一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株及其构建方法和应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株及其构建方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.酚类化合物是指一类由羟基直接与芳香烃基团结合而成的化合物，是一类重要的精细和大宗化学品，在工业和消费领域具有不同的应用。同时酚类化合物也是分布最广泛的污染物之一，对生物有很高的毒性。其中，间苯三酚及其衍生物是一种广泛存在于生物系统中的次级代谢产物，间苯三酚具有很高的应用价值，可作为药物治疗平滑肌痉挛，也可作为农药用于病虫害的防治，此外，间苯三酚也可用于轮胎粘稠剂、橡胶以及燃料的生产。研究者采用了很多方法来提高间苯三酚生物合成的产量，比如改变生物合成过程种的培养条件、改变生产质粒的稳定性或者改变菌株自身的代谢通路等，但仍处于瓶颈期。研究过程中我们发现间苯三酚自身对微生物的毒性是限制其产量提高的主要原因。为解决这一问题，迫切需要了解酚类化合物的杀菌原理，全面阐述细菌对酚类物质的耐受机制，并在此基础上创建适用于工业化应用的高酚类耐受性的微生物菌株。
4.近年来，研究者在微生物胁迫耐性机制方面开展了大量的工作，如低温、高渗透压、高酸、高碱、辐射以及有机溶剂等。研究对象主要集中在革兰氏阴性菌，且多以模式菌株(如大肠杆菌)为主。据报道，酚类化合物会增加细胞内活性氧的水平，但具体机制仍不清楚。因此，亟待全面解析细菌在酚类胁迫条件下的适应机制。
5.大肠杆菌作为模式生物以遗传背景清晰、生长快、结构简单、基因编辑工具成熟等优势被广泛用于基因工程、工业生产等领域。但目前大肠杆菌对于间苯三酚的耐受水平仍然有限，使得间苯三酚生物合成过程中产量很低，有待通过基因工程、分子生物学等手段进一步提高耐受性。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术存在的不足，本发明提供一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株及其构建方法和应用。本发明通过分子生物学技术构建突变菌株，并进行表型验证，发现超氧化物歧化酶sodb、clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣clpx、铁离子输出蛋白fetab对间苯三酚耐受至关重要。在此基础上进一步构建系列过表达工程菌株。本发明为揭示细菌在酚类化合物的耐受机制的研究奠定了良好的基础，为酚类化合物高效生产菌株的创建提供新思路。
7.为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明的第一个方面，提供一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株，所述大肠杆菌突变菌株是通过对野生型大肠杆菌采用如下(a1)-(a3)中任意一种或多种基因工程方法进行改造后获得：
9.(a1)敲除超氧化物歧化酶基因sodb；
10.(a2)敲除clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx；
11.(a3)突变铁离子输出蛋白基因fetab起始密码子上游的核苷酸。
12.其中，所述野生型大肠杆菌可以为e.coli bl21(de3)。
13.所述超氧化物歧化酶基因sodb来源于大肠杆菌，genebank id：253977814；
14.所述atp依赖性分子伴侣基因clpx来源于大肠杆菌，genebank id：253976618；
15.铁离子输出蛋白基因fetab来源于大肠杆菌，genebank id：253976670/253976671；更具体的，所述(a3)中，是对feta起始密码子上游60bp处进行突变c
→
g。
16.进一步的，所述具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株是野生型大肠杆菌在上述突变基础上，过表达荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phld、多重抗性激活因子基因mara和乙酰辅酶a羧化酶基因accadbc中的任意一个或多个，从而进一步提高突变菌株生产间苯三酚的产量。
17.本发明的第二个方面，提供上述具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株的构建方法，所述构建方法包括：对野生型大肠杆菌采用如下(a1)-(a3)中任意一种或多种基因工程方法进行改造：
18.(a1)敲除超氧化物歧化酶基因sodb；
19.(a2)敲除clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx；
20.(a3)突变铁离子输出蛋白基因fetab起始密码子上游的核苷酸。
21.其中，所述野生型大肠杆菌可以为e.coli bl21(de3)。
22.所述超氧化物歧化酶基因sodb来源于大肠杆菌，genebank id：253977814；
23.所述atp依赖性分子伴侣基因clpx来源于大肠杆菌，genebank id：253976618；
24.铁离子输出蛋白基因fetab来源于大肠杆菌，genebank id：253976670/253976671；更具体的，所述(a3)中，是对feta起始密码子上游60bp处进行突变c
→
g。
25.进一步的，所述构建方法还包括以上述突变后的菌株作为宿主制备感受态，将表达质粒pacyc-accadbc-mara-phld导入感受态中获得重组细胞。
26.本发明的第三个方面，提供上述大肠杆菌突变菌株在如下任意一种或多种中的应用：
27.(c1)应对酚类化合物诱导的铁死亡及相关机制研究；
28.(c2)发酵生产间苯三酚。
29.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
30.1、上述技术方案提供一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株的构建方法，该构建方法首次实现以应对酚类诱导铁死亡的方式，提高间苯三酚产量。
31.2、上述技术方案提供一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株，是以e.coli bl21(de3)为出发菌株，通过同源重组技术对基因组上的sodb、clpx进行敲除，对fetab基因中feta起始密码子上游60bp处进行突变(c
→
g)，获得具有间苯三酚耐受性的大肠杆菌突变株；
