一类KRAS抑制剂及其制备方法和用途与流程

一类kras抑制剂及其制备方法和用途
1.本技术要求于2022年1月24日提交中国专利局、申请号为202210077094.7，发明名称为“一类kras抑制剂及其制备方法和用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本技术中。
技术领域
2.本发明属于医药领域，涉及一种具有抑制kras活性的小分子化合物、其制备方法及含有该化合物的药物组合物，及其在医药方面的应用。


背景技术：

3.ras蛋白是由ras基因表达的产物，由189个氨基酸组成的单体球蛋自，其分子量为21kda。ras蛋白可以与鸟嘌呤三核苷酸磷酸(gtp)或鸟嘌呤核苷酸磷酸(gdp)结合，ras蛋白的活性状态对细胞的生长、分化、细胞骨架、蛋百质运输和分泌等都具有影响，其活性是通过与gtp或gdp的结合进行调节：当ras蛋白与gdp结合时，它处于“失活”状态；当有上游特定的细胞生长因子刺激时，ras蛋白被诱导将其结合的gdp转换为gtp，此时称为“活化”状态，能够活化下游的蛋白进行信号传递。ras蛋白自身具有弱的水解gtp活性，能够水解gtp到gdp从而实现从活化状态到失活状态的转化。在这个水解过程中，还需要gap(gtp水解酶活化蛋白)参与。它能与ras蛋白作用，大大促进其水解gtp到gdp的能力，ras蛋白的突变将影响其与gap的作用，也就影响了其水解gtp到gdp的能力，使其一直处于活化状态，活化的ras蛋白持续的给予下游蛋白生长信号，最终导致细胞不停的生长和分化，进而产生肿瘤。
4.ras基因的三种主要亚型(hras、nras或kras)中的任意一个突变可导致人肿瘤的发生，在ras基因中突变频率最高的为kras基因，在25-30％肿瘤中能检测到kras突变。与之相比较，hras及nras家族成员中发生致癌性突变的比率低得多(分别为3％及8％)。最常见的kras突变发生于p环中的残基g12、g13以及残基q61上，其中g12突变占到83％。g12c突变是kras基因突变中比较常见的一个亚型，它是指12号甘氨酸突变为半胱氨酸。g12c突变在肺癌中最为常见，因此开发选择性抑制kras突变的抑制剂是一个较好的方向。为了提高对kras突变抑制活性的同时降低对野生型kras抑制的活性，开发活性更高，选择性更好，毒性更低的新型kras突变体选择性抑制剂具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明一方面提供一种通式(ⅱ)所示的化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、及其混合物形式、及其可药用盐、多晶型物、溶剂合物、前药、代谢物、同位素衍生物，
6.7.其中r0为氢或-f；
8.a为
9.x为-o-或-ch
2-；
10.y1和y2分别独立地为-f或-cl；
11.r1为
12.r2为-nrarb、-ch2nrarb或-(ch2)2nrarb；
13.r3为
14.r4为
15.r5为卤素或-c
1-3
烷基；r5优选-cl或-ch3；
16.r6为-c
1-3
烷基；
17.ra和rb分别独立地为氢、-c
1-3
烷基、-c
3-6
环烷基；
18.或是ra和rb连同它们所连接的氮原子一起形成未被取代或被1-3个取代基取代的5-11元杂环烷基，所述的取代基为-c
1-3
烷基、卤素或烷氧基。
19.在本发明的一些实施方式中，的当x为-o-时，ra为氢或-c
1-3
烷基；rb为-c
3-6
环烷基；
20.当x为-ch
2-时，r2为在本发明的一些实施方式中，根据本发明的化合物或其药学可接受的盐，包括下列的化合物：
[0021][0022]
本发明另一方面提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本发明所述的化合
物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、及其混合物形式、及其可药用盐，以及任选一种或多种医药上可接受的载体和/或稀释剂。
[0023]
本发明又一方面提供了本发明的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、及其混合物形式、及其可药用盐，或者本发明的药物组合物在制备用于预防和/或治疗kras介导的相关疾病的药物中的用途。
[0024]
在本发明的一些实施方式中，所述kras介导的相关疾病包括血液癌和实体瘤。
具体实施方式
[0025]
术语和说明
[0026]
在本文中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
[0027]
本发明中，术语“可药用盐”和“药用可接受的盐”具有相同的含义。
[0028]
本发明中，术语“医药上可接受的”、“可药用”、“药用可接受的”具有相同的含义。
[0029]
本发明中，药用可接受的盐包括药学上可接受的酸加成盐。
[0030]“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、丁酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、苹果酸盐、月桂酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。
[0031]
本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述至少一个化合物以及任选一种或多种医药上可接受的载体和/或稀释剂。
[0032]
本发明所提供的药物组合物可以制备为任何形式，例如颗粒、粉末、片剂、包衣片剂、胶囊、药丸、糖浆、滴剂、溶液、混悬剂和乳剂，或者活性成分的缓释制剂，其中胶囊剂的实例包括硬或软明胶胶囊剂，颗粒剂和粉剂可以是非泡腾或泡腾形式。
[0033]
本发明的药物组合物可进一步包括一种或多种医药或生理上可接受的载体，这些载体将适当配制以便于给药。例如，医药或生理上可接受的载体可以是盐水、热压水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖、麦芽糖糊精、甘油、乙醇及其混合物。本发明的药物组成物还可以包括医药或生理上可接受的添加剂，例如稀释剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、崩解剂、甜味剂、矫味剂、湿润剂、分散剂、表面活性剂、溶剂、涂层剂、发泡剂、或芳香剂。
