一种基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料、免疫组化染色试剂盒及其应用

1.本发明属于免疫学检测技术领域，涉及一种基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料、免疫组化染色试剂盒及其应用。


背景技术：

2.免疫学检测是一种基于抗原与抗体特异性结合的实验技术，由于结合效率高、特异性强、操作相对简单等优势在基础科学研究和临床试验中被广泛应用。蛋白质作为生物体细胞中的主要功能的大分子，通过对蛋白质特异性标记靶物质，并通过显微镜可直观地观察疑似病变组织的细胞形态和结构，进一步分析组织发生的病理变化；对组织细胞内的蛋白含量进行定性定量分析，有助于药物靶标的开发。但是对于细胞和组织中含量相对比较低的低丰度靶标，往往由于常规检测方法的检测灵敏度低导致检测失败，这对检测技术提出了更高灵敏度要求。
3.免疫组织化学（immunohistochemistry，ihc）是免疫检测中组织学领域常用的染色技术，免疫组化技术通过应用抗原与抗体特异性结合的原理对抗体进行标记（荧光素、酶、金属离子、同位素），进一步通过镜下显色情况对组织与细胞内抗原（多肽和蛋白质）进行定位、定性研究（危晓莉，彭慧琴，徐恩萍. 精准医学时代对免疫组化的新认识[j].中国免疫学杂志，2020，36(12):3）。免疫组化本质是定性检测方法，但可通过对阳性细胞计数、百分比计数、评分等进行半定量检测。
[0004]
随着免疫组化的发展，需要在组织切片上检测低丰度的靶标分子，低靶标检测和复杂组织环境分析对免疫组化技术提出了新的要求。对于检测低丰度的靶抗原，目前多采用酪胺信号放大技术(tsa，tyramide signal amplification)，是20世纪90年代在传统酶促放大理论基础上发展起来一种新的信号放大技术。它的基本原理是利用酪胺（tyramide）的过氧化物酶反应(在h2o2存在的情况下，酪胺被转化为高反应性和短寿命的自由基活性中间体)，产生大量的酶促产物，该产物能优先与蛋白上富含电子的氨基酸残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的带有荧光素的酪胺沉积，可以结合大量的荧光基团，然后，可以通过各种显色显现技术和/或通过荧光显微术检测共价结合的可检测标记物，可以大幅提高检测灵敏度，诸如在us 5863748、5688966、6372937、cn104714007中描述的应用荧光素-酪胺酰胺(fluorescyl-tyramide)和生物素-酪胺酰胺(biotin-tyramide)来增加来自hrp标记靶蛋白的信号，并可检测到通过传统方法不可检测的低丰度靶标。
[0005]
tsa技术本身存在荧光素浓度及信号的成倍级放大，现有tsa染色技术由于信号放大原理与现有荧光染料叠加使用的酪酰胺荧光材料染色技术，除了会引起靶位信号的放大外，也会不可避免地引起非特异性染色现象的出现，导致染色结果不可解释，染色背景不“干净”，染色效果呈现不佳，因此在临床应用中tsa染色技术并未受到广泛的认可。传统免疫组化石蜡切片经3，3-二氨基联苯胺（dab）染色后可在常规保存条件下放置很长一段时间
也不会褪色，这对免疫组化结果的后续重复检测至关重要。并且现有免疫组化染色技术在手工操作时步骤多、耗时长，重复的清洗步骤增加了操作难度，并且清洗次数过多也会增加组织脱片的风险，现有的显色底物或荧光底物都不能实现“免清洗”。
[0006]
针对免疫组化的tsa染色技术和传统dab染色技术存在的一系列问题，寻找一种优异的酪酰胺荧光材料来解决现有tsa染色技术中所引起的非特异染色现象具有重要意义。


技术实现要素：

[0007]
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光染色体系、免疫组化染色试剂盒及其在免疫荧光组化染色中的应用，特别是提供tsa酶催化信号放大技术的聚集诱导发光化合物在免疫荧光组化染色中的应用。
[0008]
本发明提出了一种连接有酪胺基团的聚集诱导发光（aggregation-induced emission,aie）材料，它是一种具有特殊光学性能的荧光材料，这类新型荧光染料在溶液中发光十分微弱甚至不发光，但是在聚集状态下荧光急剧增强，使其具有抗光漂白能力强、荧光量子产率高等优点。在本发明中，连接有酪胺基团的聚集诱导发光材料经抗体和/或链霉亲和素上的hrp酶在有h2o2的存在下，可快速发生酶催化的反应形成高反应活性中间体，经活化后的酪胺aie荧光团迅速与周围抗体/蛋白上的氨基酸残基发生共价结合，致使aie荧光团通过酪酰胺与目标抗原产生牢固的共价结合位点，进而成倍放大石蜡组织切片中的目标分子处的荧光信号，使得底物在高浓度环境下使用时荧光信号大幅增强，并且由于所述aie荧光材料在没有hrp酶催化时荧光信号很弱，在组织切片上不会产生非特异性吸附染色，进而可以实现在底物染色完毕后的“免清洗”步骤，减少了洗涤次数，节省了染色操作时间，最大限度的保证了组织的完整度。并且在染色过程中无需防淬灭处理，简化操作步骤，提升染色质量和成像效果。
[0009]
进一步地，本发明通过抗体上的或链霉亲和素上的hrp在有过氧化氢存在的环境下将带有标记aie荧光团的非活化的酪酰胺转变成活化的酪酰胺，活化的酪酰胺迅速与相接蛋白分子的富含电子区域（酪氨酸残基）进行稳定的共价结合，借此实现对抗原的特异性标记染色。由于相接的蛋白含有大量的酪氨酸结合位点，所以目标抗原处会富集大量标记aie荧光分子，使信号被有效放大，该方法可以解决现有免疫荧光组化在使用过程中可能会出现的非特异性染色的问题，提升染色质量和成像效果。
[0010]
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：一种基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料，结构式如下:其中，aie代表聚集诱导发光基团，l代表接头（最右侧为酪酰胺基团）。
[0011]
优选的，所述接头为脂族基团接头、杂脂族基团接头或者具有取代或未取代的烷基链接头；优选地，所述一类接头为脂族基团化合物，诸如具有一个或者多个不饱和位点的脂族烃链或者烷基链。脂族烃链也典型地包括末端官能团，包括例如但不限于羰基反应基
团、胺反应基团、巯基反应基团或者光反应基团，其有助于与可检测部分的化合物偶联。
[0012]
优选地，所述一类接头为烯基氧化物。所述烯基氧化物诸如二醇、乙二醇为代表。随着氧原子数目的增加，化合物的亲水性也可增加。因此，本公开的接头典型地具有式(-och2ch2o-)n，其中n为约2至10。
[0013]
优选地，所述一类接头为“低级烷基”，是指具有1至6个碳原子，优选1至4个碳原子的烷基。烷基中的取代基的实例包括羟基、氰基、烷氧基，羰基、卤素、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基、胺、酰胺和硫醚。
[0014]
优选的，所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的激发波长为360nm-600 nm（例如360nm、400 nm、430 nm、450 nm、480 nm、510 nm、550 nm或600 nm），发射波长为450nm-700nm（例如450nm、510 nm、550 nm、600 nm、650 nm、680 nm或700 nm）。
[0015]
进一步优选地，所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料在共聚焦显微镜下使用时荧光波长可设置为：固定激发波长450nm，发射波长为550nm-700nm。
[0016]
优选的，所述基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料选自如下结构式a-式k中的至少一种：少一种：少一种：少一种：少一种：少一种：少一种：少一种：少一种：
其中，r1，r2，r3和r4各自独立地选自氢、羟基、氰基、烷氧基、卤素、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基、胺基、取代或未取代的c3-c30氮杂芳基、取代或未取代的c6-c30含氰基芳基、取代或未取代的c3-c30含氰基杂芳基、取代或未取代的c6-c30含卤素芳基、取代或未取代的c3-c30含卤素杂芳基、取代或未取代的c1-c20烷基、取代或未取代的c1-c20烯基、取代或未取代的c2-c20烷氧基、取代或未取代的c6-c30芳基、取代或未取代的c3-c30杂芳基中的任意一种。
[0017]
所述取代的c3-c30氮杂芳基、取代的c6-c30含氰基芳基、取代的c3-c30含氰基杂芳基、取代的c6-c30含卤素芳基、取代的c3-c30含卤素杂芳基、取代的c1-c20烷基、取代的c1-c20烯基、取代的c2-c20烷氧基、取代的c6-c30芳基、取代的c3-c30杂芳基中的取代基为卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基。
[0018]
所述烷氧基、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基的碳原子数为1至20个。