32.3、上述技术方案提供一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌工程菌，是在具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株中过表达pacyc-accadbc-mara-phld，获得可高产间苯三酚的大肠杆菌工程菌。
33.4、上述技术方案提供的一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株，在含铁培养基中对于间苯三酚的耐受性比对照菌株提高了485倍，为后续的耐性机制研究和菌株分子改造奠定了良好基础。
34.5、上述技术方案提供的一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌工程菌，在含铁培养基中间苯三酚的产量比对照菌株提高了172％，为后续间苯三酚高效生产菌株的创建提供新思路。
35.6、上述技术方案提供了一种酚类化合物的杀菌机制，酚类化合物与铁离子形成络合物促进芬顿反应的发生从而使细胞中过量积累羟基自由基，诱导细菌铁死亡。
36.7、上述技术方案提供的应对酚类化合物诱导的铁死亡的机制，发现在无铁条件下细菌对间苯三酚、苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、邻苯三酚、β-萘酚的耐受性显著高于有铁条件。
附图说明
37.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
38.图1为野生菌株和突变菌株对pg的耐受性比较。
39.图2为过表达菌株对pg的耐受性比较。
40.图3为突变菌株对5g/l pg的耐受性比较。
41.图4为pfetab菌株与对照菌株细胞内铁离子浓度测定结果。
42.图5不同条件下e.coli bl21(de3)野生菌的存活情况。
43.图6为铁离子螯合剂dfo对e.coli bl21(de3)野生菌的pg耐受性影响。
44.图7为不同条件下δsodb突变菌的pg耐受性影响。
45.图8为二价铁溶液在pg存在和不存在的特性。
46.图9为不同条件下e.coli bl21(de3)野生菌细胞内ho
·
浓度测定结果。
47.图10为不同浓度的dmso对细菌耐受pg的影响。
48.图11为野生菌株和突变菌株中rpos蛋白表达水平。
49.图12为rpos依赖的氧化应激相关基因的转录水平分析结果。
50.图13为野生菌株和工程菌摇瓶发酵生产pg的结果。
51.图14为有铁和无铁条件下野生菌株对多种酚类物质耐受性的比较。
具体实施方式
52.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
53.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
54.定义和缩写
55.间苯三酚(phloroglucinol)：pg
56.异丙基硫代半乳糖苷：iptg
57.超氧化物歧化酶基因：sodb
58.clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因：clpx
59.铁离子输出蛋白基因：fetab
60.含phb结构域的蛋白基因：qmca
61.rna聚合酶sigma因子：rpos
62.聚酮合成酶基因：phld
63.多重抗性激活因子基因：mara
64.乙酰辅酶a羧化酶基因：accadbc
65.大肠杆菌(escherichia coli)：e.coli
66.过氧化氢：h2o267.羟基自由基：ho
·
[0068]“基因敲除”指通过一定途径，将特定基因从基因组中全部或部分删除，从而使特定基因功能丧失。
[0069]“过量表达”或“过表达”指细胞内特定基因受到各种信号调控后，在生物体中超过原有水平表达，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
[0070]
本发明中所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0071]
如前所述，目前大肠杆菌对于间苯三酚的耐受水平有限，使得间苯三酚生物合成过程中产量很低。
[0072]
有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株，所述大肠杆菌突变菌株是通过对野生型大肠杆菌采用如下(a1)-(a3)中任意一种或多种基因工程方法进行改造后获得：
[0073]
(a1)敲除超氧化物歧化酶基因sodb；
[0074]
(a2)敲除clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx；
[0075]
(a3)突变铁离子输出蛋白基因fetab起始密码子上游的核苷酸。
[0076]
其中，所述野生型大肠杆菌可以为e.coli bl21(de3)。
[0077]
所述超氧化物歧化酶基因sodb来源于大肠杆菌，genebank id：253977814；
[0078]
所述atp依赖性分子伴侣基因clpx来源于大肠杆菌，genebank id：253976618；
[0079]
铁离子输出蛋白基因fetab来源于大肠杆菌，genebank id：253976670/253976671；更具体的，所述(a3)中，是对feta起始密码子上游60bp处进行突变c
→
g。
[0080]
通过采用上述基因工程方法获得的大肠杆菌突变菌株显著提高了其对间苯三酚等酚类化合物的耐受性，进一步的，通过对上述具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株
过表达间苯三酚相关基因(如荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phld、多重抗性激活因子基因mara和乙酰辅酶a羧化酶基因accadbc中的任意一个或多个)，可进一步提高突变菌株生产间苯三酚的产量。
[0081]
因此，本发明的又一具体实施方式中，所述具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株是野生型大肠杆菌在上述突变基础上，过表达荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phld、多重抗性激活因子基因mara和乙酰辅酶a羧化酶基因accadbc中的任意一个或多个，从而进一步提高突变菌株生产间苯三酚的产量。
[0082]
其中，所述荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phld，genebank id：11830552；所述多重抗性激活因子基因mara，来源于大肠杆菌，genebank id：6060688；所述乙酰coa羧化酶基因accadbc，来源于大肠杆菌，其中，亚基acca的genebank id：6062185，亚基accb的genebank id：6058890，亚基accc的genebank id：6058863，亚基accd的genebank id：6059083。