[0034]
可以使用的稀释剂的实例包括但不限于乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露糖醇和磷酸二钙；润滑剂的实例包括但不限于滑石、淀粉、镁或钙的硬脂酸盐、石松子和硬脂酸；粘合剂的实例包括但不限于微晶纤维素、黄蓍胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶溶液、蔗糖和淀粉糊；助流剂的实例包括但不限于胶体二氧化硅；崩解剂的实例包括但不限于交联羧甲基纤维素钠、淀粉羟乙酸钠、藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素；甜味剂的实例包括但不限于蔗糖、乳糖、甘露糖醇和人工甜味剂，例如环磺酸钠
和糖精，和任意数量的喷雾干燥矫味剂；矫味剂的实例包括但不限于从植物提取的天然矫味剂，例如果实，和味道较好的化合物，例如但不限于薄荷和水杨酸甲酯；湿润剂的实例包括但不限于丙二醇一硬脂酸酯、脱水山梨醇一油酸酯、二甘醇一月桂酸酯和聚氧乙烯月桂基醚。
[0035]
本发明的药物组合物可以根据传统方法来通过各种途径给药，包括口服、静脉内、动脉内、腹腔内、胸腔内、透皮、鼻腔、吸入、直肠、眼部和皮下导入。
[0036]
任选地添加到本发明的药物组合物中的医药上可接受的载体是：水、醇、蜂蜜、甘露醇、山梨醇、糊精、乳糖、焦糖、明胶、硫酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、高岭土、甘油、吐温、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、环糊精及其衍生物、磷脂类、磷酸盐类、淀粉类及其衍生物、硅衍生物、纤维素类及其衍生物、吡咯烷酮类、聚乙二醇类、丙烯酸树脂类、酞酸酯类、丙烯酸共聚物、苯三酸酯类中的一种或几种。
[0037]
经药理实验验证，本发明所提供的化合物或者药物组合物可通过kras治疗相关肿瘤，所述肿瘤选自血液癌及实体瘤。
[0038]
本发明所提供的化合物一般的剂量范围为约每天0.05mg/kg至1000mg/kg，优选为约1mg/kg至100mg/kg，更优选为约1至50mg/kg，药物组合物的剂量范围为以其含有的上述化合物的量来计算。
[0039]
实施例
[0040]
实施例1化合物1a-12的制备
[0041][0042]
第一步1a-3
[0043]
取一个单口瓶，依次加入化合物1a-1(2.94g，9.7mmol)，1a-2(2.2g，9.7mmol)，mecn(20ml)，n,n-二异丙基乙胺diea(3.87g，30mmol)。体系在80℃反应8h。蒸干，用石油醚
和乙酸乙酯打浆，得到标题化合物1a-3(粗品5.91g，偏黄色固体)，直接用作下一步。
[0044]
第二步1a-4
[0045]
取一个单口瓶，依次加入化合物1a-3(5.91g，9.7mmol)，乙烯基硼酸频哪醇酯(5.96g，38.8mmol)，pd(dppf)cl2(709mg，0.97mmol),k2co3(3.32g，24mmol)，1,4-二氧六环/h2o(4:1,30ml)，体系在90℃反应20h。加水，二氯甲烷(dcm)萃取，干燥，过滤，sio2(dcm/meoh＝20:1)纯化得到标题化合物1a-4(4.0g，86％油状物)，直接用作下一步。
[0046]
第三步1a-6
[0047]
取一个单口瓶，依次加入化合物1a-4(6.0g，12.6mmol)，1a-5(3.36g,18.9mmol)，乙醇etoh(20ml)，乙酸acoh(1ml)，体系在80℃反应3h。加水，用nahco3调节中性，dcm萃取，过滤，浓缩，sio2(dcm/meoh＝20:1)纯化得到标题化合物1a-6(11g)，黄色固体。
[0048]
第四步1a-7
[0049]
取一个单口瓶，依次加入化合物1a-6(7.0g，11.3mmol)，钯碳pd/c(3.0g，10％wt)，异丙醇(100ml)，体系在80℃反应16h。过滤，浓缩，得到标题化合物1a-7(3.5g)，直接用作下一步。
[0050]
第五步1a-9
[0051]
取一个单口瓶，依次加入化合物1a-7(1.0g，1.9mmol)，化合物1a-8(838mg，3.80mmol)，pd2dba3(347mg,0.38mmol)，4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(439mg,0.76mmol)，叔丁醇钠(547mg,5.7mmol)，1,4-dioxane(20ml)，室温下n2置换三次，体系在110℃反应8h。浓缩，加水，dcm萃取，有机相干燥，过滤，浓缩，用sio2(dcm/ea＝50:1to dcm/meoh＝20:1)纯化，得到标题化合物1a-9(1.2g，黄色固体)，直接用作下一步
[0052]
第六步1a-10
[0053]
取一个单口瓶，依次加入化合物1a-9(1.2g，1.80mmol)，dcm(10ml)，三氟乙酸tfa(2ml)，常温下搅拌3h。浓缩得到标题化合物1a-10，直接用作下一步
[0054]
第七步1a-12
[0055]
取一个单口瓶，依次加入化合物1a-10(400，0.29mmol)，dcm(10ml)，diea(451mg,3.5mmol)，常温下滴加化合物1a-11(90mg，0.85mmol)的dcm(2ml)溶液，常温反应2h。浓缩，加水，dcm萃取，有机相干燥，过滤，浓缩，用hplc纯化，得到标题化合物1a-12(65mg，非白色固体)，
[0056]
ms m/z(esi):620[m+h]
+
。
[0057]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.80
–
7.65(m,2h),7.45(td,j＝7.7,6.1hz,1h),7.41
–
7.28(m,2h),7.30
–
7.23(m,1h),6.81(d,j＝14.8hz,1h),6.18(dd,j＝16.6,2.2hz,1h),5.78(d,j＝10.5hz,1h),5.06
–
4.67(m,2h),4.38(s,1h),4.12(dd,j＝37.1,18.3hz,4h),3.92
–
3.68(m,3h),3.55
–
2.95(m,14h),2.96
–
2.73(m,4h),2.65(dt,j＝4.5,2.2hz,1h),1.97(dt,j＝13.8,6.7hz,1h),1.73(s,5h),1.20(s,2h).
