取代仅为下组中的一种：
[0029]
依照eu编号第356位的氨基酸取代；
[0030]
依照eu编号第439位的氨基酸取代；
[0031]
依照eu编号第356位和第439位的氨基酸取代；
[0032]
依照eu编号第234位和第235位的氨基酸取代；
[0033]
依照eu编号第356位、第234位和第235位的氨基酸取代；
[0034]
依照eu编号第439位、第234位和第235位的氨基酸取代；
[0035]
依照eu编号第356位、第439位、第234位和第235位的氨基酸取代；
[0036]
在各位置所述的氨基酸取代具有本发明所述的含义。
[0037]
在某实施方式中，所述免疫球蛋白fc区变体的氨基酸序列包括下组序列之一：seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：18、seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：22、seq id no：23、seq id no：24、seq id no：25、seq id no：26、seq id no：27、seq id no：28、seq id no：29、seq id no：30、seq id no：31、seq id no：32、seq id no：33、seq id no：34、seq id no：35、seq id no：36、seq id no：37。
[0038]
在另一实施方式中，所述免疫球蛋白fc区变体包含与下组序列之一具有至少
85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：11-37。
[0039]
表2免疫球蛋白fc区
[0040]
[0041]
[0042][0043]
注：表2中，表示氨基酸位置的数字编号按照eu编号系统。
[0044]
进一步，所述gdf15活性结构域包含选自下组之一的氨基酸序列：
[0045]
seq id no：38；或者，
[0046]
与seq id no：38具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列；或者，
[0047]
在seq id no：38的n末端有1-14个氨基酸截短，和/或在seq id no：38中具有不超过5、4、3、2、1个突变同时保留突变前多肽的基本生物活性。
[0048]
进一步，所述seq id no：38的n末端的氨基酸截短的数量为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个。
[0049]
进一步，所述seq id no：38中的氨基酸突变的位置选自下组中的一个、两个、或三个：第5位、第6位、第21位、第26位、第30位、第47位、第54位、第55位、第57位、第67位、第69位、第81位、第94位、第107位。
[0050]
进一步，所述seq id no：38中的氨基酸突变选自下组中的一个、不同位置的任两个、或者不同位置的任三个：d5e、h6d、h6e、r21q、r21h、d26e、a30s、a47d、a54s、a55e、m57t、r67q、k69r、a81s、t94e、k107q。
[0051]
在一些实施方式中，所述gdf15活性结构域包含seq id no：38所示的氨基酸序列。
[0052]
在另一些实施方式中，所述gdf15活性结构域包含以下序列：在seq idno：38的n末端有1-14个氨基酸截短的氨基酸序列。
[0053]
在又一些实施方式中，所述gdf15活性结构域包含以下序列：在seq idno：38中含有不超过5、4、3、2、1个突变的氨基酸序列；所述在seq id no：38中的氨基酸突变具有本发
明所述的含义。
[0054]
在再一些实施方式中，所述gdf15活性结构域包含以下序列：在seq idno：38的n末端有1-14个氨基酸截短，且在seq id no：38中含有不超过5、4、3、2、1个突变的氨基酸序列；所述在seq id no：38中的氨基酸突变具有本发明所述的含义。
[0055]
在某实施方式中，所述gdf15活性结构域包含下组序列之一：seq id no：38、seq id no：39、seq id no：40、seq id no：41、seq id no：42、seq id no：43、seq id no：44、seq id no：45、seq id no：46、seq id no：47、seq id no：48、seq id no：49、seq id no：50、seq id no：51、seq id no：52、seq id no：53、seq id no：54、seq id no：55、seq id no：56、seq id no：57、seq id no：58。
[0056]
在另一实施方式中，所述gdf15活性结构域包含与下组序列之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：38-58。
[0057]
表3生长分化因子15(gdf15)活性结构域
[0058]
[0059][0060]
注：表3中，表示氨基酸位置的数字编号方式为：以seq id no：38的n末端第一个氨基酸为第一位，依次向c末端方向进行编号。
[0061]
在一些实施方式中，所述第一多肽片段与所述第二多肽片段之间通过第一肽接头连接，和/或所述第二肽片段与所述第三肽片段之间通过第二肽接头连接。
[0062]
进一步，所述第一肽接头、第二肽接头各自独立地选自柔性肽接头、刚性肽接头中的一种或两种的组合。
[0063]
在一些实施方式中，所述第一肽接头和第二肽接头各自独立地选自(g4x)n、(x’p)m、(eaaak)
p
、gq中的一种或两种以上的组合，其中n、m、p、q各自独立地选自1-10的整数，x为丝氨酸(s)或丙氨酸(a)，x’为丙氨酸(a)、赖氨酸(k)或谷氨酸(e)。
[0064]
在某实施方式中，所述第一肽接头和/或第二肽接头包含(g4x)n和(x’p)m的组合，所述n、m、x、x’具有本发明所述的含义。
[0065]
在某实施方式中，所述第一肽接头和/或第二肽接头包含(g4x)
n1-(x’p)
m-(g4x)
n2
，
其中n1、m、n2各自独立地选自1-10的整数，x为s或a，x’为a、k或e。
[0066]
在某实施方式中，所述第一肽接头和/或第二肽接头包含(g4x)
n1-(x’p)
m-(g4x)
n2
，其中n1为2，m为10，n2为2。
[0067]
在另一实施方式中，所述第一肽接头和/或第二肽接头包含gq和(x’p)m的组合，所述q、m、x’具有本发明所述的含义。
[0068]
在某实施方式中，所述第一肽接头和/或第二肽接头包含g
q1-(x’p)
m-g
q2
，q1、m、q2各自独立地选自1-10的整数，x’为a、k或e。
[0069]
在某实施方式中，所述第一肽接头和/或第二肽接头包含g
q1-(x’p)
m-g
q2
，其中q1为4，m为10，q2为4。
[0070]