[0083]
本发明的又一具体实施方式中，提供上述具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株的构建方法，所述构建方法包括：对野生型大肠杆菌采用如下(a1)-(a3)中任意一种或多种基因工程方法进行改造：
[0084]
(a1)敲除超氧化物歧化酶基因sodb；
[0085]
(a2)敲除clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx；
[0086]
(a3)突变铁离子输出蛋白基因fetab起始密码子上游的核苷酸。
[0087]
其中，所述野生型大肠杆菌可以为e.coli bl21(de3)。
[0088]
所述超氧化物歧化酶基因sodb来源于大肠杆菌，genebank id：253977814；
[0089]
所述atp依赖性分子伴侣基因clpx来源于大肠杆菌，genebank id：253976618；
[0090]
铁离子输出蛋白基因fetab来源于大肠杆菌，genebank id：253976670/253976671；更具体的，所述(a3)中，是对feta起始密码子上游60bp处进行突变c
→
g。
[0091]
本发明的又一具体实施方式中，构建方法包括：
[0092]
(b1)以大肠杆菌bl21(de3)的基因组为模板，通过pcr分别扩增超氧化物歧化酶基因sodb、clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx、铁离子输出蛋白基因fetab的左同源臂、右同源臂；以ptarget质粒为模板通过pcr分别扩增超氧化物歧化酶基因sodb、clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx、铁离子输出蛋白基因fetab的sgrna；以ptarget质粒为模板通过pcr扩增载体骨架；以pksi-1质粒为模板通过pcr扩增载体骨架；以pmidai质粒为模板通过pcr扩增阿普拉霉素抗性基因表达模块(apmr)；以进化获得的q3331菌株的基因组为模板，通过pcr扩增铁离子输出蛋白基因fetab突变的片段。
[0093]
(b2)利用基因工程的手段将上述基因sodb、clpx的左同源臂、右同源臂、sgrna、ptarget载体骨架进行重组；利用基因工程的手段将上述基因fetab的左同源臂、右同源臂、sgrna、阿普拉霉素抗性基因表达模块、ptarget载体骨架进行重组；利用基因工程的手段将上述基因fetab突变片段、pksi-1载体骨架进行重组；分别化学转化到大肠杆菌dh5α中进行复制。
[0094]
(b3)提取重组质粒，利用基因编辑系统对大肠杆菌bl21(de3)基因组的上述任意一种或多种基因进行改造并消除质粒获得突变菌株。
[0095]
进一步的，所述构建方法还包括以上述突变后的菌株作为宿主制备感受态，将表
达质粒pacyc-accadbc-mara-phld导入感受态中获得重组细胞。
[0096]
其中，所述表达质粒pacyc-accadbc-mara-phld可参见zhang r,cao y,liu w,etal.improving phloroglucinol tolerance and production in escherichia coli by groesl overexpression.microbial cell factories,2017,16(1):1-10或cn106929527a。在此不做具体赘述。
[0097]
本发明的又一具体实施方式中，提供上述大肠杆菌突变菌株在如下任意一种或多种中的应用：
[0098]
(c1)应对酚类化合物诱导的铁死亡及相关机制研究；
[0099]
(c2)发酵生产间苯三酚。
[0100]
其中，应用(c1)中，所述酚类化合物包括但不限于间苯三酚、苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、邻苯三酚和β-萘酚。
[0101]
本发明通过研究发现了酚类化合物的杀菌机制，具体的，酚类化合物与铁离子形成络合物促进芬顿反应的发生从而使细胞中过量积累羟基自由基，诱导细菌铁死亡，也因此，在无铁条件下细菌对间苯三酚、苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、邻苯三酚、β-萘酚的耐受性显著高于有铁条件，而本技术构建获得的一系列突变菌株在高浓度酚类物质和铁离子体系中表现出更好的胁迫耐受性和生物转化能力，如可在0.3g/l柠檬酸铁铵和5g/l间苯三酚存在条件下正常生长；在生产间苯三酚方面，在有铁发酵培养基中可生产2.53
±
0.05g/l间苯三酚。
[0102]
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步说明。下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。所用限制性内切酶购自new england biolabs公司；质粒提取、pcr产物回收及胶回收所用试剂盒购自美国omega公司，操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制；rt-pcr实验所用试剂盒购自北京艾德莱公司；iron colorimetric assay kit购自applyge。
[0103]
培养基配方：
[0104]
1)种子液培养基
[0105]
lb培养基：酵母粉5g/l，nacl 10g/l，蛋白胨10g/l。
[0106]
2)有铁发酵培养基
[0107]
k2hpo4·
3h2o 9.8g/l，citric acid
·
h2o 2.1g/l，柠檬酸铁铵0.3g/l，(nh4)2so
4 3.0g/l，葡萄糖20g/l，mgso4·
7h2o 0.4g/l，1000
×
微量元素((nh4)6mo7o
24
·
4h2o 3.7g/l；znso4·
7h2o 2.9g/l；h3bo
3 24.7g/l；cuso4·
5h2o 2.5g/l；mncl2·
4h2o 15.8g/l)。
[0108]
3)无铁发酵培养基
[0109]
k2hpo4·
3h2o 9.8g/l，citric acid
·
h2o 2.1g/l，(nh4)2so
4 3.0g/l，葡萄糖20g/l，mgso4·
7h2o 0.4g/l，1000
×
微量元素((nh4)6mo7o
24
·
4h2o 3.7g/l；znso4·
7h2o 2.9g/l；h3bo
3 24.7g/l；cuso4·