[0058]
实施例2化合物165的制备
[0059][0060]
第一步165b
[0061]
化合物165a(4g，8.4mmol)溶于乙醇中(80ml)中，加入哌啶(1.4g，16.8mmol)，乙酸(0.5g，8.4mmol)80℃加热搅拌6h。反应完毕后，加水用二氯甲烷萃取三次，有机相用无水无水硫酸钠干燥，浓缩拌样柱层析纯化得到标题化合物165b(4.2g，7.5mmol)，收率89％。
[0062]
第二步165c
[0063]
化合物165b(4.2g，7.5mmol)溶于异丙醇80ml中，加入钯碳2g，氢气保护下，50℃下搅拌24小时，过滤除去钯碳，旋干溶剂后柱层析纯化得到标题化合物165c(3.2g，6.8mmol)，收率90％。
[0064]
第三步165d
[0065]
化合物165c(1g，2.1mmol)和化合物1-溴，8-氯萘(1.01g，4.2mmol)溶于1,4-二氧六环(30ml)中，氩气置换，在110℃下反应6小时。旋干溶剂，加水用乙酸乙酯萃取3次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析纯化得到标题化合物165d(0.38g，0.6mmol)，收率29％。
[0066]
第四步165e
[0067]
化合物165d(0.38g，0.6mmol)溶于二氯甲烷10ml中，加入三氟乙酸3ml，常温反应3h。旋干溶剂，加碳酸氢钠溶液用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥，浓缩得到标题化合物165e(280mg，0.52mmol)，收率88％。
[0068]
第五步165
[0069]
化合物165e(120mg，0.22mmol)和三乙胺(45mg，0.45mmol)溶于二氯甲烷(20ml)中，缓慢加入丙烯酰氯(40mg，0.45mmol)，常温反应5h。加水淬灭反应，用二氯甲烷30ml萃取
3次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后制备纯化得到标题化合物165(19.6mg，0.033mmol)，收率15％。
[0070]1h nmr(400mhz,methanol-d4)δ7.82(dd,j＝8.2,1.3hz,1h),7.68(dt,j＝8.4,1.5hz,1h),7.56
–
7.44(m,2h),7.41
–
7.29(m,2h),6.80(s,1h),6.28(d,j＝16.7hz,1h),5.82(d,j＝10.6hz,1h),4.39(dd,j＝17.5,4.2hz,2h),4.08(dd,j＝42.6,12.8hz,2h),3.76(dd,j＝17.5,7.8hz,1h),3.60(d,j＝5.3hz,1h),3.43(s,2h),3.29
–
3.04(m,4h),2.98(d,j＝7.8hz,4h),2.90(d,j＝7.1hz,1h),2.76(d,j＝15.2hz,1h),2.65(s,4h),1.65(p,j＝6.5,5.9hz,4h),1.51(d,j＝7.0hz,2h),1.30(d,j＝18.3hz,1h).
[0071]
ms m/z(esi):584.4[m+h]
+
。
[0072]
实施例3化合物9的制备
[0073][0074]
合成路线：
[0075][0076]
第一步化合物9-3
[0077]
将化合物9-1(0.32g，0.67mmol)溶于etoh(5ml)中，加入化合物9-2(68mg，0.67mmol)和acoh(41mg,0.67mmol)。回流反应2小时。lc-ms显示反应完全。加水(10ml)，nahco3水溶液调节ph至中性，dcm(10ml
×
3)萃取。合并有机相，饱和食盐水(10ml)洗涤，无水na2so4干燥，过滤，浓缩。残余物柱层析(dcm/meoh＝100/1至10/1)得无色油状化合物9-3(0.25g,收率64％)。
[0078]
lcms(esi-ms)m/z:576.4(m+h
+
).
[0079]
第二步 化合物9-4
[0080]
将化合物9-3(0.25g，0.43mmol)溶于异丙醇(5ml)中，加入化合物pd/c(25mg,0.1w/w)。h2条件下回流反应3小时。lcms显示反应完全。过滤，浓缩得无色油状化合物9-4(0.19g,收率91％)。
[0081]
lcms(esi-ms)m/z:486.4(m+h
+
).
[0082]
第三步 化合物9-6
[0083]
将化合物9-4(0.19g，0.39mmol)溶于二氧杂环乙烷(5ml)中，加入化合物9-5(94mg，0.39mmol)、pd2(dba)3(36mg,0.039mmol)、xantphos(23mg,0.039mmol)和cs2co3(0.25g,0.78mmol)。回流反应7小时。lc-ms显示反应完全。加水(10ml)，dcm(10ml
×
3)萃取。合并有机相，饱和食盐水(10ml)洗涤，无水na2so4干燥，过滤，浓缩。残余物柱层析(dcm/meoh＝100/1至10/1)得白色固体化合物9-6(0.15g,收率59％)。
[0084]
lcms(esi-ms)m/z:646.4(m+h
+
).
[0085]
第四步 化合物9-7
[0086]
将化合物9-6(0.15g，0.23mmol)溶于dcm(5ml)中，加入tfa(2ml)。常温反应1小时。lcms显示反应完全。浓缩至干燥，复溶于dcm(5ml)中，nahco3水溶液调价ph至7-8，dcm(5ml
×
3)萃取，饱和食盐水(5ml)洗涤，无水na2so4干燥，过滤，浓缩。残余物柱层析(dcm/meoh＝100/1至10/1)得白色固体化合物9-7(0.10g,收率79％)。
[0087]
lcms(esi-ms)m/z:546.4(m+h
+
).