在另一实施方式中，所述的肽接头包括(g4x)n、(x’p)m和gq的组合，所述n、m、q、x、x’具有本发明所述的含义。
[0071]
在某些实施方式中，所述第一肽接头和/或第二肽接头包含(g4x)
n1-g
q1-(x’p)
m-(g4x)
n2-g
q2
，n1、q1、m、n2、q2各自独立地选自1-10的整数，x为s或a，x’为a、k或e。
[0072]
在某些实施方式中，所述第一肽接头和/或第二肽接头包含(g4x)
n1-g
q1-(x’p)
m-(g4x)
n2-g
q2
，其中n1为1，q1为4，m为10，n2为1，q2为4。
[0073]
在某些实施方式中，所述第一肽接头和第二肽接头各自独立地包含选自下组的氨基酸序列：
[0074]
ggggsggggsggggs(seq id no：78)、ggggapapapapapapapapapapgggg(seq id no：79)、ggggsggggsapapapapapapapapapapggggsggggs(seq id no：80)、ggggsggggsepepepepepepepepepepggggsggggs(seq id no：81)。
[0075]
在一些实施方式中，所述融合蛋白包括选自下组之一的氨基酸序列：seq id no：59、seq id no：60、seq id no：61、seq id no：62、seq id no：63、seq id no：64、seq id no：65、seq id no：66、seq id no：67、seq id no：68、seq id no：69、seq id no：70、seq id no：71、seq id no：72、seq id no：73、seq id no：74、seq id no：75、seq id no：76、seq id no：77。
[0076]
在另一实施方式中，所述融合蛋白包含与下组序列之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：59-77。
[0077]
表4glp-1-fc-gdf15融合蛋白
[0078]
[0079][0080]
注：表4中，glp-1多肽中表示氨基酸位置的数字编号方式为：以seq idno：1的n末端第一个氨基酸为第一位，依次向c末端方向进行编号；免疫球蛋白fc区中表示氨基酸位置的数字编号依照eu编号；gdf15活性结构域中表示氨基酸位置的数字编号方式为：以seq id no：38的n末端第一个氨基酸为第一位，依次向c末端方向进行编号。
[0081]
本发明的第二方面，提供一种同源二聚体融合蛋白，其由本发明第一方面所述的融合蛋白所构成。
[0082]
本发明的第三方面，提供一种生物材料，所述生物材料为(i)、(ii)、(iii)中的任一种：
[0083]
(i)核酸，所述核酸包括编码本发明所述的融合蛋白的核苷酸序列；
[0084]
(ii)载体，所述载体包含(i)中的核酸；
[0085]
(iii)宿主细胞，所述宿主细胞含有(i)中的核酸和/或(ii)中的载体。
[0086]
本发明的第四方面，提供所述融合蛋白的制备方法，包括在适于表达所述融合蛋白的条件下培养本发明第三方面所述的宿主细胞，并且对所述宿主细胞表达得到的融合蛋白进行纯化。
[0087]
本发明的第五方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面
所述的融合蛋白和/或本发明第二方面所述的同源二聚体融合蛋白作为活性成分，所述融合蛋白和/或所述同源二聚体融合蛋白以治疗有效量存在于所述药物组合物中。
[0088]
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
[0089]
本发明的第六方面，提供所述融合蛋白、同源二聚体融合蛋白、或所述药物组合物在制备治疗代谢疾病的药物中的应用。
[0090]
进一步，所述代谢疾病包括ii型糖尿病、肥胖症、血脂异常、糖尿病性肾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝病等。
[0091]
本发明的第七方面，提供所述融合蛋白、同源二聚体融合蛋白、或所述药物组合物在制备用于减少受试者的食物摄入、体重、胰岛素水平、甘油三酯水平、胆固醇水平或葡萄糖水平的药物中的应用。
[0092]
本发明的第八方面，提供一种代谢疾病的治疗方法，所述治疗方法包括向受试者施用本发明所述的融合蛋白、同源二聚体融合蛋白、或药物组合物。
[0093]
进一步，所述代谢疾病具有本发明所述的含义。
[0094]
与现有技术相比，本发明具有以下进步：
[0095]
本发明构建了一种长效glp-1/gdf15双靶点融合蛋白，通过突变改造，使融合蛋白整体具有显著提高的理化性质和稳定性。在本发明提供的glp-1-fc-gdf15融合蛋白中，glp-1和gdf15两个靶点分子具有更平衡的体内外生物学活性，更有利于双靶效应的发挥，具有两个靶点减重和其他改善代谢异常效果的叠加或协同效应。
附图说明
[0096]
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
[0097]
图1：fc-gdf15融合蛋白的示意图；
[0098]
图2：本发明提供的glp-1-fc-gdf15融合蛋白的示意图；
[0099]
图3：glp-1-fc-gdf15融合蛋白重复给药14天对高脂喂养ob/ob小鼠体重的影响；
[0100]
图4：glp-1-fc-gdf15融合蛋白重复给药14天对高脂喂养ob/ob小鼠食物摄入量的影响；
[0101]
图5：glp-1-fc-gdf15融合蛋白重复给药28天对ob/ob小鼠体重的影响；
[0102]
图6：glp-1-fc-gdf15融合蛋白重复给药28天对ob/ob小鼠食物摄入量的影响；
[0103]
图7：glp-1-fc-gdf15融合蛋白重复给药对dio小鼠体重的影响；
[0104]
图8：glp-1-fc-gdf15融合蛋白重复给药对dio小鼠食物摄入量的影响。
具体实施方式
[0105]
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0106]
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常
理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0107]
本文中，术语“天然”、“野生型”或“wt”指不包含任何遗传工程突变的、天然存在或可从环境分离的蛋白质或多肽。
[0108]
本文中，术语“基本生物活性”，指多肽经突变后，仍能够保留突变前的生物活性的至少一部分(例如不小于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或全部。
[0109]
本文中，氨基酸“取代”或“突变”指将多肽中一个氨基酸用另一种氨基酸替换。
[0110]
本文中，氨基酸的取代由第一个字母后跟数字后跟第二个字母来表示。第一个字母表示野生型蛋白质中的氨基酸；数字是指其中被置换的氨基酸位置；第二个字母表示用于替代野生型氨基酸的氨基酸。
