一种通过混合菌种获得金耳子实体的方法与流程

8d，待摇瓶内菌液由百色转变为红色取出备用；
11.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内按体积比1:1混合，置于23-26℃、140-160r/min的摇床上过夜，即可用于接种栽培袋和原种瓶；
12.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.2-0.4％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度19-23℃分别培养23-25天、18-20天即可出现幼耳。
13.本发明所述方法包括如下步骤：
14.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养7-10天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养5-7d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
15.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养5-7d，待摇瓶内菌液由白色转变为红色取出备用；
16.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜，即可用于接种栽培袋和原种瓶；
17.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.2-0.4％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度19-23℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
18.本发明所述专属培养基的配方为：葡萄糖18-28g，蛋白胨1-4g，酵母浸粉1-4g，磷酸二氢钾1-4g，硫酸镁0.5-2.0g，蒸馏水1l。
19.优选的，本发明所述专属培养基的配方为：葡萄糖20-26g，蛋白胨1-3.5g，酵母浸粉1-3g，磷酸二氢钾1-3g，硫酸镁0.6-1.5g，蒸馏水1l。
20.进一步优选的，本发明所述专属培养基的配方为：葡萄糖24-26g，蛋白胨2.5-3.5g，酵母浸粉2-3g，磷酸二氢钾1-2g，硫酸镁0.6-1.0g，蒸馏水1l。
21.更进一步优选的，本发明所述专属培养基的配方为：葡萄糖26g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.6g，纯水1l。
22.本发明中步骤(2)中所述活化的温度为18-28℃，活化时间为4-10d。
23.优选的，本发明步骤(2)中所述活化的温度为20-25℃，活化时间为5-8d。
24.本发明中步骤(3)中所述混合为：按体积比1-2:1混合。
25.优选的，本发明步骤(3)中所述混合为：按体积比1:1混合。
26.本发明的有益效果：
27.1、本发明方法将培养基培养的金耳芽孢与毛韧革菌混合菌种，能够使混合菌液在栽培袋里面18-20天现耳，在原种瓶里面23-25天现耳，其现耳率高，所得金耳子实体质量好。
28.2、本发本方法可以直接用液体菌种接入到栽培料上，出耳后获得菌种f1代(子一代)，用f1代作为原种制备的转接，不仅解决了对传代要求严格、传代次数多以及可能会造成菌种质量降低而引起抗性差、产量受损等问题，还解决现有耗人力、耗时长、耗材多的问题。即可满足一次性纯液体接种要求，也可满足固体制种的菌种来源。
29.3、本发明方法筛选出的最佳培养基配方为：葡萄糖26g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.6g，纯水1l，得到金耳子实体完整，颜色纯正；革菌适中，生长速度
快，在子实体周围的培养料表面无明显黄色分泌物；子实体存活率达到96％。
附图说明
30.图1：传代次数对菌种质量影响图(从左到右依次为：传代1次、传代2次、传代5次、传代6次)
31.图2：转接液体种幼耳至原种瓶天数变化图(从左到右依次为：出耳后转接7d、出耳后转接14d、出耳后转接21d、出耳后转接28d、出耳后转接35d)
32.图3：液体种接至原种瓶内(24d)出耳图
33.图4：液体种接至栽培袋内(20d)出耳图
34.图5：显微镜下的混合菌丝状态图
35.图6：显微镜下的混合菌种形态图
36.图7：金耳芽孢与毛韧革菌液体菌种培养完成后按1：1混合过夜的菌种图
37.图8：液体菌种宏观形态图
具体实施方式
38.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
39.实施例1通过混合菌种获得金耳子实体的方法
40.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养8天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6天，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
41.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在23℃下活化7天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6天，待摇瓶内菌液由白色转变为红色取出备用；
42.上述所述的专属培养基配方为：葡萄糖26g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.6g，蒸馏水1l；
43.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内按体积比1:1混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜；
44.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.3％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度21℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
45.实施例2通过混合菌种获得金耳子实体的方法
46.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养7天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养5天，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
47.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在20℃下活化5天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养5天，待摇瓶内菌液由白色转变为红色取出备用；
48.上述所述的专属培养基配方为：葡萄糖26g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.6g，蒸馏水1l；
49.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内
按体积比1:1混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜；
50.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.2-0.4％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度19℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
51.实施例3通过混合菌种获得金耳子实体的方法
52.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养10天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养7d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
53.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在25℃下活化8天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养7d，待摇瓶内菌液由白色转变为红色取出备用；
54.上述所述的专属培养基配方为：葡萄糖26g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.6g，蒸馏水1l；
55.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内按体积比1:1混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜；
56.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.4％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度23℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