[0088]
第五步 化合物9
[0089]
将化合物9-7(0.10g，0.18mmol)溶于dmf(2ml)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯hatu(84mg,0.22mmol)、diea(71mg,0.55mmol)和化合物9-8(16mg，0.22mmol)。常温反应1小时。lc-ms显示反应完全。加水(10ml)，dcm(10ml
×
3)萃取。合并有机相，饱和食盐水(10ml)洗涤，无水na2so4干燥，过滤，浓缩。残余物反相制备(h2o/mecn＝5％-95％)得白色固体化合物9(27mg,收率25％)。
[0090]
lcms(esi-ms)m/z:600.4(m+h
+
).
[0091]
hplc:96.85％
[0092]1h nmr(400mhz,cd3od)δ7.86
–
7.83(m,1h),7.74
–
7.71(m,1h),7.57
–
7.49(m,2h),7.41
–
7.35(m,2h),6.80(brs,1h),6.32
–
6.27(m,1h),5.85
–
5.83(m,1h),5.08
–
5.00(m,1h),4.54
–
4.32(m,3h),4.19
–
4.13(m,2h),3.91
–
3.34(m,14h),3.28
–
3.20(m,2h),3.06
–
2.75(m,5h),2.23(s,2h).
[0093]
实施例4化合物170的制备
[0094][0095]
第一步170b的制备
[0096]
化合物170a(1g，2.1mmol)和化合物1-溴-8-甲基萘(1g，4.2mmol)溶于1,4-二氧六环(30ml)中，氩气置换，在110℃下反应6小时。旋干溶剂，加水用乙酸乙酯萃取3次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析纯化得到标题化合物170b(0.38g，0.6mmol)，收率29％。
[0097]
第二步170c的制备
[0098]
化合物170b(0.38g，0.6mmol)溶于二氯甲烷10ml中，加入三氟乙酸3ml，常温反应3h。旋干溶剂，加碳酸氢钠溶液用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥，浓缩得到标题化合物170c(280mg，0.52mmol)，收率88％。
[0099]
第三步170的制备
[0100]
化合物170c(120mg，0.22mmol)和三乙胺(45mg，0.45mmol)溶于二氯甲烷(20ml)中，缓慢加入丙烯酰氯(40mg，0.45mmol)，常温反应5h。加水淬灭反应，用二氯甲烷30ml萃取3次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后tlc纯化得到标题化合物170(20.3mg，0.036mmol)，收率16％。
[0101]1h nmr(400mhz,methanol-d4)δ7.72
–
7.62(m,2h),7.41(td,j＝7.7,4.4hz,1h),7.35
–
7.26(m,2h),7.26
–
7.20(m,1h),6.80(s,1h),6.28(d,j＝16.7hz,1h),5.82(d,j＝10.6hz,1h),5.07(s,1h),4.56(s,1h),4.34(d,j＝13.9hz,1h),4.17(dd,j＝17.8,7.8hz,2h),4.03(d,j＝13.3hz,1h),3.76(dd,j＝17.8,13.2hz,1h),3.55(d,j＝10.0hz,1h),3.49
–
3.38(m,1h),3.29
–
3.13(m,3h),3.12
–
3.05(m,1h),3.04
–
2.92(m,4h),2.90(s,3h),2.78(d,j＝14.6hz,1h),2.65(d,j＝24.2hz,4h),1.64(p,j＝5.4hz,4h),1.50(d,j＝5.7hz,2h),1.34
–
1.25(m,1h).
[0102]
ms m/z(esi):564.4[m+h]
+
。
[0103]
实施例5化合物176的制备
[0104][0105]
合成路线：
[0106][0107]
第一步2-(环戊基(甲基)氨基)乙-1-醇(176c)
[0108]
将2-(甲基氨基)乙-1-醇176a(5.0g，66.6mmol，1.0eq)和环戊酮176b(6.2g，73.3mmol，1.1eq)投于dcm(100ml)中，加入nabh(oac)3(21.2g，99.9mmol，1.5eq)，室温反应过夜，过滤，浓缩，柱层析纯化得黄色油状物176c(5.8g)。
[0109]
lcms(esi-ms)m/z:144(m+h
+
).
[0110]
第二步苄基(r)-4-(4-(叔丁氧基羰基)-3-(氰基甲基)哌啶-1-基)-2-(2-(环戊基(甲基)氨基)乙氧基)-5,8-二氢吡啶[3,4-d]嘧啶-7(6h)-羧酸酯(176e)
[0111]
n2下，将化合物176d(2.2g，4.2mmol，1.0eq)，176c(1.2g，8.4mmol,2.0eq)，pd(oac)2(94mg，0.42mmol,0.1eq)，binap(0.52g，0.84mmol，0.2eq)和cs2co3(4.1g，12.6mmol,3.0eq)投于1,4-二氧六环(50ml)，加热到回流，反应16小时后，冷却至室温，浓缩，flash过柱得到黄色固体176e(1.8g)。
[0112]
ms m/z(esi):634[m+h]
+
。
[0113]
第三步叔丁基(r)-4-(2-(2-(环戊基(甲基)氨基)乙氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸酯(176f)
[0114]
将化合物176e(1.8g，2.8mmol)投于甲醇(50ml)，加入10％pd-c(2.0g)，氢气环境下，室温反应过夜，过滤，浓缩至干得到黄色固体176f(1.2g)。
[0115]
ms m/z(esi):500[m+h]
+
[0116]
第四步叔丁基(r)-4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(2-(环戊基(甲基)氨基)乙氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸酯(176h)
[0117]
将化合物176f(500mg，1.0mmol,1.0eq)，1-溴-8-氯萘176g(0.36g，1.5mmol，1.5eq)，pd2(dba)3(0.14g，0.15mmol，0.15eq)和:4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(xantphos)(0.14g，0.3mmol，0.3eq)投于甲苯(20ml)中，加入碳酸铯(0.65g，2.0mmol，2.0eq)，氮气保护下，回流反应16h。冷至室温，浓缩，柱层析纯化黄色固体176h(280mg)。
[0118]
lcms(esi-ms)m/z:661(m+h
+
).