[0111]
本文中，蛋白质或多肽的氨基末端的缺失由δn后跟数字来表示，其中数字表示氨基末端缺失的氨基酸的数目。
[0112]
胰高血糖素样肽1受体(glucagon like peptide 1receptor，glp 1r)是由463个氨基酸组成的b类蛋白偶联受体(g protein coupled receptors，gpcrs)。glp 1r受到内源性glp 1多肽包括glp 1(1 37)、glp 1(7
–
37)、glp 1(1 36)和glp 1(7 36)和外源性多肽exendin 4的调节。在本发明的融合蛋白中，在一些实施方式中，所述glp-1多肽可以选自glp 1(1 37)(其氨基酸序列为seq id no：1)、glp 1(7
–
37)(其氨基酸序列为seq id no：2)、glp 1(1 36)(其氨基酸序列为seq id no：3)和glp 1(7 36)(seq id no：4)；或者，在另一些实施方式中，所述融合蛋白中，所述glp-1多肽可以具有下组突变a8g、g22e、i29v、a30e、a30q、r36g中的一种或不同位置的任两个以上的组合(突变点的位置遵循glp-1(1-37)中的编号)，例如具有突变的glp-1可以为glp 1(7
–
37,a8g,g22e,r36g)(其氨基酸序列为seq id no：5)、glp 1(7
–
37,a8g,g22e,a30e,r36g)(其氨基酸序列为seq id no：6)、glp 1(7
–
37,a8g,g22e,a30q,r36g)(其氨基酸序列为seq id no：7)、glp 1(7
–
37,a8g,g22e,i29v,a30q,r36g)(其氨基酸序列为seq id no：8)。
[0113]
本文中，“生长分化因子15”，“gdf15”或“gdf15活性结构域”在有些实施例中是天然的成熟人gdf15或其结构域，在某些实施例中指的是gdf15或其结构域的突变体。成熟gdf15由总共308个氨基酸(uniprot q99988)中除信号肽和前肽外的第197位(a)至第308位(i)氨基酸组成(gdf15(197-308)(seq id no:46))，或与所述氨基酸序列在维持gdf15的独特活性和结构的范围内具有至少85％、90％、95％、99％的序列同一性的多肽。所述的突变体包含截短的，和/或者一个、多个氨基酸突变。在有些实施例中，截短的gdf15可以是n端缺失变体，比如n末端处截短1-14个氨基酸的序列，或与截短氨基酸序列至少85％、90％、95％、99％的序列同一性的多肽；在有些实施例中，所述的gdf15变体，是指相比于成熟gdf15或截短的gdf15存在至少1个氨基酸位点的置换、插入或缺失，只要其保持gdf15蛋白的生物活性中的至少一者，如其对食物摄取量、血糖水平、胰岛素抗性和体重等的影响，都在本发明保护范围内。
[0114]
所述的gdf15变体，也可通过在gdf15多肽的特定位置上引入一个或多个保守或非保守氨基酸取代和使用天然存在或非天然存在的氨基酸或者通过缺失特定残基或残基的区段而产生。
[0115]“保守氨基酸取代”可涉及天然氨基酸残基(即，在野生型gdf15多肽序列的给定位置上发现的残基)被非天然残基(即，不是在野生型gdf15多肽序列的给定位置上发现的残基)取代，以使对所述位置处的氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响。保守氨基酸取代还涵盖通常通过化学肽合成而不是通过在生物系统中的合成并入的非天然存在的氨基酸残基(如本文所定义)。这些包括肽模拟物以及氨基酸部分的其它反向或倒转形式。
[0116]
天然存在的残基可基于共同侧链特性分成以下种类：
[0117]
(1)疏水性：met、ala、val、leu、ile；
[0118]
(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；
[0119]
(3)酸性：asp、glu；
[0120]
(4)碱性：his、lys、arg；
[0121]
(5)影响链取向的残基：gly、pro；以及
[0122]
(6)芳族：trp、tyr、phe。
[0123]
某些保守氨基酸取代的示例见下表：
[0124]
[0125][0126]
保守取代可涉及这些种类之一的成员与相同种类的另一成员的交换。非保守取代可涉及这些种类之一的成员与另一种类的成员的交换。
[0127]
本文中，“同一性”或“同源性”，通常是指两个肽或蛋白质之间或两个核酸分子之间的序列相似性。“同一性”或“同源性”百分比，指所比较的分子中的氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且基于正在比较的分子中最小分子的大小来计算。
[0128]
本发明中的fc变体与天然的成熟人gdf15或其变体所形成的融合蛋白，均可以达到本发明的目的。
[0129]
本文中，“fc”或“fc区”用于定义抗体重链中至少含有恒定区的一部分的c端区域。fc区可以是天然序列fc区或变体fc区。本领域技术人员知晓，fc区一般包含两个恒定结构域：ch2和ch3，而fc区的边界可以变化。在本文中，fc区的c末端即为抗体重链的c末端；而fc区的n末端可以变化，在一些实施方式中，fc区的n末端可以从例如第218位(eu编号)开始，或第231位(eu编号)开始，或第233位(eu编号)开始，或第236位(eu编号)开始，或从第237位(eu编号)开始；在另一些实施方式中，本发明的fc区的n末端不包含铰链区；在又一些实施方式中，本发明的fc区的n末端包含铰链区。本文中，fc区中氨基酸残基的编号方式依照eu编号系统，也称为eu索引，如记载于edelman et al.,the covalent structure of an entireγgimmunoglobulin molecule.proc.natl.acad.sci.,usa,1969。
[0130]
本发明提供的融合蛋白中，可采用天然的免疫球蛋白fc区或者免疫球蛋白fc区变体，在优选的方案中，采用fc区变体。gdf15需要形成二聚体以行使活性，在本发明研究过程中发现，尽管igg fc能够自然形成二聚体，然而igg fc二聚体中两个单体fc的羧基端的空间距离与gdf15单体氨基端的空间距离存在明显差异；即使使用柔性或刚性的肽接头，经过igg fc的c末端与gdf15的n末端形成的融合蛋白在组装时仍然存在不稳定性，表达产量低等问题。本发明提供的fc区变体，显著改善了fc-gdf15分子的稳定性，实现fc-gdf15融合蛋白的高效组装，提高了融合蛋白的表达产量，制备工艺简单，且不破坏同源二聚体的形成。在本发明优选的实施例中，基于fc区变体得到glp-1-fc-gdf15融合蛋白，使该融合蛋白相对于采用天然fc区的融合蛋白具有显著提高的理化性质和稳定性，并且其中的两个靶点分
子具有更好的活性和药代动力学特征的平衡性，更有利于双靶效应的发挥。
[0131]