5h2o 2.5g/l；mncl2·
4h2o 15.8g/l)。
[0110]
注：k2hpo4·
3h2o 9.8g/l，citric acid
·
h2o 2.1g/l，(柠檬酸铁铵0.3g/l)，(nh4)2so
4 3.0g/l混合后调至ph 7.0，121℃，20min高压蒸汽灭菌。葡萄糖储液为500g/l，115℃，20min单独灭菌，mgso4·
7h2o储液为200g/l，121℃，20min单独灭菌，1000
×
微量元素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌，转接种子液时分别补加上述单独除菌的葡萄糖、mgso4·
7h2o、
1000
×
微量元素储液及抗生素。
[0111]
实施例1：大肠杆菌突变株的构建
[0112]
以e.coli bl21(de3)为出发菌株，敲除sodb和clpx基因，并将fetab基因中feta起始密码子上游60bp处进行突变(c
→
g)，获得高度耐受pg的突变株，将生产pg的相关质粒pacyc-accadbc-mara-phld导入突变菌株和对照菌株e.coli bl21(de3)中进行摇瓶及发酵罐水平的pg发酵检测。
[0113]
本领域技术人员应该理解，上述大肠杆菌e.coli bl21(de3)的基因编辑实验，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。
[0114]
1.以构建敲除e.coli bl21(de3)中clpx基因的ptarget-δclpx质粒为例说明如下：
[0115]
(1)质粒骨架扩增。以ptaregtf质粒为模板，以targetvf(5’gtcgacctgcagaagcttag 3’)和targetvr(5’actagtattatacctaggactgagc 3’)为引物，用prime star扩增，dpni酶切过夜后纯化。
[0116]
(2)sgrna-editing扩增。以ptargetf质粒为模板，以h-bclpx-gf(5’cctaggtataatactagt taccagcaatggcgtcgagtgttttagagctagaaatagca 3’)和grnar2(5’tctagagaattcaaaaaaagcac 3’)为引物，用primestar扩增并纯化。
[0117]
(3)左右同源臂扩增。以e.coli bl21(de3)基因组为模板，以pre_bclpxf(5’[0118]
cataacacagggactagctgataatccgtc 3’)和aft_bclpxr(5’gagaagctgattatatcgtccgggttcac 3’)为引物，用primestar扩增并纯化。以此产物为模板，分别以h-bclpxhlf
[0119]
(5’ctttttttgaattctctaga gatatctattctcgtctacttaag 3’)和bclpxhlr(5’catgggtcaaaacctcttc 3’)、h-bclpxhrf(5’aagaggttttgacccatggcggccgctaattaaccattcccatacaattag 3’)和h-bclpxhrr(5’aagcttctgcaggtcgacctgtaatgataggcaattcag 3’)为引物，用primestar扩增并纯化，分别获得左右同源臂片段。
[0120]
(4)多片段体外重组。按照体外多片段重组试剂盒说明，将以上四个片段进行重组，反应产物转化e.coli dh5aα中，涂壮观霉素平板培养。以菌落为模板，以ptargetf(5’gtatttcacaccgcatatgc 3’)和ptargetr(5’gtcggtggtgataaacttatc 3’)为引物，用rapid taq mix进行菌落pcr验证，阳性菌落用引物ptargetf和ptargetr进行测序，确认正确保存，即获得用于clpx基因敲除的质粒ptarget-δclpx。
[0121]
按照以上类似的方法，构建用于sodb基因敲除的质粒ptarget-δsodb。扩增sgrna-editing的引物序列为：(5’cctaggtataatactagtgagattattcgcagctctgagttttagagctagaaatagca 3’),左右同源臂扩增所用模板为e.coli bl21(de3)基因组，左同源臂扩增所用引物为(5’[0122]
ctttttttgaattctctagaccaatcgaacgtagtgaactg 3’)和(5’cattgctactctcctttattattaatttgcatac 3’)，右同源臂扩增所用引物为：(5’taaaggagagtagcaatggcggccgctaataactgatggcaaatgcagcattg 3’)和(5’aagcttctgcaggtcgacgatacagctttgtgccggtg 3’)。
[0123]
2.构建e.coli bl21(de3)中fetab基因突变的ptarget-δfeta::apmr质粒，说明如下：(1)质粒骨架扩增。以ptaregtf质粒为模板，以targetvf(5’gtcgacctgcagaagcttag 3’)和targetvr(5’actagtattatacctaggactgagc 3’)为引物，用prime star扩增，dpni酶切
过夜后纯化。
[0124]
(2)sgrna-editing扩增。以ptargetf质粒为模板，以h-bp_feta-gf(5’[0125]
cctaggtataatactagtgttcccccttattcctgcgagttttagagctagaaatagca 3’)和grnar2(5’[0126]
tctagagaattcaaaaaaagcac 3’)为引物，用primestar扩增并纯化。
[0127]
(3)左右同源臂扩增。以e.coli bl21(de3)基因组为模板，以pre-bp_fetaf(5’[0128]
tcagcctgtaaaaacgccgactg 3’)和aft-bp_fetar(5’agcattaatgccagtgctaatgattcgttag 3’)为引物，用primestar扩增并纯化。以此产物为模板，分别以h-bp_fetahlf(5’[0129]
ctttttttgaattctctagagttcattgaagagataagctct 3’)和h-bp_fetahlr(5’[0130]
tagggataacagggtaattctctttcagtaatcaggtataatttg 3’)、h-bp_fetahrf(5’[0131]
attaccctgttatccctagcggccgcataaactgtttttagtaaaaatcagaaaaag 3’)和h-bp_fetahrr(5’[0132]
aagcttctgcaggtcgacacataacgatggatcatctc 3’)为引物，用primestar扩增并纯化，分别获得左右同源臂片段。