[0119]
第五步(r)-n-(2-((7-(8-氯萘-1-基)-4-(3-(氰基甲基)哌啶-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-基)氧基)乙基)-n-甲基环戊胺(176i)
[0120]
将化合物176h(125mg，0.19mmol，1.0eq)溶于dcm(8ml)中，加入tfa(8ml)，室温反应1h。浓缩至干，得到化合物176i，直接用于下步反应。
[0121]
lcms(esi-ms)m/z:561(m+h
+
).
[0122]
第六步(r)-1-(4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(2-(环戊基(甲基)氨基)乙氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4)-d]嘧啶-4-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-基)-2-氟丙-2-烯-1-酮
[0123]
将化合物176i(130mg，0.23mmol，1.0eq)溶于dcm(15ml)中，依次加入2-氟丙烯酸(32mg，0.35mmol，1.5eq)，hatu(0.13g，0.35mmol，1.5eq)和tea(64μl,0.46mmol，2.0eq)，室温反应4h。加入dcm(20ml)稀释，经碳酸钾水溶液洗涤和无水硫酸钠干燥，浓缩，制备板纯化得白色固体176，16mg。
[0124]
lcms(esi-ms)m/z:633(m+h
+
).
[0125]
实施例6化合物176-1的制备
[0126][0127]
合成路线：
[0128][0129]
第一步 3-(环戊基(甲基)氨基)丙-1-醇(3-2)
[0130]
将3-(甲基氨基)丙-1-醇(5.0g，56.1mmol，1.0eq)和环戊酮(5.2g，61.7mmol，1.1eq)投于dcm(100ml)中，加入nabh(oac)3(17.8g，84.2mmol，1.5eq)，室温反应过夜，过滤，浓缩，柱层析纯化得黄色油状物3-2(，5.0g)。
[0131]
lcms(esi-ms)m/z:158(m+h
+
).
[0132]
第二步 苄基(r)-4-(4-(叔丁氧基羰基)-3-(氰基甲基)哌嗪-1-基)-2-氯-5,8-二氢吡啶[3,4-d]嘧啶-7(6h)-羧酸酯(6-2)
[0133]
将2,4-二氯-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6h)-羧酸苄酯(4-2)(5.9g，20.2mmol，1.0eq)、(r)-2-(异氰基甲基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(5-2)(5.0g,22.2mmol,1.1eq)和n，n-二异丙基乙胺(dipea)(7.0ml,40.4mmol,2.0eq)投于dmso(20ml)中，80℃反应3h，冷
至室温，加入乙酸乙酯(80ml)稀释，依次用水(30ml)和饱和食盐水(30ml
×
3)洗涤，无水na2so4干燥，过滤，浓缩至小体积，将其滴加至石油醚(200ml)中，室温打浆纯化得黄色固体6(3.4g)。
[0134]
lcms(esi-ms)m/z:528(m+h
+
).
[0135]
第三步苄基(r)-4-(4-(叔丁氧基羰基)-3-(氰基甲基)哌啶-1-基)-2-(3-(环戊基(甲基)氨基)丙氧基)-5,8-二氢吡啶[3,4-d]嘧啶-7(6h)-羧酸酯(7-2)
[0136]
n2下，将化合物6-2(1.5g，2.8mmol，1.0eq)，3-2(0.88g，5.6mmol,2.0eq)，pd(oac)2(63mg，0.28mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(binap)(0.35g，0.56mmol，0.2eq)和cs2co3(2.7g，8.4mmol,3.0eq)投于1,4-二氧六环(50ml)，加热到回流，反应16小时后，冷却至室温，浓缩，过flash柱，得到黄色固体7(1.0g)。
[0137]
ms m/z(esi):648[m+h]
+
。
[0138]
第四步叔丁基(r)-4-(2-(3-(环戊基(甲基)氨基)丙氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-甲酸酯(8-2)
[0139]
将化合物7-2(1.0g，1.5mmol)投于甲醇(50ml)，加入10％ pd-c(1.0g)，氢气环境下，室温反应过夜，浓缩至干得到黄色固体8-2(700mg)。
[0140]
ms m/z(esi):514[m+h]
+
[0141]
第五步叔丁基(r)-4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(3-(环戊基(甲基)胺基)丙氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-2-(氰基甲基)哌嗪-1-甲酸酯(10-2)
[0142]
将化合物8-2(300mg，0.58mmol,1.0eq)，1-溴-8-氯萘(0.21g，0.87mmol，1.5eq)，pd2(dba)3(82mg，0.09mmol，0.15eq)和xantphos(79mg，0.17mmol，0.3eq)投于甲苯(20ml)中，加入碳酸铯(0.39g，1.2mmol，2.0eq)，氮气保护下，回流反应16h。冷至室温，浓缩，柱层析纯化黄色油状物10-2(120mg)。
[0143]
lcms(esi-ms)m/z:675(m+h
+
).
[0144]
第六步(r)-n-(3-((7-(8-氯萘-1-基)-4-(3-(氰基甲基)哌啶-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-基)氧基)丙基)-n-甲基环戊胺(11-2)
[0145]
将化合物10-2(120mg，0.18mmol，1.0eq)溶于dcm(8ml)中，加入tfa(8ml)，室温反应1h。浓缩至干，得到化合物11-2直接用于下步反应。
[0146]
lcms(esi-ms)m/z:575(m+h
+
).