本文中，“二聚体”指蛋白二聚体，其由两个蛋白质(多肽)分子组合而成，是一种蛋白质的四级结构。组成二聚体的两个蛋白质(多肽)分子可称为该二聚体的单体分子或单体蛋白质。二聚体可包括“同源二聚体”和“异源二聚体”两种情况，其中，同源二聚体由两个相同的单体分子组合而成；异源二聚体由两种不同的单体分子组合而成。通常认为，同源二聚体相对于异源二聚体，具有更简单的制备方法，因为只需合成一种肽。在本发明中，当采用本发明提供的fc区变体时，其具有形成同源二聚体的能力；本发明提供的fc区变体与gdf15活性结构域的融合蛋白也具有形成同源二聚体的能力，参照图1，在由fc-gdf15分子形成的同源二聚体中，两个单体fc区变体之间、两个单体gdf15活性结构域之间分别都存在着同源二聚作用。在此基础上，本发明提供的包含glp-1、fc区变体和gdf15的融合蛋白也能够形成同源二聚体，参照图2。
[0132]
本文中，“连接肽”或“肽接头”指将两个蛋白质连接在一起的单个氨基酸或者多肽序列。肽接头的长度可以为例如约1-40个氨基酸，包含例如重复的丙氨酸，甘氨酸和丝氨酸。常见的肽接头包括柔性肽接头，例如甘氨酸和丝氨酸的组合，如(ggggs)n，通过肽接头中重复单元的数量可以调节其连接的蛋白之间的距离；仅由甘氨酸组成的肽接头，例如gn，常见的包括g6、g8等；刚性肽接头，例如具有(eaaak)n序列的α-螺旋形肽接头；具有富含脯氨酸的肽接头(xp)n，其中x可以指定任何氨基酸，常见的包括丙氨酸、赖氨酸或谷氨酸，(xp)n序列没有螺旋结构，肽接头中存在的脯氨酸可以增加骨架硬度，并且有效分离结构域。富含脯氨酸序列的结构在机体中广泛的存在，例如骨骼肌蛋白的n端就存在(ap)7的结构。肽接头的选择本领域技术人员可根据通常的实验进行确定，例如仅使用柔性肽接头、仅使用刚性肽接头、使用柔性肽接头与刚性肽接头的组合等。
[0133]
本文中，“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子，包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达，此类载体在本文中称为“表达载体”。
[0134]
本文中，“宿主细胞”指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的融合蛋白的任意类型的细胞系统。宿主细胞包括哺乳动物培养细胞如cho细胞、bhk细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、yo骨髓瘤细胞、p3x63小鼠骨髓瘤细胞、per细胞、per.c6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、细菌细胞如大肠杆菌，昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
[0135]
本文中，“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受药物组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
[0136]
本文中，“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量，期望的治疗或预防结果包括例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良作用。
[0137]
本文中，“药学上可接受的载体”指药物组合物中活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0138]
本文中，“治疗”指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或
在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、减缓疾病进展速率、改善或消除疾病状态、及消退或改善的预后。
[0139]
本文中，“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(例如人和非人灵长类如猴)或其他哺乳动物(例如牛、羊、猫、犬、马、兔和啮齿动物如小鼠和大鼠)。特别地，所述个体或受试者是人。
[0140]
在本文中，使用天然氨基酸的常规单字母或三字母代码：
[0141][0142]
实施例1 fc变体设计
[0143]
本实施例测试了引入不同突变对fc区结构性质的影响，部分突变体的测试结果如表5所示。试验步骤包括：
[0144]
采用分子克隆方法将fc核酸分子序列插入到哺乳动物细胞表达载体中，采用expicho fectamine
tm cho transfection kit(thermofisher scientific)，在cho-s细胞中进行瞬时转染表达；经过protein a层析柱纯化后，获得目标蛋白，采用尺寸排阻高效液相色谱(sec)对目标蛋白进行分析。sec分析的主要原理是基于待分析物(如蛋白质)的分子量大小和三维结构，一般分子量大的分析物会更加快速地通过色谱柱，因此具有较短的色谱柱保留时间，反之，分子量更小的分析物则具有更长的保留时间，因此sec可用来分析蛋白分子的聚体情况。
[0145]
天然免疫球蛋白fc片段会自然形成同源二聚体结构，而为了提高融合蛋白稳定性，需要对fc进行突变，但突变后可能会破坏fc同源二聚体的结构。而发明人惊奇地发现，在第439位(eu编号)引入突变后的fc分子(k439d或k439e)与未引入突变的fc分子在sec分析中保留时间一致，表明该引入的突变不会破坏fc二聚体形成。作为对照，根据此前专利文献wo2019195091报道的一种破坏fc二聚体形成的突变分子(f405q，y407e)，本实施例还测试了氨基酸序列为seq id no：82的fc分子，发现其具有明显延长的保留时间，表明该fc分子以单体形式存在。
[0146]
表5 fc区变体二聚体形成特性
[0147]
序列fc变体保留时间聚体状态
seq id no：11igg4 fc(aa)13.341min二聚体seq id no：15igg4 fc(aa,k439e)13.156min二聚体seq id no：19igg4 fc(aa,k439d)13.093min二聚体seq id no：82igg4 fc(aa,f405q/y407e)15.076min单体
[0148]
实施例2fc-gdf15构建体的制备
[0149]
构建表达载体：将表6所示的fc-gdf15融合蛋白的编码基因序列分别插入至哺乳动物细胞载体pxc17.4的多克隆酶切位点，构建得到分别表达表6所示的fc-gdf15的表达载体；采用去内毒素的质粒提取试剂盒(omega)提取fc-gdf15的表达载体，用于细胞转染。
[0150]
表6 fc-gdf15融合蛋白
[0151]
[0152]
[0153][0154]
细胞转染与培养：将cho-s细胞复苏后传代培养，至密度约为6
×
106细胞/ml时收集细胞，进行细胞转染。细胞转染采用expicho fectamine