[0133]
(4)以pmdiai质粒为模板，用引物pre_is-gf(5’agctatgaccatgattacgaac 3’)和aft_is-gr(5’cagtgccaaagaagcatgac 3’)扩增获得阿普拉霉素抗性基因表达模块。
[0134]
(5)多片段体外重组。按照体外多片段重组试剂盒说明，将以上五个片段进行重组，反应产物转化e.coli dh5α中，涂壮观霉素平板培养。以菌落为模板，以ptargetf(5’[0135]
gtatttcacaccgcatatgc 3’)和ptargetr(5’gtcggtggtgataaacttatc 3’)为引物，用rapid taq mix进行菌落pcr验证，阳性菌落用引物ptargetf和ptargetr进行测序，确认正确保存，即获得用于fetab基因突变的ptarget-δfeta::apmr质粒。
[0136]
3.构建e.coli bl21(de3)中fetab基因突变的pksimbfeta质粒，说明如下：
[0137]
(1)以实验室保存的e.coli bl21(de3)进化菌株q3331(亦可参见：赵志强.间苯三酚合成菌株的系统优化.中国科学院大学,2021)基因组为模板，以pre-bp_fetaf(5’[0138]
tcagcctgtaaaaacgccgactg 3’)和aft-bp_fetar(5’agcattaatgccagtgctaatgattcgttag 3’)为引物，用primestar扩增并纯化。以此产物为模板，分别以m-pfetaf(5’[0139]
catgagctcgttcattgaagagataagctctgccg 3’)和m-pfetar(5’[0140]
cagaagcttacataacgatggatcatctcattgacg 3’)为引物，用primestar扩增并纯化。
[0141]
(2)利用saci和hindiii对步骤(1)的扩增产物以及pksi-1质粒进行酶切。酶切产物回收后，将载体和基因按摩尔比1:4的比例混合，加入连接酶在16℃下连接6-12小时，连接产物42℃下热激转化e.coli dh5α感受态细胞，涂布氨苄霉素抗性平板培养，pcr筛选阳性克隆；阳性克隆培养后提取质粒，测序确认正确保存，即获得用于fetab基因突变的pksimbfeta质粒。
[0142]
4.分别将编辑质粒ptarget-δclpx、ptarget-δsodb、ptarget-δfeta::apmr通过化学转化法转入含pcas的bl21(de3)菌株中涂布于卡那霉素和壮观霉素的平板上30℃培养，pcr筛选阳性克隆；随后挑菌于含卡那霉素的液体lb培养基中30℃培养，加iptg诱导消除ptarget类型质粒，之后转接于无抗液体lb培养基中37℃培养消除pcas质粒，最终获得分
别敲除了clpx、sodb、δfeta的菌株。通过第二次重组完成fetab基因突变：将predtki和pksimbfeta质粒通过化学转化法转入δfeta的菌株菌株中涂布于卡那霉素、氨苄霉素和葡萄糖的平板上30℃培养。随后挑菌至含卡那霉素和l-阿拉伯糖的lb中，30℃培养2-3h加iptg诱导，继续培养10-15h，涂于卡那霉素、l-阿拉伯糖和葡萄糖的平板上30℃培养。pcr筛选阳性克隆，挑菌于无抗液体lb培养基中37℃培养消除质粒，最终获得fetab基因点突变的菌株。
[0143]
5.通过步骤4可进行多轮基因编辑获得一株敲除了clpx和sodb以及qmca-fetab基因点突变的菌株δclpx/δsodb/qmca-fetab(snp)。
[0144]
6.构建fetab、qmca过表达质粒pfetab、pqmca以及对照菌株vector。
[0145]
(1)质粒骨架扩增。以ptrchis2b质粒为模板，以ptrc-f(5’ggtaccatatgggaattcgaag 3’)和ptrc-r(5’agatctcgagctcggatccatg 3’)为引物，用prime star扩增，dpni酶切过夜后纯化。
[0146]
(2)以e.coli bl21(de3)基因组为模板，以fetabf(5’[0147]
gatccgagctcgagatctatgcaggaaaatagtcctttgcttc 3’)和fetabr(5’[0148]
aattcccatatggtaccatttcttcttcaattgcgtcacc 3’)，用primestar扩增并纯化，获得fetab基因片段。以qmcaf(5’aattcccatatggtaccatggctgagtccgcttgttg 3’)和qmcar(5’[0149]
aattcccatatggtaccatggctgagtccgcttgttg 3’)，用primestar扩增并纯化，获得qmca基因片段。
[0150]
(3)多片段体外重组。按照体外多片段重组试剂盒说明，将ptrchis2b载体骨架分别和fetab基因片段、qmca基因片段进行重组，反应产物转化dh5α中，涂氨苄霉素平板培养。以菌落为模板，以ptrcyanf(5’tcgaccggaattatcgattaac 3’)和ptrcyanr(5’[0151]
tcaatgatgatgatgatgatggtc 3’)为引物，用rapid taq mix进行菌落pcr验证，阳性菌落用引物ptrcyanf和ptrcyanr进行测序，确认正确保存，即获得用于fetab基因过表达的ptrc-fetab质粒和qmca过表达质粒ptrc-qmca。
[0152]
7.分别将质粒ptrchis2b、ptrc-fetab、ptrc-qmca通过化学转化法转入bl21(de3)菌株中涂布于氨苄霉素的平板上37℃培养，pcr筛选阳性克隆，获得阴性对照菌株vector以及过表达fetab的菌株pfetab、过表达qmca的菌株pqmca。
[0153]
8.将生产质粒pacyc-accadbc-mara-phld通过化学转化法分别转入e.coli bl21(de3)菌株与δclpx/δsodb/qmca-fetab(snp)突变株菌株获得间苯三酚生产菌株q3595和q4333。
[0154]
实施例2：大肠杆菌突变株与野生菌株对pg耐受性能的比较
[0155]
分别将δclpx、δsodb、qmca-fetab(snp)和野生型e.coli bl21(de3)菌株接种于4ml lb中，37℃，180rpm过夜培养，随后按20％分别接种于100ml有铁发酵培养基，37℃培养至od
600