[0019]
优选的，所述基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料选自式（一）-式（十一）中的至少一种：少一种：少一种：
[0020]
一种基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的免疫组化染色试剂盒，包括上述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料。
[0021]
优选的，所述免疫组化染色试剂盒包括抗靶抗原的单克隆抗体（针对靶抗原的第一检测抗体）、生物素标记的二抗（抗第一检测抗体的第二抗体）、hrp标记的链霉亲和素、基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的底物液；优选的，所述免疫组化染色试剂盒包括抗靶抗原的单克隆抗体、hrp酶标记的二抗、基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的底物液；进一步优选的，所述免疫组化染色试剂盒还包括一些主要辅助成分，诸如：dapi工作液、内源性hrp酶阻断剂、蛋白封闭液等。
[0022]
优选的，所述免疫组化染色试剂为免洗免疫组化染色试剂，染色处理后不需要进
行清洗；所述免疫组化染色试剂中的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料为式a、式b、式f或式h。
[0023]
上述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的免疫组化染色试剂盒在免疫组化染色中的应用。
[0024]
优选的，所述免疫组化染色包括基于亲和素-生物素的免疫组化染色（sabc法）和间接法免疫组化染色；进一步优选的，所述亲和素为链霉亲和素或卵白素；进一步优选的，所述免疫组化染色中的靶抗原为生物组织样本中的任何类型的分子，包括蛋白质、半抗原、糖、脂质、激素、复杂碳水化合物（如多糖）、磷脂、核酸等。
[0025]
更优选的，所述免疫组化染色中的靶抗原为cea（癌胚抗原）、ca19-9（糖类抗原19-9）、ca125（糖类抗原125）、cga（嗜铬粒蛋白a）、her-2（人类表皮生长因子受体-2）、psma（前列腺癌特异性膜抗原）、p-糖蛋白（p-gp）、谷光甘肽s转移酶（gst π）、拓扑异构酶ⅱ（topoⅱ）、雌激素受体（er）、孕激素受体（pr）、c-erbb-2（癌基因产物）、ki-67（细胞增殖指数）、pcna（增殖细胞核抗原）、p53、e-cae（钙粘附蛋白）、ps2（雌激素调节蛋白）、heppar 1（肝细胞抗原）、villin（绒毛蛋白）、mrp1（多药耐药相关蛋白1）、ts（胸苷合成酶）、syn（突触素）、s-100、nse、ema（上皮膜抗原）、vim（波形蛋白）、sma（平滑肌肌动蛋白）、msa（肌特异性肌动蛋白）、nestin、ost（成骨素）、aat（抗胰蛋白酶）、gfap（胶质纤维酸性蛋白）、tg（甲状腺球蛋白）、ph（甲状旁腺素）、n-myc、tga72（肿瘤相关抗原72）、ga733（肿瘤相关抗原）、ttf-1（甲状腺转录因子-1）等；靶抗原为cd系列抗原，如：cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd10、cd13、cd15、cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd30、cd31、cd33、cd34、cd35、cd36、cd38、cd43、cd45ro、cd54、cd56、cd57、cd61、cd63、cd64、cd68、cd71、cd72、cd74、cd75、cd91、cd95、cd99、cd117、cd123、cd133、cd136、cd138、cd146、cd163、cd166、cd171、cd200、cd271、cd335、cd79a、cd95l、cd235a、cd45ra、cd45ro等。靶抗原为细胞角蛋白ck系列抗原，如：ck1、ck4、ck5、ck7、ck8、ck10、ck13、ck15、ck17、ck18、ck19、ck20、ck-mm、ck5/6、ck-hmw、ck-lmw、ck-pan（oscar）等。
[0026]
最优选地，所述免疫组化染色中的靶抗原为cea、ck-7、ck-20、ki-67。
[0027]
优选地，所述的生物样本可以是获自任何器官或组织的样本，包括活检或尸检样本，诸如肿瘤活检；或者可以从被怀疑具有病症，诸如遗传异常、感染或瘤形成的受试者获得样品；或者可以来自不具有遗传异常、疾病、病症等的正常组织样本；进一步优选的，所述免疫组化染色的组织切片为实体瘤组织和正常组织；更优选地，所述实体瘤组织包括但不限于：肉瘤和癌瘤的实例包括纤维肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴样恶性肿瘤等；癌瘤包括胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和神经系统肿瘤(诸如神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
[0028]
进一步优选的，所述基于亲和素-生物素的免疫组化染色（sabc法）包括以下步骤：将组织切片预处理，向预处理后的组织切片上加入抗靶抗原的单克隆抗体进行孵
育，而后加入生物素标记的二抗进行孵育，然后加入hrp标记的链霉亲和素进行孵育，然后加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液进行孵育，最后进行复染封片；更优选的，所述向预处理后的组织切片上加入抗靶抗原的单克隆抗体进行孵育的操作为：向预处理后的组织切片中央区域加入抗靶抗原的单克隆抗体工作溶液，在2~8℃过夜孵育12~24h；所述抗靶抗原的单克隆抗体工作溶液为抗靶抗原的单克隆抗体浓缩液溶解在缓冲液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0（例如7.0、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0）；所述抗靶抗原的单克隆抗体工作溶液中单克隆抗体浓缩液与缓冲液的体积比为1：50-1000；例如1:50、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900或1:1000。
[0029]
所述生物素标记的二抗为生物素标记的羊抗兔igg抗体或生物素标记的羊抗鼠igg抗体；所述生物素标记的二抗中生物素的标记数量为3-5个；例如3个、4个或5个。
[0030]
所述加入生物素标记的二抗进行孵育的操作为：向抗靶抗原的单克隆抗体孵育后的组织切片上加入生物素标记的二抗溶液，室温孵育30-60 min（例如30 min、40 min、45 min、50 min、55 min或60 min）；所述生物素标记的二抗溶液为生物素标记的二抗溶解在缓冲液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0（例如7.0、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0）；所述生物素标记的二抗溶液中生物素标记的二抗工作液的浓度为1~20μg/ml（例如1μg/ml、5μg/ml 、10μg/ml、15μg/ml或20ug/ml）；所述加入hrp标记的链霉亲和素进行孵育的操作为：向生物素标记的二抗孵育后的切片上加入hrp标记的链霉亲和素溶液，室温孵育20-60 min（例如20 min、30 min、40 min、50 min或60 min）；所述hrp标记的链霉亲和素溶液为hrp标记的链霉亲和素溶解在缓冲液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0（例如7.0、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0）；所述hrp标记的链霉亲和素溶液中hrp标记的链霉亲和素工作液的浓度为1~20μg/ml；（例如1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml或20μg/ml ）。
[0031]
所述的加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液进行孵育的操作为：加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液，在室温孵育5-20min（例如5 min、10 min、15 min、20 min）；所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液为基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料溶解在缓冲液和有机相溶液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0（例如7.0、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0），所述的有机相的体积含量为0-40%，所述有机相为二甲基亚砜（dmso）或n,n-二甲基甲酰胺（dmf）；所述预混液中基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的浓度为100-500μm（例如100