57.实施例4通过混合菌种获得金耳子实体的方法
58.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，23℃黑暗培养5天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，23℃、140r/min培养4d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
59.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在18℃下活化10天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，23℃、140r/min培养4d，待摇瓶内菌液由百色转变为红色取出备用；
60.上述所述的专属培养基配方为：葡萄糖18g，蛋白胨1g，酵母浸粉1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1l；
61.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内按体积比1:1混合，置于23℃、160r/min的摇床上过夜；
62.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.2％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度19℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
63.实施例5通过混合菌种获得金耳子实体的方法
64.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，26℃黑暗培养12天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，26℃、160r/min培养8d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
65.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在28℃下活化4天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，26℃、160r/min培养8d，待摇瓶内菌液由百色转变为红色取出备用；
66.上述所述的专属培养基配方配方为：葡萄糖28g，蛋白胨4g，酵母浸粉4g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁2g，蒸馏水1l；
67.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内
按体积比2:1混合，置于26℃、160r/min的摇床上过夜；
68.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.4％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度23℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
69.实施例6通过混合菌种获得金耳子实体的方法
70.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，24℃黑暗培养6天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，24℃、150r/min培养6d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
71.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在25℃下活化6天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，24℃、150r/min培养6d，待摇瓶内菌液由百色转变为红色取出备用；
72.所述的专属培养基配方为：葡萄糖24g，蛋白胨1.5g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1.0g，蒸馏水1l；
73.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内按体积比1:1混合，置于24℃、150r/min的摇床上过夜；
74.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.3％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度22℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
75.实施例7通过混合菌种获得金耳子实体的方法
76.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养8天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
77.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在23℃下活化7天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6d，待摇瓶内菌液由白色转变为红色取出备用；
78.所述的专属培养基配方为：葡萄糖24g，蛋白胨2.5g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1.4g，蒸馏水1l；
79.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内按体积比1:1混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜；
80.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.3％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度20℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
81.实施例8通过混合菌种获得金耳子实体的方法
82.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养8天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
83.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在23℃下活化7天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6d，待摇瓶内菌液由白色转变为红色取出备用；
84.所述的专属培养基配方为：葡萄糖25g，蛋白胨3g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，蒸馏水1l；
85.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内
按体积比1:1混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜；
86.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.3％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度20℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
87.实施例9通过混合菌种获得金耳子实体的方法
88.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养8天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
89.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在23℃下活化7天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6d，待摇瓶内菌液由白色转变为红色取出备用；
90.所述的专属培养基配方为：葡萄糖24g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉3g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.6g，蒸馏水1l。
91.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内按体积比1:1混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜；
92.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.3％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度20℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