＝2.5，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，随后分别加1.3g/l pg继续培养4h，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，点板。37℃培养箱中静置培养，待长出菌落后计活菌数，计算存活率。由图1可知，在有铁离子和pg的条件下处理4h后，三株工程菌株的存活率均明显高于对照菌株e.coli bl21(de3)。说明敲除clpx和sodb基因以及qmca-fetab基因点突变后提高了大肠杆菌对pg的耐受性，表明超氧化物歧化酶、clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣、铁离子输出蛋白对提高大肠杆菌的pg耐受性有明显的效果。
[0156]
由于qmca-fetab(snp)的突变位点位于qmca和fetab的共有启动子区，因此我们进一步考察了该位点对两个基因的影响。我们将vector菌株、pqmca菌株和pfetab菌株接种于4ml lb中，37℃过夜培养，随后按20％分别接种于100ml有铁发酵培养基，37℃，180rpm培养至od
600
＝0.6，加0.5mm iptg，37℃培养至od
600
＝2.5，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，随后分别加1.3g/l pg继续培养4h，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，点板。37℃培养箱中静置培养，待长出菌落后计活菌数，计算存活率。由图2可知，在有铁离子和pg的条件下处理4h后，pfetab菌株的存活率显著高于对照菌株vector和pqmca菌株，并且pqmca菌株和vector菌株存活率相差无几，表明fetab过表达后可提高细菌对pg的耐受性，而过表达qmca则对耐受性无影响，说明qmca-fetab(snp)位点的突变其实是提高了fetab基因的表达。
[0157]
随后将δclpx、δsodb、qmca-fetab(snp)和δclpx/δsodb/qmca-fetab(snp)三突变株接种于4ml lb中，37℃，180rpm过夜培养，随后按20％分别接种于100ml有铁发酵培养基，37℃培养至od
600
＝2.5，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，随后分别加5g/l pg继续培养4h，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，点板。37℃培养箱中静置培养，待长出菌落后计活菌数，计算存活率。由图3可知，在5g/l pg的条件下处理4h后，δclpx、qmca-fetab(snp)以及δclpx/δsodb/qmca-fetab(snp)三突变株的均可正常生长。虽然δsodb菌株的生长受到抑制，但仍有部分菌株可以存活，说明三突变株可耐受高浓度的pg。
[0158]
实施例3：大肠杆菌中铁离子的测定以及铁离子对pg耐受性的影响
[0159]
分别将vector菌株和pfetab菌株接种于4ml lb中，37℃，180rpm过夜培养，随后按20％分别接种于100ml有铁发酵培养基，37℃，180rpm培养至od
600
＝0.6，加0.5mm iptg，30℃，180rpm培养0.5h，分别取适量菌液，继续培养至对数中后期加1.3g/lpg，培养0.5h，分别取适量菌液。利用iron colorimetric assay kit进行测定。由图4可知，pfetab菌株细胞中铁离子浓度与vector菌株相比显著下降，表明过表达fetab提高细菌对pg的耐受性是通过降低细胞中铁离子的浓度从而减少pg对细菌的毒害作用。
[0160]
随后考察了铁离子对大肠杆菌的pg耐受性的影响，我们将野生型e.coli bl21(de3)菌株按20％分别接种于100ml有铁发酵培养基和无铁发酵培养基，37℃，180rpm培养至od
600
＝2.5，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，并分别加或不加1.3g/l pg继续培养4h，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释点板，37℃培养箱中静置培养，待长出菌落后计活菌数，计算存活率。为进一步证明铁离子的影响，我们在额外的有铁培养基中在加入pg前的1h额外添加铁离子螯合剂dfo，并进行点板计算存活率。由图5可知，在pg的条件下处理4h，没有铁离子的培养基中野生型bl21(de3)存活率明显高于有铁培养基。由图6可知，同时加入dfo的培养基中菌株的存活率也明显高于未加dfo的培养基，说明铁离子是pg对大肠杆菌产生毒性所必需的一种物质。
[0161]
为考察h2o2对大肠杆菌的pg耐受性的影响，我们将δsodb菌株按20％分别接种于100ml有铁发酵培养基，37℃，180rpm培养至od
600
＝2.5，分别在加0.3g/l h2o2，1.3g/l pg，同时加0.3g/l h2o2和1.3g/l pg以及两者均不加的条件下继续培养4h，处理前与处理后分别取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，点板。37℃培养箱中静置培养，待长出菌落后计活菌数，计算存活率。由图7可知，同时加0.3g/l h2o2和1.3g/lpg的条件下处理4h，δsodb菌株存活率明显低于只加pg、只加h2o2以及两者均不加的条件。后三种条件下，大肠杆菌的存活
率没有明显差异。katg、kate酶可以分解h2o2，我们过表达katg、kate后pg耐受性得到了提高，说明h2o2是pg对大肠杆菌产生毒性所必需的一种物质。
[0162]
实施例4：铁离子和pg可形成络合物
[0163]
已知铁离子与h2o2会发生芬顿反应产生羟基自由基，同时铁离子可与含酚羟基的化合物salen配体形成络合物促进芬顿反应的ho
·
的产生。由于pg也是一种含有3个羟基的酚类化合物，因此我们考察了铁离子与pg能否反应产生络合物。首先将175mg/lfeso4·
7h2o和0.03％ h2o2混合静置，随后加150mg/l pg混合静置。由图8可知，当无pg时，feso4·
7h2o和h2o2静置后会有沉淀生成，这是由于fe
2+
先被氧化成fe
3+
接着形成fe(oh)3。随后随着pg的加入沉淀逐渐消失，形成均匀的棕色水溶液。该结果表明pg可与fe
3+
形成络合物。
[0164]
实施例5：大肠杆菌中羟基自由基(ho
·
)的测定以及羟基自由基对pg耐受性的影响
[0165]
虽然羟基自由基会对dna造成损伤，但正常情况下，细胞中ho
·
的浓度很低不会对细胞的生长产生影响。为确定铁离子和pg形成的络合物能否促进芬顿反应的发生使得细胞中产生大量的羟基自由基，我们考察了有铁和无铁条件下以及有pg和无pg条件下细菌中羟基自由基的浓度。将2ml过夜培养的e.coli bl21(de3)菌株种子液接种到100ml有铁发酵培养基或无铁发酵培养基中，37℃，180rpm培养至od
600