[0147]
第七步r)-1-(4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(3-(环戊基(甲基)氨基)丙氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4)-d]嘧啶-4-基)-2-(氰基甲基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮(176-1)
[0148]
将化合物11-2(100mg，0.18mmol，1.0eq)溶于dcm(15ml)中，依次加入tea(0.1ml，0.72mmol，4.0eq)和丙烯酰氯(22μl,0.27mmol，1.5eq)，室温反应1h。加入dcm(20ml)稀释，经碳酸钾水溶液洗涤和无水硫酸钠干燥，浓缩，制备板纯化得白色固体176-1(18mg)。
[0149]
lcms(esi-ms)m/z:629(m+h
+
).
[0150]1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.75(d,j＝8.1hz,1h),7.61(t,j＝7.4hz,1h),7.51(dd,j＝7.4,1.4hz,1h),7.44(dt,j＝12.5,7.8hz,1h),7.33(t,j＝7.8hz,1h),7.25
–
7.18(m,1h),6.58(s,1h),6.39(d,j＝16.7hz,1h),5.82(d,j＝10.5hz,1h),4.39(d,j＝18.6hz,2h),4.10(d,j＝14.2hz,1h),3.96
–
3.76(m,2h),3.59(d,j＝11.0hz,1h),3.45(s,1h),3.30
–
2.96(m,5h),2.95
–
2.78(m,3h),2.53(d,j＝42.6hz,3h),2.20(d,j＝28.6hz,
3h),1.73(s,10h),0.86(d,j＝11.0hz,2h).
[0151]
实施例7化合物193的制备
[0152][0153]
合成路线：
[0154][0155]
第一步
[0156]
将化合物193-1(2.8g，8.47mmol)悬浮于mecn(28ml)中，依次加入k2co3(2.4g,16.94mmol)和化合物193-2(2.9g,12.7mmol)。n2保护下25℃反应7小时。lcms显示反应完全。反应加aq.nahco3(30ml)淬灭，ea(20ml
×
2)萃取。合并有机相，饱和食盐水(10ml)洗涤，无水na2so4干燥，过滤，浓缩。残余物柱层析(pe/ea＝9/1至4/1)得化合物193-3(3.7g,84％yield)。
[0157]
lcms(esi-ms)m/z:520.1(m+h
+
).
[0158]
第二步
[0159]
将化合物193-3(3.0g，5.8mmol)、化合物193-4(0.9g,5.8mmol)、pd(oac)2(135mg,0.6mmol)、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(binap)(747mg,1.2mmol)和cs2co3(5.6g,17.4mmol)依次加入反应瓶中，抽空换氮后，再加入1,4-二氧六环(60ml)，再次抽空换氮后，放入油浴，升温至80℃，反应2h。lcms显示反应完全。反应用ea(30ml)稀释，然后依次用nahco3水溶液(30ml)和饱和食盐水(30ml)洗涤，无水na2so4干燥，过滤，浓缩。残余物柱层析(pe/ea＝3/1至1/1)得化合物193-5(3.0g,80％yield)。
[0160]
lcms(esi-ms)m/z:647.3(m+h
+
).
[0161]
第三步
[0162]
n2下，将化合物193-5(500mg，0.77mmol)，193-6(250mg，0.80mmol)，(dppf)pdcl2[0163]
(50mg，0.08mmol)和k3po4(250mg，1.18mmol)的1,4-二氧六环(20ml)和水(6ml)的混合溶液加热到90℃反应4小时后冷却至室温，浓缩，flash过柱(dcm/meoh 0～5％)，得到化合物193-7(210mg，0.25mmol)，收率32.6％。
[0164]
ms m/z(esi):833.4[m+h]
+
。
[0165]
第四步
[0166]
向化合物193-7(210mg，0.25mmol)的二氯甲烷溶液(4ml)中加入tfa(1ml)，室温反应过夜，浓缩，flash过柱(dcm/meoh 0～10％)得到化合物193-8(90mg，0.14mmol)，收率
56.4％。
[0167]
ms m/z(esi):633.3[m+h]
+
。
[0168]
第五步
[0169]
将化合物193-8(100mg，0.16mmol)溶于dmf(3ml)中，再依次加入hatu(182mg，0.48mmol)，酸(16mg，0.18mmol)和diea(167ul，0.96mmol)。室温搅拌过夜后，lcms显示有产物生成。反应物制备纯化后，得化合物193(27mg,24％yield)。
[0170]
lcms(esi-ms)m/z:705.3(m+h
+
).
[0171]
hplc:96.16％purity(254nm)
[0172]1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.01(s,1h),7.46-7.43(m,1h),7.25
–
7.18(m,3h),7.04
–
[0173]
7.00(m,1h),5.39
–
5.28(m,2h),4.66(m,2h),4.39
–
4.36(m,2h),4.10(m,2h),3.82
–
3.75(m,
[0174]
4h),3.48
–
3.44(m,1h),3.06(m,4h),2.89(m,1h),2.73
–
2.68(m,1h).