μm、200μm、300μm、400μm或500μm），信号激发剂的质量浓度为0.001-0.01%（例如0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%和0.01%）；所述的信号激发液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述信号激发液的溶剂为水，所述信号激发液的质量浓度为0.001-0.01%；所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液的配制具体为：将信号激发液加入到基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液中；所述复染封片具体为：用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）水溶液复染胞核5-10 min（例如5 min、6 min、7 min、8 min、9 min或10 min），然后滴加中性树胶封片液于组织切片上，盖上盖玻片；所述4',6-二脒基-2-苯基吲哚水溶液的浓度为0.5-10 μg/ml 。例如0.5 μg/ml 、1 μg/ml 、2 μg/ml、3 μg/ml、4 μg/ml、5 μg/ml、6 μg/ml、7 μg/ml、8 μg/ml、9 μg/ml或10 μg/ml。
[0032]
进一步优选的，所述间接法免疫组化染色包括以下步骤：将组织切片预处理，向预处理后的组织切片上加入抗靶抗原的单克隆抗体工作液进行孵育，而后加入hrp酶标记的二抗进行孵育，然后加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液，最后进行复染封片；在本发明中间接法免疫组化染色方法中加入一抗（抗靶抗原的单克隆抗体）的操作与上述基于亲和素-生物素的免疫组化染色相同，在此不再赘述。
[0033]
更优选的，所述hrp酶标记的二抗为羊抗兔igg抗体或羊抗鼠igg抗体；所述加入hrp酶标记的二抗进行孵育的操作为：加入hrp酶标记的二抗工作溶液，室温孵育30-60 min（例如30 min、40 min、45 min、50 min、55 min或60 min）；所述hrp酶标记的二抗工作溶液为hrp酶标记的二抗浓缩液溶解在缓冲液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0（例如7.0、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0）；所述hrp酶标记的二抗工作溶液中hrp酶标记的二抗工作液的浓度为1~20μg/ml（例如1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml或20μg/ml）。
[0034]
在本发明中间接法免疫组化染色方法中加入标记aie荧光团的酪酰胺底物溶液和信号激发液的预混液孵育和复染、复染封片的操作与上述基于亲和素-生物素的免疫组化染色（sabc法）方法相同，在此不再赘述。
[0035]
进一步优选的，所述基于亲和素-生物素的免疫组化染色中组织切片预处理的过程包括烤片、脱蜡水化、微波抗原修复、内源性过氧化物酶位点封闭、内源性生物素封闭和非特异性位点封闭；所述间接法免疫组化染色中组织切片预处理的过程包括烤片、脱蜡水化、微波抗原修复、内源性过氧化物酶位点封闭和非特异性位点封闭。
[0036]
更优选地，所述烤片为将石蜡切片面朝上放置，置于55-65℃（55℃、58℃、60℃、63℃或65℃）的恒温烤箱中烤片60-120 min（例如60 min、70 min、80 min、100 min、110 min或120 min），而后恢复室温。
[0037]
更优选地，所述脱蜡水化为：将烤片后的石蜡切片置于新鲜的脱蜡透明液中，浸泡1次，每次10-20min，然后换新鲜的脱蜡液浸泡1次，每次10-20 min；接着置于无水乙醇中，
浸泡3-5min；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡3-5min；接着置于85%乙醇中，浸泡3-5 min；接着置于75%乙醇中，浸泡3-5min；最后放入pbst（1
×
pbs磷酸盐缓冲液，含0.05%tween-20）漂洗3-5分钟。
[0038]
更优选地，微波抗原修复为：将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，整体浸入抗原修复液中，放入微波炉，先高火加热3-5min至抗原修复液沸腾，然后转为中低火或中火继续沸腾10-20min，然后静置5min，待锅中液体自然冷却至室温取出切片。所述抗原修复液为1mm edta溶液（ph8.0）或10mm柠檬酸钠修复液（ph6.0，含有0.05%吐温-20）。
[0039]
更优选地，所述内源性过氧化物封闭为：向切片目标区域滴加内源性过氧化物酶阻断剂（完全覆盖组织样品区），湿盒室温孵育10-30 min。完成后放入pbst中浸洗3次，每次3min。
[0040]
更优选地，所述sabc法还需进行内源性生物素封闭，具体过程为：向抗原修复后的切片目标区域滴加卵白素（试剂1），湿盒中室温孵育10-20min。完成后放入pbst中浸洗3次，每次3min；接着向切片目标区域滴加d-生物素溶液（试剂2），湿盒中室温孵育10-20min。完成后放入pbst中浸洗3次，每次3min。
[0041]
更优选地，所述非特异性位点封闭的过程为：向内源性生物素封闭后的切片目标区域滴加2%-5% bsa或1%-10%羊血清，湿盒中室温孵育30-60min，封闭非特异性位点，完成后尽量吸走或甩干液体。
[0042]
作为优选技术方案，本发明所述基于亲和素-生物素的免疫组化染色（sabc法）包括以下步骤：（i）组织切片预处理；（ii）向预处理后的组织切片上加入cea单克隆一抗的缓冲溶液，溶液中一抗与缓冲液的体积比为1：50-1000，在2~8℃孵育过夜12~24h；（iii）向一抗孵育后的切片上加入生物素标记二抗的缓冲溶液，溶液中生物素标记二抗工作液的浓度为10μg/ml，湿盒中室温孵育30-60 min；（iv）加入hrp标记的链霉亲和素溶液，室温孵育30-60 min，其中所述hrp标记的链霉亲和素溶液的浓度为10μg/ml；（v）加入标记aie荧光团的酪酰胺底物溶液和信号激发液的预混液，室温孵育5-20min，其中所述标记aie荧光团的酪酰胺底物溶液浓度为100-500um，含有机相dmso或dmf比例为0-40%，信号激发液中过氧化氢溶液终浓度为0.001-0.01%；（ⅵ）用dapi水溶液复染胞核5-10 min，然后滴加中性树胶封片液于组织切片上，盖上盖玻片进行封片。
[0043]
作为优选技术方案，本发明所述间接法免疫荧光组化染色包括以下步骤：（1）组织切片预处理；（2）向预处理后的组织切片上加入cea单克隆一抗的缓冲溶液，溶液中一抗与缓冲液的体积比为1：50-1000，在4℃孵育12~24h；（3）加入hrp酶标记的羊抗鼠igg二抗溶液，室温孵育30-60 min，其中所述hrp酶标记的羊抗鼠igg二抗的浓度为10μg/ml；（4）加入标记aie荧光团的酪酰胺底物溶液和信号激发液的预混液，室温孵育5-20min，其中所述标记aie荧光团的酪酰胺底物溶液浓度为100-500um，含有机相dmso或dmf
比例为0-40%，信号激发液中过氧化氢溶液终浓度为0.001-0.01%；（5）用4',6-二脒基-2-苯基吲哚水溶液（dapi）复染胞核5-10 min，然后滴加中性树胶封片液于组织切片上，盖上盖玻片进行封片。
[0044]
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：本发明通过标记aie荧光团的酪酰胺的信号放大技术，并且分别使用了生物素-链霉亲和素体系和间接法体系，相比现有的tsa染色技术中的酪酰胺荧光染料由于在溶液中始终具有较高的荧光亮度，正是由于在水溶液中传统酪酰胺荧光染料也具有较高的亮度进而引起非特异性染色现象的出现，而aie酪酰胺荧光染料可以在水溶液中几乎不发光，只有在靶位处才生成聚集诱导发光的现象并形成染色信号，这进一步解决了现有免疫荧光组化在tsa技术使用过程中可能会出现的非特异性染色现象等问题，使用上述的aie酪胺荧光化合物进行的免疫荧光染色，不会出现非特异性染色现象，背景干净、成像效果好；并一定程度上减少抗体使用量，还可以实现“免洗”操作，减少洗涤次数、防止了组织脱片及抗原丢失的风险，并节省染色时间。在染色过程中不需要全程避光和防淬灭处理，简化了操作步骤，染色完毕后的切片保存时间更长，成像效果佳，背景干净，在检测低丰度抗原时更灵敏，检测结果更稳定。本技术方案仅用于非疾病诊断领域，如纯用于科学研究的免疫组化染色。
附图说明
[0045]