＝2.5，加或者不加1.3g/l pg，培养4h，各三个平行。分别取1*109细胞利用hydroxyphenyl fluorescein(hpf)羟苯基荧光素(上海懋康生物，cat#mx4804-1mg)测定细胞内羟基自由基。同时按合适的比例梯度稀释菌液，取2μl菌液分别在无抗性lb固体培养基上点板，37℃培养，计算活菌数。由图9可知，当铁离子和pg同时存在时细胞中羟基自由基的含量比其他条件下高230倍左右。表明铁离子和pg形成的络合物会促进芬顿反应的发生使得细胞中积累大量的ho
·
。
[0166]
随后，为考察羟基自由基与细菌对pg耐受性的关系，我们将2ml过夜培养的e.coli bl21(de3)菌株种子液接种到100ml有铁发酵培养基中，37℃，180rpm培养6h，先加入不同浓度(0、0.4％、0.8％)的ho
·
清除剂dmso(biosharp，cat#bs087)，再加入1.3g/l pg继续培养4h，加pg前后分别取菌液进行活菌数检测。由图10可知，dmso可提高pg的耐受性，并且随着dmso浓度的增加，细菌的存活率逐渐增强。表明细胞中ho
·
的浓度影响细菌的生长，铁离子和pg形成的络合物会促进芬顿反应中铁离子催化过氧化氢产生ho
·
，使细胞中过量积累ho
·
从而诱导细胞铁死亡。
[0167]
实施例6：大肠杆菌突变株与野生菌株中rpos蛋白表达水平的比较
[0168]
rna聚合酶sigma因子rpos是细菌中的一种全局性调控因子，可应对多种胁迫压力。rpos蛋白的稳定性主要由rssb和clpx两个蛋白调控，通过实施例2已知δclpx菌株对pg的耐受性显著提高，因此我们考察了δclpx菌株对pg耐受性的改变是否与rpos的表达水平相关。首先将2ml过夜培养e.coli bl21(de3)菌株与δclpx菌株种子液接种到100ml有铁发酵培养基中，37℃，180rpm培养至od
600
＝2.5，加或者不加1.3g/l pg，各三个平行。培养0.5h取5ml菌液离心，沉淀用1.2ml tbs(ph＝7.5)重悬，高压破碎取上清，浓度归一化后利用rpos特异性抗体通过western blot进行检测。由图11可知，野生菌株中几乎检测不到rpos，但δclpx菌株中rpos表达量很高，说明δclpx菌株对pg耐受性的提高主要是因为细胞中rpos表达量的提高，表明rpos可提高大肠杆菌对pg的耐受性。
[0169]
实施例7：大肠杆菌突变株与野生菌株中与rpos依赖的氧化应激相关基因表达水
平的比较
[0170]
铁死亡是一种铁依赖的氧化性细胞死亡，由于铁离子和pg形成的络合物会促进芬顿反应的发生，使得细胞中ho
·
过量从而产生强大的氧化压力，因此我们考察了细胞中部分受rpos调控的与氧化应激相关的基因的表达情况。将2ml过夜培养的e.coli bl21(de3)菌株与δclpx菌株种子液接种到100ml有铁发酵培养基中，每个菌三个平行。37℃，180rpm培养至对数期(od
600
＝1.6)，各取适量菌液利用easyspin plus细菌rna快速提取试剂盒(北京艾德莱，cat#rn4302)提取rna。利用evo m-mlvf反转录试剂盒ii(北京艾德莱，cat#ag11711-s)进行反转录，随后利用特异性引物利用sybr green pro taq hs预混型qpcr试剂盒(北京艾德莱，cat#ag11701)进行rt-pcr测定。uspb所用引物为qpcr-uspbf(5’tgggctttatgtgtcgtttgcattg 3’)和qpcr-uspbr(5’aatggatcgcagttacgcagtacc 3’)；yaia所用引物为qpcr-yaiaf(5’cagagccgatcatcctaaaccagac3’)和qpcr-yaiar(5’cactctttgtcagggtcctcatagc 3’)；bsma所用引物为qpcr-bsmaf(5’gtgttgatgttaagtgcctgtagc 3’)和qpcr-bsmar(5’ggcgaatctcttgcggatggtc 3’)；ygge所用引物为qpcr-yggef(5’ggatggaccgcatattgtcacctc 3’)和qpcr-ygger(5’gccacgttaacttcaatcgcaag3’)；yodb所用引物为qpcr-yodbf(5’ctccgtggctggtttcctaaagg 3’)和qpcr-yodbr(5’cacccaaacgaatatacccgcattg 3’)；ychh所用引物为qpcr-ychhf(5’ggcgtggggtattcaatcctcaac3’)和qpcr-ychhr(5’aacggtcgcacacctgttcatg 3’)。由图12可知，与野生型e.coli bl21(de3)相比，δclpx菌株中一些受rpos蛋白调控的与氧化应激相关的基因表达水平上调，如uspb、yaia、bsma、ygge、yodb以及ychh，说明rpos蛋白提高细菌对pg的耐受性主要是通过提高一些与氧化应激相关基因的表达从而去应对因过量的羟基自由基而产生的氧化压力。
[0171]
实施例8：大肠杆菌工程菌株与野生菌株摇瓶发酵生产pg
[0172]
将1.2ml过夜培养的含有生产质粒pacyc-accadbc-mara-phld的e.coli bl21(de3)菌株q3595与δclpx/δsodb/qmca-fetab(snp)三突变株菌株q4333接种到含有50ml有铁发酵培养基或无铁发酵培养基的摇瓶中，并添加50μg/ml cm。37℃，180rpm培养至od
600
＝0.8，加0.1mm iptg诱导，30℃，180rpm培养，每隔12h添加氨水调节ph保持7.0。培养大约24h停止发酵。使用肉桂醛显色法检测发酵液中pg浓度。乙醇与浓盐酸按体积比3:1混匀，按1:10000比例往混合液滴加肉桂醛配制成显色液。发酵液10000xg离心l min，取5μl上清加入1ml肉桂醛显色液中混匀后，室温下放置反应15min，紫外分光光度计在446nm检测吸光度。由图13可知，在有铁条件下，δclpx/δsodb/qmca-fetab(snp)突变株pg产量由对照菌的0.93
±
0.02g/l提高到了2.53
±
0.05g/l，该实验说明细菌对pg耐受性的提高有利于pg的生物合成。
[0173]
实施例9：有铁离子和无铁离子条件下大肠杆菌对多种酚类耐受性的比较
[0174]
将野生型e.coli bl21(de3)菌株接种于4ml lb中，37℃，180rpm过夜培养，随后按20％分别接种于100ml有铁发酵培养基和无铁发酵培养基中，37℃培养至od
600
＝2.5，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，随后分别加2.5g/l苯酚、2.5g/l间苯二酚、2.5g/l邻苯二酚、4g/l邻苯三酚和0.27g/lβ-萘酚培养5h，取菌液按所需浓度采用10倍逐级稀释，点板。37℃培养箱中静置培养，待长出菌落后计活菌数，计算存活率。由图14可知，在有铁离子和酚类物质存在的条件下处理5h后，大肠杆菌的存活率显著低于无铁离子条件，表明多种酚类