[0175]
生物活性试验
[0176]
实验一、本发明鼠类肉瘤病毒癌基因甘氨酸12位处胞嘧啶突变(kras
g12c
)小分子化合物的体外活性的测定
[0177]
1.实验目的
[0178]
本实验通过均相时间分辨荧光法(homogeneous time-resolved fluorescence,htrf)测试本发明化合物对kras
g12c
活性抑制，根据半抑制浓度(ic
50
)评价化合物的体外活性。
[0179]
2.实验方法
[0180]
2.1实验用化合物的配置
[0181]
将实施例1终产物、amg510溶解于二甲基亚砜(dmso)配置成10毫摩尔每升(mm)的母液。测试化合物的最高浓度为10微摩尔每升(μm)，以3倍稀释，共10个浓度梯度，双复孔。
[0182]
2.2实验流程
[0183]
在384反应板中分别加入1μl浓度梯度稀释的化合物、2μl的krasg12c酶、用封板膜封板，将化合物反应板进行离心，1000rpm，离心1min，25℃孵育60min。再加入5μl底物及抗体混合物(抗组氨酸抗体和镧系元素铕(eu)标记的单克隆抗体)，用封板膜封板后离心，1000rpm，离心1min，25℃孵育120min。用biotek读615nm(cryptate)和665nm(xl665)的荧光信号。应用graphpad prism 7.0软件计算半抑制浓度(ic
50
)值。
[0184]
2.3实验结果及结论
[0185]
本发明化合物对kras
g12c
具有明显的活性抑制，其体外活性的半抑制浓度(ic50)如表1所示。
[0186]
表1.体外抑制活性
[0187][0188]
结论：本发明化合物对krasg12c具有明显的抑制活性。
[0189]
实验二、本发明化合物的herg钾离子通道相关的心脏安全性实验
[0190]
1.实验目的；
[0191]
使用全自动膜片钳nanion patchliner系统，测试实施例1终产物、mrtx849
[0192]
和amg510对herg(human ether-a go-go-related gene)钾离子通道电流的影响，评价其心脏毒性。
[0193]
2.实验方案：
[0194]
2.1细胞培养
[0195]
herg稳定表达的hek293细胞培养于直径35mm的细胞培养皿中，培养基
[0196]
为90％高糖dmem(gibco)+10％fbs(gibco)置于37℃，5％co2的细胞培养箱中，每48小时按1:5比例进行传代。实验当天，倒去废液，pbs轻洗一次，加入0.25％trypsin-edta
[0197]
(invitrogen)室温下消化1分钟，加入培养基终止消化，重悬后将细胞转移至实验皿中备用。
[0198]
2.2化合物配置
[0199]
实施例1终产物、mrtx849和amg510用双蒸水(含0.1％dmso)
[0200]
溶液稀释成0.3μm、1μm、3μm、10μm及30μm 5个浓度。
[0201]
2.3试验流程
[0202]
使用全自动膜片钳nanion patchliner技术检测钾离子电流，将玻璃微电极
[0203]
插入放大器探头即连接至膜片钳放大器，采样频率为10khz，滤波频率为2khz，细胞钳制在
[0204]-80mv，诱发herg钾电流的步阶电压从-80mv给予一个2秒的去极化电压到+20mv，再复极化至-50mv，持续1秒后回到-80mv。每10秒给予此电压刺激，确定herg钾电流稳定后开始给药，化合物从低浓度至高浓度连续给药。使用pclamp 10，excel和graphpad prism 7.0软件计算半抑制浓度(ic
50
)值。
[0205]
3.实验结果及结论
[0206][0207]
本发明化合物实施例对herg钾离子电流没有明显的抑制作用
[0208]
实验三、本发明化合物在小鼠中药物代谢动力学实验
[0209]
1.实验目的：
[0210]
以balb/c小鼠为例，以液相色谱-串联质谱(ls/ms/ms)法测定了小鼠分别灌胃和静脉给予实施例1、2、3、4、5、6、和7不同时刻血浆中药物浓度并计算相关药代参数，评价本发明实施例化合物在小鼠体内的药代动力学特性。
[0211]
2.试验方案
[0212]
2.1试验药物
[0213]
实施例1终产物、实施例2终产物、实施例3终产物；实施例4终产物、实施例5终产物、实施例6终产物、实施例7终产物。
[0214]
2.2试验动物
[0215]
健康成年的balb/c小鼠，spf级，雄性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号scxk(沪)2018-0006，动物合格证编号：20180006031015。
[0216]
2.3药物配置
[0217]
静脉组：称取一定量的化合物，按照体积比5:10:85，依次加入dmso,聚乙二醇(peg300)和生理盐水，搅拌超声，配置成澄清透明溶液，溶液终浓度为0.2mg/ml。
[0218]
口服灌胃组：称取一定量的化合物，溶于1％吐温-80(tween 80)涡旋超声，加入含1％羟丙基甲基纤维素(hpmc)去离子水溶液，超声，配置成均一的溶液，溶液终浓度为1mg/ml。
[0219]
2.4给药
[0220]
具体给药按照试验方案进行，详情见表2。
[0221]
表2.小鼠药代动力学试验方案
[0222][0223][0224]
2.5采血时间及样品处理
[0225]
静脉组：给药前及给药后5分钟、15分钟、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时及24小时分别通过眼眶采血；灌胃组：给药前及给药后15分钟、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时及24小时分别通过眼眶采血，每次采血0.2毫升(ml)，置于抗凝管中，混匀，保存于-20℃冰箱中备用。
[0226]
3.样品测试及数据分析
[0227]
采用液相色谱-串联质谱(ls/ms/ms)方法测定大鼠全血中化合物的含量。
[0228]
利用winnonlin5.3软件的非房室模型计算给药后化合物的药代动力学参数。
[0229]
4.试验结果
[0230]
本发明化合物给药后药代动力学参数见以下表3。由表3所示，本发明的化合物具有较好的代谢特征及生物利用度。
[0231]
表3.本发明的化合物的药代动力学参数
[0232][0233]
实验四、本发明化合物的小鼠体内药效实验一
[0234]
1.给药方案
[0235]
无菌条件下，将对数生长期的人非小细胞肺癌细胞hci-h358制成细胞悬液(加10％体积比的基质胶)，移植于balb/c nude小鼠背部右侧皮下，每只小鼠接种5
×