图1是基于aie-tsa的免疫荧光组化染色间接法和sabc法原理图；图2是基于aie分子式一用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式一通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图3是基于aie分子式一用于免疫荧光组化间接法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式一通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图4是基于分子式一进行的用于免疫荧光组化间接法检测结肠癌组织ki-67抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式一通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图5是基于aie分子式二用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式二通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图6是基于aie分子式三用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式三通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图7是基于aie分子式四用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式四通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图8是基于aie分子式五用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式五通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；
图9是基于aie分子式六用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式六通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图10是基于aie分子式七用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式七通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图11是基于aie分子式八用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式八通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图12是基于aie分子式九用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式九通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图13是基于aie分子式十用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式十通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图14是基于aie分子式十一用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式十一通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图15是基于aie分子式一进行的用于免疫荧光组化间接法检测正常结肠组织ki-67抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式一通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图16是基于aie分子式二进行的用于免疫荧光组化间接法检测正常结肠组织ki-67抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式二通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图17是基于aie分子式六进行的用于免疫荧光组化间接法检测正常胃肠道组织ck-7抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式六通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图18是基于aie分子式八进行的用于免疫荧光组化间接法检测正常胃肠道组织ck-20抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式八通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图19是基于cy5-tsa用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是cy5-tsa通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图20是基于cy5-tsa用于免疫荧光组化间接法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是cy5-tsa通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图21是基于cy5-tsa进行的用于免疫荧光组化间接法检测结肠癌组织ki-67抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是cy5-tsa通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；
图22是基于aie分子式三进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式三通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图23是基于aie分子式四进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式四通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图24是基于aie分子式五进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式五通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图25是基于aie分子式七进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式七通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图26是基于aie分子式九进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式九通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图27是基于aie分子式十进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式十通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图28是基于aie分子式十一进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式十一通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图29是基于aie分子式一进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片和利用cy5-tsa进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片的荧光信号损失率图；图30是放置30天后的aie分子式一和传统cy5-tsa用于检测肝癌组织cea抗原的sabc法免疫荧光组化染色后的共聚焦显微镜图；其中a是aie分子式一通道下的免疫荧光染色图；b是dapi荧光通道下的荧光图，c是二者融合图像；图d是传统荧光染料cy5-tsa通道染色图；e是dapi荧光通道下的染色图；f是二者融合图像。
具体实施方式
[0046]
下面结合实施例对本发明进行具体地描述，但本发明的实施方式和保护范围不限于以下实施例。
[0047]
实施例1：（1）aie分子式一的合成中间体01的合成：
称取原料a（0.18mmol，0.075g），原料b（0.74mmol，0.200g）置于20ml反应瓶中，100℃反应6h。待冷却至室温，用dcm稀释后，制备薄层色谱法纯化，得到中间体01（产率67.1%）。
[0048]