物质均可诱导细菌发生铁死亡。
[0175]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

技术特征：
1.一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株，其特征在于，所述大肠杆菌突变菌株是通过对野生型大肠杆菌采用如下(a1)-(a3)中任意一种或多种基因工程方法进行改造后获得：(a1)敲除超氧化物歧化酶基因sodb；(a2)敲除clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx；(a3)突变铁离子输出蛋白基因fetab起始密码子上游的核苷酸。2.如权利要求1所述的具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株，其特征在于，所述野生型大肠杆菌为e.colibl21(de3)。3.如权利要求1所述的具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因sodb来源于大肠杆菌，genebank id：253977814；所述atp依赖性分子伴侣基因clpx来源于大肠杆菌，genebank id：253976618；铁离子输出蛋白基因fetab来源于大肠杆菌，genebank id：253976670/253976671；更具体的，所述(a3)中，是对feta起始密码子上游60bp处进行突变c
→
g。4.如权利要求1所述的具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株，其特征在于，所述具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株是野生型大肠杆菌在上述突变基础上，过表达荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phld、多重抗性激活因子基因mara和乙酰辅酶a羧化酶基因accadbc中的任意一个或多个。5.如权利要求4所述的具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株，其特征在于，所述荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phld，genebank id：11830552；所述多重抗性激活因子基因mara，来源于大肠杆菌，genebank id：6060688；所述乙酰coa羧化酶基因accadbc，来源于大肠杆菌，其中，亚基acca的genebank id：6062185，亚基accb的genebank id：6058890，亚基accc的genebank id：6058863，亚基accd的genebankid：6059083。6.权利要求1-5任一项所述具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：对野生型大肠杆菌采用如下(a1)-(a3)中任意一种或多种基因工程方法进行改造：(a1)敲除超氧化物歧化酶基因sodb；(a2)敲除clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx；(a3)突变铁离子输出蛋白基因fetab起始密码子上游的核苷酸。7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：(b1)以大肠杆菌bl21(de3)的基因组为模板，通过pcr分别扩增超氧化物歧化酶基因sodb、clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx、铁离子输出蛋白基因fetab的左同源臂、右同源臂；以ptarget质粒为模板通过pcr分别扩增超氧化物歧化酶基因sodb、clpxp蛋白酶复合体中的一种atp依赖性分子伴侣基因clpx、铁离子输出蛋白基因fetab的sgrna；以ptarget质粒为模板通过pcr扩增载体骨架；以pksi-1质粒为模板通过pcr扩增载体骨架；以pmidai质粒为模板通过pcr扩增阿普拉霉素抗性基因表达模块(apmr)；以q3331菌株的基因组为模板，通过pcr扩增铁离子输出蛋白基因fetab突变的片段；(b2)利用基因工程的手段将上述基因sodb、clpx的左同源臂、右同源臂、sgrna、ptarget载体骨架进行重组；利用基因工程的手段将上述基因fetab的左同源臂、右同源臂、sgrna、阿普拉霉素抗性基因表达模块、ptarget载体骨架进行重组；利用基因工程的手段将
上述基因fetab突变片段、pksi-1载体骨架进行重组；分别化学转化到大肠杆菌dh5α中进行复制；(b3)提取重组质粒，利用基因编辑系统对大肠杆菌bl21(de3)基因组的上述任意一种或多种基因进行改造并消除质粒获得突变菌株。8.如权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括以上述突变后的菌株作为宿主制备感受态，将表达质粒pacyc-accadbc-mara-phld导入感受态中获得重组细胞。9.权利要求1-5任一项所述大肠杆菌突变菌株在如下任意一种或多种中的应用：(c1)应对酚类化合物诱导的铁死亡及相关机制研究；(c2)发酵生产间苯三酚。10.如权利要求9所述应用，其特征在于，应用(c1)中，所述酚类化合物包括间苯三酚、苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、邻苯三酚和β-萘酚。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有酚类胁迫耐受性的大肠杆菌突变菌株及其构建方法和应用。该构建方法首次实现以应对酚类诱导铁死亡的方式，提高间苯三酚产量，突变菌株在含铁培养基中对于间苯三酚的耐受性比对照菌株提高了485倍，工程菌在含铁培养基中间苯三酚的产量比对照菌株提高了172％。本发明还提供了一种酚类化合物的杀菌机制，酚类化合物与铁离子形成络合物促进芬顿反应的发生从而使细胞中过量积累羟基自由基，诱导细菌铁死亡。总之，本发明为揭示细菌在酚类化合物的耐受机制的研究奠定了良好的基础，为酚类化合物高效生产菌株的创建提供新思路。合物高效生产菌株的创建提供新思路。合物高效生产菌株的创建提供新思路。


技术研发人员：赵广 隋新悦 王纪超 刘敏
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/7/27