106细胞，体积100微升(μl)，接种后，待肿瘤生长到150-200立方毫米(mm3)时，将小鼠随机分成4组，每组8只进行药效实验，阳性对照为mrtx849，阴性对照组给等量的溶媒。每周用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积计算公式为：v＝0.5a
×
b2，其中a、b分别表示长宽。使用肿瘤生长抑制率tgi(％)评价化合物的抑瘤效果。tgi(％)的计算：tgi(％)＝1-(某组给药结束时平均瘤体积-某给药组分组时平均瘤体积)/(溶媒对照组给药结束时平均瘤体积-溶媒对照组分组时平均瘤体积)
×
100％。
[0236]
具体设计见表4。
[0237]
表4：化合物体内药效实验方案
[0238][0239]
2.实验动物
[0240]
balb/c nude裸小鼠，spf级，6-8周龄，雌性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司浙江，许可证号scxk(浙)2019-0011，动物合格证编号：20210823abzz0619000235。
[0241]
3.试验药物
[0242]
实施例2终产物、实施例5终产物
[0243]
4.药物的配置
[0244]
称取一定量的化合物，溶于1％吐温-80(tween 80)涡旋超声，加入含1％羟丙基甲基纤维素(hpmc)去离子水溶液，超声，配置成均一的溶液。
[0245]
5.给药
[0246]
具体给药按照给药方案进行。
[0247]
6.实验结果及结论
[0248]
实验结果见表5。表5
[0249][0250][0251]
实施例2终产物、实施例5终产物、在30毫克每公斤(mg/kg)的给药浓度下对肿瘤生长抑制率分别为86.30％、85.94％，而mrtx849在30毫克每公斤(mg/kg)的给药浓度下对肿瘤生长抑制率只有70.24％，说明本发明实施例2终产物化合物、实施例5终产物化合物在人非小细胞肺癌hci-h358模型中有着比对照组mrtx849更有效的肿瘤生长抑制作用。
[0252]
实验五、本发明化合物的小鼠体内药效实验二
[0253]
1.给药方案
[0254]
无菌条件下，将对数生长期的人胰腺癌mia-paca2制成细胞悬液(加10％体积比的基质胶)，移植于cb-17scid免疫缺陷小鼠背部右侧皮下，每只小鼠接种1
×
107细胞，体积100微升(μl)，接种后，待肿瘤生长到100-150立方毫米(mm3)时，将小鼠随机分成4组，每组8只进行药效实验，阳性对照为mrtx849，阴性对照组给等量的溶媒。每周用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积计算公式为：v＝0.5a
×
b2，其中a、b分别表示长宽。使用肿瘤生长抑制率tgi(％)评价化合物的抑瘤效果。tgi(％)的计算：tgi(％)＝1-(某组给药结束时平均瘤体积-某给药组分组时平均瘤体积)/(溶媒对照组给药结束时平均瘤体积-溶媒对照组分组时平均瘤体积)
×
100％。
[0255]
具体设计见表6。
[0256]
表6.化合物体内药效实验方案
[0257][0258]
2.实验动物
[0259]
cb-17scid小鼠，spf级，6-8周龄，雌性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司，许可证号scxk(沪)2017-0011，动物合格证编号：20170011005405。
[0260]
3.试验药物
[0261]
实施例2终产物、实施例5终产物
[0262]
4.药物的配置
[0263]
称取一定量的化合物，溶于1％吐温-80(tween 80)涡旋超声，加入含1％羟丙基甲基纤维素(hpmc)去离子水溶液，超声，配置成均一的溶液。
[0264]
5.给药
[0265]
具体给药按照给药方案进行。
[0266]
6.实验结果及结论
[0267]
实验结果见表7。表7
[0268][0269]
实施例2终产物、实施例5终产物、在10毫克每公斤(mg/kg)的给药浓度下对肿瘤生长抑制率分别为94.59％、96.11％，而mrtx849在10毫克每公斤(mg/kg)的给药浓度下对肿瘤生长抑制率只有71.18％，说明本发明实施例化合物2、实施例化合物5在人胰腺癌mia-paca2模型中有着比对照组mrtx849更有效的肿瘤生长抑制作用。

技术特征：
1.一种通式(ⅱ)所示的化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、及其混合物形式、及其可药用盐，其中r0为氢或-f；a为x为-o-或-ch
2-；y1和y2分别独立地为-f或-cl；r1为r2为-nr
a
r
b
、-ch2nr
a
r
b
或-(ch2)2nr
a
r
b
；r3为r4为r5为卤素或-c
1-3
烷基；r6为-c
1-3
烷基；r
a
和r
b
分别独立地为氢、-c
1-3
烷基、-c
3-6
环烷基；或是r
a
和r
b
连同它们所连接的氮原子一起形成未被取代或被1-3个取代基取代的5-11元杂环烷基，所述的取代基为-c
1-3
烷基、卤素或烷氧基。2.根据权利要求1所述的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、及其混合物形式、及其可药用盐，其特征在于，当x为-o-时，r
a
为氢或-c
1-3
烷基；r
b
为-c
3-6
环烷基；当x为-ch
2-时，r2为r5为-cl或-ch3；r6为-ch3。3.根据权利要求1所述的化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、及其混合物形式、及其可药用盐，其特征在于，所述化合物为：
4.一种药物组合物，其特征在于，包括治疗有效量的权利要求1-3任一项所述的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、及其混合物形式、及其可药用盐，以及任选一种或多种医药上可接受的载剂和/或稀释剂。5.根据权利要求1-3任一项所述的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、及其混合物形式、及其可药用盐，或者根据权利要求4所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗kras介导的相关疾病的药物中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述kras介导的相关疾病包括血液癌和实体瘤。

技术总结
本发明提供了作为KRAS抑制剂的化合物及其制备方法和用途。本发明还公开了本发明化合物或其药物组合在制备药物中的用途，该药物可用于预防和治疗血液癌和实体瘤。用于预防和治疗血液癌和实体瘤。


技术研发人员：许忻 陈嘉 王贯 张雨云 李强 周晓波
受保护的技术使用者：浙江华海药业股份有限公司
技术研发日：2022.12.27
技术公布日：2023/7/26