tm cho transfection kit(thermofisher scientific)，其中fc-gdf15的表达载体的终浓度为1μg/ml。转染约20h后加入expicho fectamine cho enhancer以及expicho feed维持转染细胞的生长。待细胞活率降至约80％时收获细胞培养液。
[0155]
蛋白纯化：将细胞培养液离心后收集上层清液，并用0.22μm滤膜过滤以获得细胞培养液上清。采用两步层析法对所述细胞培养液上清进行纯化：第一层析：将细胞培养液上清应用至经磷酸缓冲盐溶液(pbs)平衡的at protein adiamond层析柱(博格隆公司)，待目标蛋白结合后，用平衡液冲洗3cv(柱体积，column volume)以上，以除去未结合杂质，用100mm乙酸-乙酸钠(ph3.0)缓冲液洗脱并收集目标蛋白，然后迅速用1.0m tris-hcl ph 8.0溶液调节洗脱收集样品ph至7.2-7.6，对已调节ph样品用纯化水进行稀释至其电导值低于5ms/cm，得到第一样品；第二步层析：使用bestarose q hp层析柱对经第一层层析获得的第一样品进一步精纯，用20mm tris-hcl缓冲液平衡层析柱，将第一样品上样，20mm tris-hcl缓冲液冲洗3cv，20mm pb缓冲液冲洗3cv以上以置换缓冲体系，最终用pbs洗脱并收集洗脱组分，获得目标蛋白样品。目标蛋白样品的性质和纯度通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和质谱分析进行评价。目标蛋白样品通过微量核酸蛋白测定仪(nanodrop 2000/2000c spectrophotometer)进行定量。
[0156]
实施例3 fc变体对fc-gdf15融合蛋白表达量的影响
[0157]
采用实施例2中描述的方法表达得到了表6所记载的fc-gdf15融合蛋白，比较应用不同fc变体对fc-gdf15融合蛋白表达产量的影响。测试的结果在表7中示出。
[0158]
根据测试结果，发现未对fc的k439(eu编号)或e356(eu编号)进行突变的fc-gdf15融合蛋白，如m1(单体具有seq id no：83序列的同源二聚体)、m14(单体具有seq id no：96序列的同源二聚体)表达量较低，而对fc k439和/或e356进行突变的fc-gdf15融合蛋白，如m2(单体具有seq id no：84序列的同源二聚体)、m3(单体具有seq id no：85序列的同源二聚体)、m4(单体具有seq id no：86序列的同源二聚体)、m5(单体具有seq id no：87序列的同源二聚体)、m6(单体具有seq id no：88序列的同源二聚体)、m7(单体具有seq id no：89序列的同源二聚体)、m8(单体具有seq id no：90序列的同源二聚体)、m9(单体具有seq id no：91序列的同源二聚体)、m10(单体具有seq id no：92序列的同源二聚体)、m11(单体具有seq id no：93序列的同源二聚体)、m15(单体具有seq idno：97序列的同源二聚体)、m39(单体具有seq id no：120序列的同源二聚体)，具有提高的融合蛋白表达产量，表明在fc第356位(eu编号)或第439位(eu编号)氨基酸进行的突变更有利于fc-gdf15融合蛋白的组装表达。
[0159]
表7包含不同fc变体的fc-gdf15分子表达产量
[0160][0161][0162]
实施例4 fc-gdf15融合蛋白的理化性质
[0163]
蛋白分子的理化性质比如聚集和降解倾向会影响分子的成药性，因此理想的药物分子需要具有稳定单一的组分，即有更少的聚集和降解发生。
[0164]
为了测试fc-gdf15融合蛋白的理化性质，采用实施例2中描述的方法表达纯化出fc-gdf15融合蛋白，然后利用尺寸排阻色谱高效液相色谱(sec)对融合蛋白进行分析。具体地，sec分析采用waters xbridge beh 200a，3.5μm(7.8
×
300mm)色谱柱，流动相为(150mm磷酸盐缓冲液：乙腈＝9:1，ph 6.5)，流速为0.5ml/min。检测结果中，高分子量(hmw)组分占比代表聚集的比例，低分子量(lmw)代表降解的比例。检测结果如表8所示。
[0165]
表8不同fc-gdf15融合蛋白理化性质比较
[0166]
[0167][0168]
表8结果表明，未对fc的k439(eu编号)或e356(eu编号)进行突变的fc-gdf15融合蛋白，如m1和m14分别具有50.2％和67.6％的高分子(hmw)聚集；而对fc k439(eu编号)和/或e356(eu编号)进行突变的fc-gdf15融合蛋白，均具有显著降低的高分子聚集比例，并且绝大部分融合蛋白具有低于5％的高分子聚集，说明fc k439(eu编号)或e356(eu编号)的突变能带来更好的fc-gdf15融合蛋白成药性。
[0169]
实施例5glp-1-fc-gdf15构建体的制备
[0170]
通过在fc-gdf15的n端融合glp-1序列从而构建得到glp-1-fc-gdf15融合蛋白，在本实施例中，按照以下步骤制备得到表4所示的glp-1-fc-gdf15融合蛋白。
[0171]
构建表达载体：将表4所示的glp-1-fc-gdf15融合蛋白的编码基因序列分别插入至哺乳动物细胞载体pxc17.4的多克隆酶切位点，构建得到分别表达表4所示的glp-1-fc-gdf15的表达载体；采用去内毒素的质粒提取试剂盒(omega)提取glp-1-fc-gdf15的表达载体，用于细胞转染。
[0172]
细胞转染与培养：将cho-s细胞复苏后传代培养，至密度约为6
×
106细胞/ml时收集细胞，进行细胞转染。细胞转染采用expicho fectamine
tm cho transfection kit(thermofisher scientific)，其中glp-1-fc-gdf15的表达载体的终浓度为1μg/ml。转染约20h后加入expicho fectamine cho enhancer以及expicho feed维持转染细胞的生长。待细胞活率降至约80％时收获细胞培养液。
[0173]
蛋白纯化：将细胞培养液离心后收集上层清液，并用0.22μm滤膜过滤以获得细胞培养液上清。采用两步层析法对所述细胞培养液上清进行纯化：第一层析：将细胞培养液上清应用至经磷酸缓冲盐溶液(pbs)平衡的at protein adiamond层析柱(博格隆公司)，待目标蛋白结合后，用平衡液冲洗3cv(柱体积，column volume)以上，以除去未结合杂质，用100mm乙酸-乙酸钠(ph3.0)缓冲液洗脱并收集目标蛋白，然后迅速用1.0m tris-hcl ph 8.0溶液调节洗脱收集样品ph至7.2-7.6，对已调节ph样品用纯化水进行稀释至其电导值低于5ms/cm，得到第一样品；第二步层析：使用bestarose q hp层析柱对经第一层层析获得的第一样品进一步精纯，用20mm tris-hcl缓冲液平衡层析柱，将第一样品上样，20mm tris-hcl缓冲液冲洗3cv，20mm pb缓冲液冲洗3cv以上以置换缓冲体系，最终用pbs洗脱并收集洗脱组分，获得目标蛋白样品。目标蛋白样品的性质和纯度通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和质谱分析进行评价。目标蛋白样品通过微量核酸蛋白测定仪(nanodrop 2000/2000c spectrophotometer)进行定量。