93.实施例10通过混合菌种获得金耳子实体的方法
94.(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养8天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；
95.(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，在23℃下活化7天，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养6d，待摇瓶内菌液由白色转变为红色取出备用；
96.所述的专属培养基配方为：葡萄糖26g，蛋白胨2.5g，酵母浸粉1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1.4g，蒸馏水1l；
97.(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内按体积比1:1混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜；
98.(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.3％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度20℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
99.为了进一步验证本发明的可行性，发明人进行了一系列的实验，如下：
100.一、实验部分
101.1、实验材料与仪器
102.1.1主要试验设备：超净工作台，恒温培养箱，摇床；
103.1.2实验材料：公司自有毛韧革菌菌株及芽孢，保存于4℃冰箱；
104.1.3实验试剂：葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、磷酸二氢钾、硫酸镁(均购自百思生物有限责任公司)。
105.2、实验方法：
106.2.1专用液体培养基的配方筛选试验
107.2.1.1试验1：
108.成分选取试验，设置5个配方，见表1。
109.表1专用液体培养基的配方筛选及结果
[0110][0111][0112]
结果，配方4培养的混合菌种表现最优，出耳质量最好，子实体弹性好，颜色纯正，存活率88％。
[0113]
2.1.2试验2：
[0114]
在试验1的基础上，优化配方4，见表2。
[0115]
表2专用液体培养基的配方4优化筛选及结果
[0116][0117][0118]
结果，得到的配方c综合表现最佳。
[0119]
2.2酵母状芽孢的培养
[0120]
将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养7-10天，将其转入500ml含有上述配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养5-7d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用。
[0121]
2.3毛韧革菌的培养
[0122]
将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有上述配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养5-7d，待摇瓶内菌液由百色转变为红色取出备用。
[0123]
2.4混合菌液的制备
[0124]
将上述两种菌液，在超净工作台内1:1(v/v)混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜，即可用于接种栽培袋和原种瓶。(见图7-图8)
[0125]
2.5结果
[0126]
通过上述方法能够使混合菌液在原种瓶里面23-25天现耳(见图3)，在栽培袋里面18-20天现耳(见图4)，子实体完整，颜色纯正；革菌适中，生长速度快，在子实体周围的培养料表面无明显黄色分泌物；其现耳率高，子实体存活率96％，所得金耳子实体质量好；在培养基中19-21℃培养5天即可使用，显微下的混合菌种可以看见芽孢萌发，呈蝌蚪状，穿插在革菌菌丝中(见图5)；培养好的混合菌种按照培养料干重的0.2-0.4％的接种量接入原种瓶或栽培袋中(见图6)，在温度19-23℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。
[0127]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，23-26℃黑暗培养5-12天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，23-26℃、140-160r/min培养4-8d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，23-26℃、140-160r/min培养4-8d，待摇瓶内菌液由百色转变为红色取出备用；(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内混合，置于23-26℃、140-160r/min的摇床上过夜；(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.2-0.4％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度19-23℃分别培养23-25天、18-20天即可出现幼耳。2.根据权利要求1所述的通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)酵母状芽孢的培养：将酵母状芽孢挑取在pda培养基上，25℃黑暗培养7-10天，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养5-7d，待摇瓶内呈现白色悬浊状备用；(2)毛韧革菌的培养：将毛韧革菌挑取到pda培养基上活化，待菌丝长到培养皿2/3时，将其转入500ml含有专属培养基配方的1000ml三角瓶中，25℃、150r/min培养5-7d，待摇瓶内菌液由白色转变为红色取出备用；(3)混合菌液的制备：将上述培养好的芽孢和毛韧革菌两种菌液，在超净工作台内混合，置于25℃、150r/min的摇床上过夜；(4)出耳：将培养好的混合菌种按照培养料干重的0.2-0.4％的接种量接入原种瓶或栽培袋中，在温度19-23℃分别培养23天、18天即可出现幼耳。3.根据权利要求1或2任一项所述的通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在于，所述专属培养基配方为：葡萄糖18-28g，蛋白胨1-4g，酵母浸粉1-4g，磷酸二氢钾1-4g，硫酸镁0.5-2.0g，蒸馏水1l。4.根据权利要求3所述的通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在于，所述专属培养基配方为：葡萄糖20-26g，蛋白胨1-3.5g，酵母浸粉1-3g，磷酸二氢钾1-3g，硫酸镁0.6-1.5g，蒸馏水1l。5.根据权利要求4所述的通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在于，所述专属培养基配方为：葡萄糖24-26g，蛋白胨2.5-3.5g，酵母浸粉2-3g，磷酸二氢钾1-2g，硫酸镁0.6-1.0g，蒸馏水1l。6.根据权利要求5所述的通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在于，所述专属培养基配方为：葡萄糖26g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.6g，纯水1l。7.根据权利要求1或2任一项所述的通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在于，步骤(2)中所述活化的温度为18-28℃，活化时间为4-10d。8.根据权利要求7所述的通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在于，步骤(2)中所述活化的温度为20-25℃，活化时间为5-8d。9.根据权利要求1或2任一项所述的通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在
于，步骤(3)中所述混合为：按体积比1-2:1混合。10.根据权利要求9所述的通过混合菌种获得金耳子实体的方法，其特征在于，步骤(3)中所述混合为：按体积比1:1混合。

技术总结
本发明提供了一种通过混合菌种获得金耳子实体的方法。所述方法包括：(1)酵母状芽孢的培养；(2)毛韧革菌的培养；(3)混合菌液的制备。将培养基培养的金耳芽孢与毛韧革菌混合菌种做出耳实验，能够使混合菌液在栽培袋里面18-20天现耳，在原种瓶里面23-25天现耳，其现耳率高，所得金耳子实体质量好。通本发明方法可以直接用液体菌种接入到栽培料上，出耳后获得菌种F1代，用F1代作为原种制备的转接可以解决传代问题，即可满足一次性纯液体接种栽培要求，也可满足固体制种的菌种来源。也可满足固体制种的菌种来源。


技术研发人员：李春琴 马布平 李朝东 张静 袁清风 熊誉
受保护的技术使用者：毕节市农投菌业科技有限责任公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/7/27