中间体02的合成：称取原料01（0.13mmol，0.082g）溶于3ml dcm中，缓慢滴加tfa（3ml），室温搅拌1h。待反应完全后，减压旋干，再用dcm稀释，用饱和碳酸氢钠溶液调节ph=7~8，用dcm萃取3次，减压旋干，得到粗品中间体02（产率61%）。
[0049]
产物分子式一的合成：称取中间体02（0.072mmol，0.046g），原料c（0.108mmol，0.015g）共同溶于3ml dmf中，0℃条件下，加入hatu（0.108mmol，0.041g），搅拌均匀后，加入1ml diea，室温搅拌过夜。lc-ms跟踪反应完成后，加水猝灭反应，用ea萃取3次，饱和碳酸氢钠洗涤有机相，无水硫酸钠干燥后浓缩，再用dmf重新溶解，经制备薄层液相色谱（甲酸水-甲醇体系）纯化、冻干得到
aie分子式一（产率51.2%）。
[0050]
（2）利用分子式一进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体包括如下步骤：1. 烤片：将石蜡切片组织块朝上放置，置于60℃的恒温烤箱中烤片60min，结束后缓慢恢复室温。
[0051]
2．脱蜡水化：石蜡切片置于新鲜的脱蜡透明液-二甲苯中，20min/次，然后换新鲜的二甲苯15min/次；接着置于无水乙醇中，浸泡5min；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡5min；接着置于85%乙醇中，浸泡5min；接着置于75%乙醇中，浸泡5min；放入pbst（1
×
pbs缓冲液，含有0.05%tween-20）漂洗5min。
[0052]
3．抗原修复：将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，整体浸入带有烧杯的抗原修复液（1mm edta，ph=8.0）中一起放入微波炉，先高火加热3min至抗原修复液沸腾，然后转为中低火或中火继续沸腾13min，然后静置5min即可。待锅中液体自然冷却至室温取出切片；用免疫组化笔绕着组织样品区域画圈，静置30s后放入pbst漂洗5分钟。
[0053]
4．内源性过氧化物酶位点封闭：向切片目标区域滴加50~100μl内源性过氧化物酶封闭液（该试剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司，型号为：zli-9311），湿盒室温孵育20min。完成后放入pbst中浸洗3次，每次3min。
[0054]
5．内源性生物素封闭：
①
向切片目标区域滴加50~100μl卵白素溶液（试剂1），该试剂购于福州迈新生物技术有限公司，型号为：blk-0002，湿盒室温孵育15min。完成后放入pbst中浸洗3次，每次3min。
[0055]
②
向切片目标区域滴加50~100μl d-生物素溶液（试剂2）(购于福州迈新生物技术有限公司，型号为：blk-0002)，湿盒室温孵育15min。完成后放入pbst中浸洗3次，每次3min。
[0056]
6．非特异性位点封闭：向切片目标区域滴加50~100μl的10%羊血清(购于福州迈新生物技术有限公司，型号为：sp kit-b2)，湿盒室温孵育30min，封闭非特异性位点，完成后尽量吸走或甩干液体。
[0057]
7．向切片目标区域滴加50~100μl的cea单克隆抗体工作液（该试剂浓缩液购于福州迈新生物技术有限公司，货号为：kit-0008），稀释比例为1：500（稀释剂为1
×
pbs），空白试剂对照选用1
×
pbs代替一抗，4℃过夜孵育16h。孵育完成后pbst清洗3次，每次5min。
[0058]
8. 向切片目标区域滴加50~100μl生物素标记羊抗鼠igg抗体工作液（该试剂浓缩液购于北京博奥森生物技术有限公司，型号为：bs-0296g-bio），工作浓度为10ug/ml，室温孵育40min，孵育完成后pbst清洗3次，每次5min。
[0059]
9. 向切片目标区域滴加50~100μl的hrp标记的链霉亲和素工作液（该试剂浓缩液购于北京博奥森生物技术有限公司，型号为：bs-0437p-hrp），工作浓度为10ug/ml，室温孵育30min，孵育完成后pbst清洗3次，每次5min。
[0060]
10．向切片目标区域滴加50~100μl的200μm浓度的aie化合物一底物液与信号激发液的预混液，该化合物预混液溶液具体配方为表1：表1
室温孵育10min，孵育完成后pbst清洗3次，每次5min。
[0061]
11．用dapi（购于上海碧云天生物，型号为：c1002）的工作浓度为5μg/ml复染胞核7min，pbst清洗2次，每次5min。
[0062]
12．向切片目标区域滴加滴加1~2滴中性树胶封片液（购于北京索莱宝科技有限公司，型号为g8590）于组织切片上，盖上盖玻片，让切片充分接触封片液，尽量避免气泡。
[0063]
13．共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为450nm，发射波长范围设置为550-650nm。
[0064]
其中，添加试剂步骤可概括为下表2所示：表2通过national institutes of health开发的image j软件对免疫组化结果进行定量，主要通过细胞阳性着色程度进而确定抗原含量，通过染色荧光强度和染色阳性范围进行评分[弱阳性(+，指阳性细胞总数在25%以下）；中等阳性(++，指阳性细胞总数在25%—49%)；强阳性(+++，指阳性细胞总数在50%以上)]，最终通过自动化评分给出阳性评判标准，对肝癌病理切片cea染色进行抗原丰度计数；同时，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表3结果：表3
。
[0065]
实施例2：利用分子式一进行的用于免疫荧光组化间接法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体包括如下步骤：该实施例中石蜡切片预处理过程：烤片、脱蜡水化、抗原修复、内源性过氧化物酶位点封闭、非特异性位点封闭、一抗添加及孵育操作、aie化合物一底物液与信号激发液的预混底物液添加及孵育操作、复染操作过程均与上述实施例一相同，添加试剂步骤可用如下表格进行表4示：表4完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为450nm，发射波长范围设置为550-650nm。
[0066]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表5结果：表5。
[0067]
实施例3：利用分子式一进行的用于免疫荧光组化间接法检测结肠癌组织ki-67抗原的染色方法，具体包括如下步骤：该实施例中石蜡切片预处理过程：烤片、脱蜡水化、抗原修复、内源性过氧化物酶
位点封闭、非特异性位点封闭、一抗添加及孵育操作、aie化合物一底物液与信号激发液的预混底物液添加及孵育操作、复染操作过程均与上述实施例一相同，添加试剂步骤可用如下表格进行表6示：表6完成后用共聚焦荧光显微镜的高倍视野（40
×
）进行拍照观察，固定激发波长设置为450nm，发射波长范围设置为550-650nm。
[0068]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量计数阳性细胞占整张切片同类型细胞总数的占比，并用ki-67细胞增值指数进行统计，得出如下表7结果：表7。
[0069]
实施例4：（1）aie分子式二的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：（2）利用分子式二进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表8表示：表8
添加aie化合物二底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表9表示：表9完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0070]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表10结果：表10。
[0071]
实施例5：（1）aie分子式三的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：
（2）利用分子式三进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表11表示：表11添加aie化合物三底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表12表示：表12完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为440nm，发射波长范围设置为580-700nm。
[0072]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均
荧光强度进行定量统计，得出如下表13结果：表13。
[0073]