[0174]
实施例6 glp-1-fc-gdf15融合蛋白的理化性质
[0175]
为了测试glp-1-fc-gdf15融合蛋白的理化性质，采用实施例5中描述的方法表达纯化出glp-1-fc-gdf15融合蛋白，然后利用尺寸排阻色谱高效液相色谱(sec)对融合蛋白进行分析。具体地，sec分析采用waters xbridge beh200a，3.5μm(7.8
×
300mm)色谱柱，流动相为(150mm磷酸盐缓冲液：乙腈＝9:1，ph 6.5)，流速为0.5ml/min。检测结果中，高分子量(hmw)组分占比代表聚集的比例，低分子量(lmw)代表降解的比例。检测结果如表9所示。
[0176]
表9不同glp-1-fc-gdf15融合蛋白理化性质比较
[0177]
构建体hmw(％)lmw(％)d80.61.4d90.82.1d110.90.3d130.51.0d143.41.3
[0178]
结果表明，双靶融合蛋白的聚集和降解比例总和小于5％，说明双靶蛋白具有较好的理化性质。
[0179]
实施例7 glp-1-fc-gdf15融合蛋白的体外活性
[0180]
glp-1通过激活其受体glp-1r发挥功能，glp-1与受体结合后会激活细胞内下游信号通路，并产生camp，因此可通过检测细胞内camp水平来评价glp-1-fc-gdf15融合蛋白的体外glp-1活性；gdf15在体内发挥功能需要通过其特异性受体gfral和辅助受体ret进行信号转导。gdf15与细胞表面受体结合后能激活下游信号通路，其中一条通路为erk1/2磷酸化。因此可通过检测细胞内erk1/2磷酸化水平来评价glp-1-fc-gdf15融合蛋白的体外活性。
[0181]
通过基因工程方法分别构建了高表达glp-1r的hek293细胞株以及高表达gfral和ret的hek293t细胞株。然后分别用camp gs hirange试剂盒(cisbio)和advanced phospho-erk1/2(thr202/tyr204)试剂盒(cisbio)来评价glp-1-fc-gdf15融合蛋白所具有的glp-1体外活性与gdf15体外活性。按照试剂盒手册进行测定得到体外活性的ec
50
值。
[0182]
表10 glp-1-fc-gdf15融合蛋白的体外活性
[0183][0184][0185]
结果表明，本发明提供的glp-1-fc-gdf15融合蛋白同时保留了较高的glp-1和gdf15的体外活性。
[0186]
实施例8重复施与glp-1-fc-gdf15融合蛋白在高脂喂养ob/ob(hfd-ob/ob)小鼠体内药效
[0187]
本实施例测试了glp-1-fc-gdf15融合蛋白重复给药在hfd-ob/ob小鼠中对食欲抑制和降低体重的效果。ob/ob小鼠经过高脂饮食诱导两周后，根据体重进行随机分组，随后分别皮下给予溶媒、glp-1-fc-gdf15融合蛋白d8和d9(1nmol/kg，初次给药7天后每周两次给药)、glp-1-fc融合蛋白(度拉糖肽，1nmol/kg，初次给药7天后每周两次给药)或fc-gdf15融合蛋白(m39)(1nmol/kg，每周给药一次)，并持续监测小鼠体重和食物摄入量变化。初次给药第14天后，小鼠体重和食物摄入量结果如表11、图3和图4所示。
[0188]
表11glp-1-fc-gdf15融合蛋白治疗对hfd-ob/ob小鼠体重和摄食量影响
[0189][0190]
注：数值代表每组9-10只动物数据的平均值
±
sem；
***-p《0.001，相对于溶媒；
###-p《0.001，相对于度拉糖肽；统计分析方法：one-way anova with turkey’s correction。
[0191]
结果表明，glp-1/gdf15双靶点分子d8和d9能够显著减少肥胖小鼠模型食物摄入，更重要的是，相比于glp-1单靶点药物度拉糖肽和gdf15单靶分子m39，双靶分子d8和d9具有
更加强效的降体重效果，说明本发明设计的glp-1-fc-gdf15融合蛋白能发挥两个靶点减重效果的叠加或协同效应。
[0192]
实施例9重复施与glp-1-fc-gdf15融合蛋白在ob/ob小鼠模型中的药效
[0193]
本实施例测试了glp-1-fc-gdf15融合蛋白重复给药在ob/ob小鼠中对减少食物摄入、降低体重、改善血液生化指标和改善肝功能及肝病理的效果。ob/ob小鼠经过适应新饲养后，根据体重进行随机分组，随后分别皮下给予溶媒、glp-1-fc-gdf15融合蛋白d13和d14(0.3nmol/kg和1nmol/kg两个剂量组)、glp-1-fc融合蛋白(度拉糖肽，3nmol/kg)或fc-gdf15融合蛋白(m39)(0.3nmol/kg和3nmol/kg两个剂量组)，初次给药7天后每周给药两次，总治疗时间为四周，持续监测小鼠体重和食物摄入量变化，并在第28天进行解剖检测肝病理指标，解剖前采血进行血清脂质以及各项生化指标检测。体重和摄食量结果分别显示于图5和图6、表12中，糖化血红蛋白(hba1c)、谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)以及肝病理(肝脂肪变性)改善结果分别显示于表13、表14中。
[0194]
表12 glp-1-fc-gdf15融合蛋白治疗对ob/ob小鼠体重和摄食量影响
[0195][0196]
注：体重变化数值代表每组8只动物数据的平均值
±
sem；
***-p《0.001，相对于溶媒；
###-p《0.001，相对于度拉糖肽；
&-p《0.05，相对于m39(3nmol/kg)；统计分析方法：one-way anova with turkey’s correction。
[0197]
表13 glp-1-fc-gdf15融合蛋白治疗降低ob/ob小鼠糖化血红蛋白水平
[0198]
[0199][0200]
注：数值代表每组8只动物数据的平均值
±
sem；
***-p《0.001，相对于溶媒；
###-p《0.001，相对于度拉糖肽；统计分析方法：one-way anova with turkey’s correction。
[0201]
表14glp-1-fc-gdf15融合蛋白治疗改善ob/ob小鼠肝功能和肝脂肪变性
[0202]
组别alt(u/l)ast(u/l)steatosis score溶媒281.2
±
25.2337.6
±
31.03.00
±
0.00度拉糖肽3nmol/kg139.0
±
16.2
*
219.9
±
16.6
***
3.00
±
0.00
***
m39 0.3nmol/kg86.3
±
8.7
***
164.0
±
10.5
***
0.88
±
0.08
***###
m39 3nmol/kg53.8
±
2.8
***
141.8
±
4.1
***#
0.56
±
0.15
***###
d13 0.3nmol/kg55.8
±
1.8
***
140.9
±
17.3
***#
0.25
±
0.09
***###
d13 1nmol/kg66.1
±
4.0
***
174.0
±
16.5
***
0.19
±
0.09
***###
d14 0.3nmol/kg58.0
±
3.2
***
143.4
±
6.1
***#
0.19
±
0.09
***###
d14 1nmol/kg54.4
±
3.5
***
136.5
±
9.5
***#
0.19
±
0.13
***###
[0203]
注：数值代表每组8只动物数据的平均值
±
sem；
*-p《0.05,
***-p《0.001，相对于溶媒；
#-p《0.05,
###-p《0.001，相对于度拉糖肽；统计分析方法：one-way anova with turkey’s correction。
[0204]
结果表明，glp-1/gdf15双靶点融合蛋白d13和d14能够显著降低ob/ob肥胖小鼠模型的摄食量和体重，且同剂量下效果明显优于单靶点的glp-1药物度拉糖肽以及gdf15单靶分子m39。同时d14和d14还能显著改善小鼠血糖、肝功能指标以及肝脂肪变性，同剂量效果也是优于单靶点药物，进一步说明本发明涉及的双靶点融合蛋白能同时发挥两个靶点的药效作用。
[0205]
实施例10重复施与glp-1-fc-gdf15融合蛋白在饮食诱导肥胖(dio)小鼠模型中的药效
[0206]
本实施例测试了glp-1-fc-gdf15融合蛋白重复给药在dio小鼠中对食欲抑制、降低体重，以及改善各项代谢指标的效果。c57bl/6小鼠经过高脂饮食诱导四个月后，根据体重进行随机分组，随后分别皮下给予溶媒(pbs，一周两次)、glp-1-fc-gdf15融合蛋白d13(3nmol/kg，一周两次；10nmol/kg，一周一次)或司美格鲁肽(10nmol/kg，每天一次)，给药四周。同时进行正常小鼠平行对照。试验期间持续监测小鼠体重和食物摄入量变化，在初次给药后第28天时对小鼠进行解剖，分析了各项血清生化以及肝病理指标。
[0207]
小鼠体重和食物摄入量结果显示于图7、图8和表15中；血清低密度脂蛋白胆固醇
(ldl)、alt、ast和肝脂肪变性分数(steatosis score)参数显示于表16中。
[0208]
表15 glp-1-fc-gdf15融合蛋白治疗对dio小鼠体重和摄食量影响
[0209][0210]
注：数值代表每组7-8只动物数据的平均值
±
sem；
***-p《0.001，相对于溶媒；
###-p《0.001，相对于司美格鲁肽；统计分析方法：two-way anova with turkey’s correction。
[0211]
表16 glp-1-fc-gdf15融合蛋白治疗改善dio小鼠血生化指标和肝脂肪变性
[0212][0213]
注：数值代表每组7-8只动物数据的平均值
±
sem；
***-p《0.001，相对于溶媒；统计分析方法：one-way anova with turkey’s correction。
[0214]
结果表明，在dio肥胖小鼠模型中，双靶点融合蛋白d13能够显著降低小鼠体重和摄食量，且同剂量下效果显著优于司美格鲁肽。同时d13还能显著降低小鼠低密度脂蛋白胆固醇、肝功能指标，以及肝脂肪变性，说明双靶分子可潜在用于治疗肥胖、非酒精性脂肪性肝病、高血脂等代谢疾病。
[0215]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括第一多肽片段，其包括glp-1多肽；第二多肽片段，其包括免疫球蛋白fc区；第三多肽片段，其包括gdf15活性结构域；所述第一多肽片段、第二多肽片段和第三多肽片段沿氨基端至羧基端方向通过连接肽依次连接。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述glp-1多肽包含以下氨基酸序列之一：seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4；或者，所述glp-1多肽包含与下组序列之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4；或者，所述glp-1多肽相对于seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4具有不超过6、5、4、3、2、1个突变同时保留突变前多肽的基本生物活性。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述glp-1多肽包含下组突变中的一种或不同位置的两种以上的组合：a8g、g22e、i29v、a30e、a30q、r36g；优选地，所述glp-1多肽包含下组突变中的一种：a8g，g22e，r36g；或者a8g，g22e，a30e，r36g；或者a8g，g22e，a30q，r36g；或者a8g，g22e，i29v，a30q，r36g；优选地，所述具有突变的glp-1多肽包含下组之一的氨基酸序列，或者与下组之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq idno：5、seq id no：6、seq id no：7或seq id no：8。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白fc区选自igg1 fc、igg2、igg3 fc、igg4 fc中的一种；优选地，所述免疫球蛋白fc区选自igg1 fc、igg4 fc中的一种；优选地，所述免疫球蛋白fc区为人免疫球蛋白fc区。5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白fc区为天然的免疫球蛋白fc区，或者免疫球蛋白fc区变体。6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白fc区的氨基酸序列包括seq id no：9或seq id no：10；或者，所述免疫球蛋白fc区包含与下组序列之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：9、seq id no：10；或者，所述免疫球蛋白fc区相对于seq id no：9或seq id no：10具有不超过6、5、4、3、2、1个突变同时保留突变前多肽的基本生物活性。7.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白fc区变体包含以下突变：依照eu编号将igg fc的第356位的氨基酸取代为：除天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)和半胱氨酸(c)以外的氨基酸；优选地，所述fc变体依照eu编号将igg fc的第356位的氨基酸取代为：甘氨酸(g)、丝氨酸(s)、丙氨酸(a)、苏氨酸(t)、缬氨酸(v)、天冬酰胺(n)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、谷氨酰胺(q)、酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、组氨酸(h)、脯氨酸(p)、甲硫氨酸(m)、赖氨酸(k)、精氨酸(r)中的一种；更优选地，所述fc变体依照eu编号将igg fc的第356位的氨基酸取代为丙氨酸(a)、谷氨酰胺(q)、精氨酸(r)、天冬酰胺(n)中的一种。8.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白fc区变体包含以下突变：依照eu编号将igg fc的第439位的氨基酸取代为：除精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)和半胱氨酸(c)以外的氨基酸；