实施例6：（1）aie分子式四的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：（2）利用分子式四进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表14表示：表14添加aie化合物四底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表15表示：表15
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为580-700nm。
[0074]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表16结果：表16。
[0075]
实施例7：（1）aie分子式五的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：利用分子式五进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表17表示：表17
添加aie化合物五底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表18表示：表18完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0076]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表19结果：表19。
[0077]
实施例8：（1）aie分子式六的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：
（2）利用分子式六进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表20表示：表20添加aie化合物六底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表21表示：表21完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为480nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0078]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表22结果：表22。
[0079]
实施例9：（1）aie分子式七的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：（2）利用分子式七进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表23表示：表23添加aie化合物七底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表24表示：表24
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0080]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表25结果：表25。
[0081]
实施例10：（1）aie分子式八的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：（2）利用分子式八进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表26表示：表26
添加aie化合物八底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表27表示：表27完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0082]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表28结果：表28。
[0083]
实施例11：（1）aie分子式九的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：
（2）利用分子式九进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表29表示：表29添加aie化合物九底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表30表示：表30完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0084]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表31结果：表31。
[0085]
实施例12：（1）aie分子式十的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：
（2）利用分子式十进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表32表示：表32表32添加aie化合物十底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表33表示：表33完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0086]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表34结果：表34。
[0087]
实施例13：（1）aie分子式十一的合成如下（具体制备过程参考实施例1）：（2）利用分子式十一进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同，不同点在于添加量及浓度，可用如下表35表示：表35
添加aie化合物十一底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表36表示：表36完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0088]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表37结果：表37
[0089]
实施例14：利用分子式一进行的用于免疫荧光间接法检测正常结肠组织ki-67抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例二均相同，不同点在于添加量及浓度，以及在添加aie预混液一进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液；在对照中底物染色完毕后正常清洗，然后再加复染液复染。可用如下表38表示：添加aie化合物一底物液与信号激发液的配方及成分与实施例一完全相同，不同点在于添加aie预混液一进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液；在对照中底物染色完毕后正常清洗，然后再加复染液复染。
[0090]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0091]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均
荧光强度进行定量统计，得出如下表39结果：表39
[0092]
实施例15：利用分子式二进行的用于免疫荧光间接法检测正常结肠组织ki-67抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例二均相同，不同点在于添加量及浓度，以及在添加aie预混液二进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液；在对照中底物染色完毕后正常清洗，然后再加复染液复染。可用如下表40表示：表40添加aie化合物二底物液与信号激发液的配方及成分与实施例三完全相同，不同点在于添加aie预混液二进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液；在对照中底物染色完毕后正常清洗，然后再加复染液复染。
[0093]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0094]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表41结果：表41
[0095]
实施例16：利用分子式六进行的用于免疫荧光间接法检测正常胃肠道组织ck-7抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例二均相同，不同点在于添加量及浓度，以及在添加aie预混液六进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液；在对照中底物染色完毕后正常清洗，然后再加复染液复染。可用如下表42表示：表42添加aie化合物六底物液与信号激发液的配方及成分与实施例七完全相同，不同点在于添加aie预混液六进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液；在对照中底物染色完毕后正常清洗，然后再加复染液复染。
[0096]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0097]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表43结果：表43
[0098]
实施例17：利用分子式八进行的用于免疫荧光间接法检测正常胃肠道组织ck-20抗原的染色
方法，具体操作步骤与上述实施例二均相同，不同点在于添加量及浓度，以及在添加aie预混液八进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液；在对照中底物染色完毕后正常清洗，然后再加复染液复染。可用如下表44表示：表44添加aie化合物八底物液与信号激发液的配方及成分与实施例九完全相同，不同点在于添加aie预混液八进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液；在对照中底物染色完毕后正常清洗，然后再加复染液复染。
[0099]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0100]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表45结果：表45对比例1：利用cy5-tsa进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例一均相同（当使用cy5-tsa染料时，需注意在滴加完染料后的孵育过程中全程保持避光处理，如放置在暗室进行孵育以及在清洗过程中也需要暗室背景，最大程度避免cy5-tsa荧光染料的淬灭），可用如下表46表示：表46
添加cy5-tsa底物液与信号激发液的配方及成分，可用下表47表示：表47完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为640nm，发射波长范围设置为660-700nm。
[0101]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表48结果：表48
[0102]
对比例2：利用cy5-tsa进行的用于免疫荧光间接法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例二均相同（当使用cy5-tsa染料时，需注意在滴加完染料后的孵育过程中全程保持避光处理，如放置在暗室进行孵育以及在清洗过程中也需要暗室背景，最大程度避免cy5-tsa荧光染料的淬灭），可用如下表49表示：表49
添加cy5-tsa底物液与信号激发液的配方及成分与上述对比例相同，再次不再赘述。
[0103]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为640nm，发射波长范围设置为660-700nm。
[0104]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表50结果：表50
[0105]
对比例3：利用cy5-tsa进行的用于免疫荧光间接法检测结肠癌组织ki-67抗原的染色方法，具体操作步骤与上述实施例三均相同（当使用cy5-tsa染料时，需注意在滴加完染料后的孵育过程中全程保持避光处理，如放置在暗室进行孵育以及在清洗过程中也需要暗室背景，最大程度避免cy5-tsa荧光染料的淬灭），可用如下表51表示：表51
添加cy5-tsa底物液与信号激发液的配方及成分与上述对比例相同，再次不再赘述。
[0106]
完成后用共聚焦荧光显微镜的高倍视野（40
×
）拍照观察，固定激发波长设置为640nm，发射波长范围设置为660-700nm。
[0107]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量计数阳性细胞占整张切片同类型细胞总数的占比，并用ki-67细胞增值指数进行统计，得出如下表52结果：表52
[0108]
对比例4：利用aie化合物三进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的“免清洗”染色方法，具体操作步骤与上述实施例四均相同，不同点在于添加aie预混液三进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液。
[0109]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为440nm，发射波长范围设置为580-700nm。
[0110]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表53结果：表53
[0111]
对比例5：利用aie化合物四进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的“免清洗”染色方法，具体操作步骤与上述实施例五均相同，不同点在于添加aie预混液四进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液。
[0112]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为580-700nm。
[0113]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表54结果：表54
[0114]
对比例6：利用aie化合物五进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的“免清洗”染色方法，具体操作步骤与上述实施例六均相同，不同点在于添加aie预混液五进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液。
[0115]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0116]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表55结果：表55
[0117]
对比例7：利用aie化合物七进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的“免清洗”染色方法，具体操作步骤与上述实施例八均相同，不同点在于添加aie预混液七进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液。
[0118]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0119]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表56结果：表56
[0120]
对比例8：利用aie化合物九进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的“免清洗”染色方法，具体操作步骤与上述实施例十均相同，不同点在于添加aie预混液九进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液。
[0121]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0122]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均
荧光强度进行定量统计，得出如下表57结果：表57
[0123]
对比例9：利用aie化合物十进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的“免清洗”染色方法，具体操作步骤与上述实施例十一均相同，不同点在于添加aie预混液十进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液。
[0124]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0125]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表58结果：表58
[0126]
对比例10：利用aie化合物十一进行的用于免疫荧光sabc法检测肝癌组织cea抗原的“免清洗”染色方法，具体操作步骤与上述实施例十二均相同，不同点在于添加aie预混液十一进行孵育染色完毕后直接将液体甩掉不洗涤，然后再加复染液。
[0127]
完成后用共聚焦荧光显微镜拍照观察，固定激发波长设置为460nm，发射波长范围设置为600-700nm。
[0128]
通过image j软件对免疫组化结果进行定量，用leica公司软件las x对切片平均荧光强度进行定量统计，得出如下表59结果：表59
[0129]