优选地，所述fc变体依照eu编号将igg fc的第439位的氨基酸取代为：甘氨酸(g)、丝氨酸(s)、丙氨酸(a)、苏氨酸(t)、缬氨酸(v)、天冬氨酸(d)、天冬酰胺(n)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、谷氨酸(e)、谷氨酰胺(q)、酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、脯氨酸(p)、甲硫氨酸(m)中的一种；更优选地，所述fc变体依照eu编号将igg fc的第439位的氨基酸取代为：丙氨酸(a)、天冬氨酸(d)、天冬酰胺(n)、谷氨酸(e)、谷氨酰胺(q)中的一种。9.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白fc区变体还包含以下突变：依照eu编号将igg fc的第234位和第235位的氨基酸分别取代为丙氨酸(a)，和/或将第447位的氨基酸删除。10.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白fc区变体包含下组之一的氨基酸序列，或者与下组之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：11-37。11.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述gdf15活性结构域包含选自下组之一的氨基酸序列：seq id no：38；或者，与seq id no：38具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列；或者，在seq id no：38的n末端有1-14个氨基酸截短，和/或在seq id no：38中具有不超过5、4、3、2、1个突变同时保留突变前多肽的基本生物活性。12.如权利要求11所述的融合蛋白，其特征在于，所述seq id no：38中的氨基酸突变的位置选自下组中的一个、两个、或三个：第5位、第6位、第21位、第26位、第30位、第47位、第54位、第55位、第57位、第67位、第69位、第81位、第94位、第107位；优选地，所述seq id no：38中的氨基酸突变选自下组中的一个、不同位置的任两个、或者不同位置的任三个：d5e、h6d、h6e、r21q、r21h、d26e、a30s、a47d、a54s、a55e、m57t、r67q、k69r、a81s、t94e、k107q。13.如权利要求11所述的融合蛋白，其特征在于，所述gdf15活性结构域包含下组之一的氨基酸序列，或者与下组之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：38-58。14.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽包含第一连接肽和第二连接肽；优选地，所述第一连接肽和第二连接肽各自独立地包含选自下组的氨基酸序列：seq id no：78-81；更优选地，所述第一连接肽的n端与所述的glp-1多肽的c端相连，所述第一连接肽的c端与所述免疫球蛋白fc区的n端相连；所述第二连接肽的n端与所述免疫球蛋白fc区的c端相连，所述第二连接肽的c端与所述gdf15活性结构域的n端相连。15.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含下组之一的氨基酸序列，或者与下组之一具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列：seq id no：59-77。16.一种同源二聚体融合蛋白，其由权利要求1-15任一项所述的融合蛋白所构成。17.一种生物材料，所述生物材料为以下(i)、(ii)、(iii)中的任一种：
(i)核酸，所述核酸包括编码权利要求1-15任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列；(ii)载体，所述载体包含(i)中的核酸；(iii)宿主细胞，所述宿主细胞含有(i)中的核酸和/或(ii)中的载体。18.权利要求1-15任一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括在适于表达所述融合蛋白的条件下培养权利要求17所述的宿主细胞，并且对所述宿主细胞表达得到的所述融合蛋白进行纯化。19.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-15任一项所述的融合蛋白和/或权利要求16所述的同源二聚体融合蛋白作为活性成分，所述融合蛋白和/或所述同源二聚体融合蛋白以治疗有效量存在于所述药物组合物中；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。20.权利要求1-15任一项所述的融合蛋白、权利要求16所述的同源二聚体融合蛋白、或权利要求19所述的药物组合物在以下(iv)、(v)任一方面的应用：(iv)制备治疗代谢疾病的药物；优选地，所述代谢疾病包括ii型糖尿病、肥胖症、血脂异常、糖尿病性肾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝病；(v)制备用于减少受试者的食物摄入、体重、胰岛素水平、甘油三酯水平、胆固醇水平或葡萄糖水平的药物。

技术总结
本发明涉及GLP-1和GDF15的融合蛋白及其用途，该融合蛋白包含由氨基端向羧基端方向依次连接的第一多肽片段、第二多肽片段和第三多肽片段；三个多肽片段依次包括GLP-1多肽、包括免疫球蛋白Fc区和GDF15活性结构域。本发明提供的融合蛋白具有GLP-1和GDF15双靶点活性，该融合蛋白整体具有优良的理化性质和稳定性，GLP-1和GDF15两个靶点分子具有良好的活性和药代动力学的平衡性，有利于双靶效应的发挥。有利于双靶效应的发挥。有利于双靶效应的发挥。


技术研发人员：燕江雨 肖琳 曾君南 龚庆伟 程晓莉 刘晓莹 李文佳
受保护的技术使用者：广东东阳光药业有限公司
技术研发日：2022.12.30
技术公布日：2023/7/26