对比例11：将实施例1中基于aie酪胺化合物一用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片和对比例1中的基于cy5-tsa用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片在同一时间条件和测试环境下测试光稳定性，使用激光共聚焦显微镜，在激光功率为0.5mw的情况下，对两种染色切片进行50次连续扫描成像，得到荧光信号损失率，得出如下表60结果：表60
[0130]
对比例12：将实施例1中基于aie酪胺化合物一用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片和对比例1中的基于cy5-tsa用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片在室温（25℃
±
1℃）放置一月（30天），紧接着继续用共聚焦显微镜观察组织切片的染色情况，并按实施例1和对比例1所述分别在特定光谱下进行拍照。
[0131]
对于实施例以及对比例的结果进行分析：实施例1是利用aie分子式一进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图2和表3中可看出当用aie分子式一进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式一进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式一具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0132]
实施例2是利用aie分子式一进行的用于免疫荧光组化间接法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图3和表5中可看出当用aie分子式一进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式一进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例二（表50和图20）表明aie分子式一具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0133]
实施例3是利用aie分子式一进行的用于免疫荧光组化间接法检测结肠癌组织ki-67抗原的染色方法，从图4和表7中可看出当用aie分子式一进行检测ki-67抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞核阳性抗原，与dapi共染效果良好，并且空白对照显示背景干净，无非特异性染色现象，通过软件定量统计ki-67细胞增值指数为61.44%，得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式一进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例三（表52和图21）表明aie分子式一具有比cy5-tsa更优异的染色效果和更干净的背景。
[0134]
实施例4是利用aie分子式二进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图5和表10中可看出当用aie分子式二进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式二进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式二具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0135]
实施例5是利用aie分子式三进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图6和表13中可看出当用aie分子式三进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式三进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一
（表48和图19）表明aie分子式三具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0136]
实施例6是利用aie分子式四进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图7和表16中可看出当用aie分子式四进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式四进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式四具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0137]
实施例7是利用aie分子式五进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图8和表19中可看出当用aie分子式五进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式五进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式五具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0138]
实施例8是利用aie分子式六进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图9和表22中可看出当用aie分子式六进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式六进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式六具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0139]
实施例9是利用aie分子式七进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图10和表25中可看出当用aie分子式七进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式七进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式七具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0140]
实施例10是利用aie分子式八进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图11和表28中可看出当用aie分子式八进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式八进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式八具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0141]
实施例11是利用aie分子式九进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图12和表31中可看出当用aie分子式九进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式九进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式九具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0142]
实施例12是利用aie分子式十进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图13和表34中可看出当用aie分子式十进行检测cea抗原时，在dapi复
染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式十进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式十具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0143]
实施例13是利用aie分子式十一进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图14和表37中可看出当用aie分子式十一进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，在整个染色过程中无需对aie分子式十一进行特殊避光处理，在用共聚焦显微镜长时间观察时也能发现具有良好的染色效果，通过对比例一（表48和图19）表明aie分子式十一具有比cy5-tsa更优异的平均荧光强度和染色效果。
[0144]
实施例14是利用aie分子式一进行的用于免疫荧光组化间接法检测正常结肠组织ki-67抗原的染色方法，从图15和表39中可看出当用aie分子式一使用免洗的方式进行检测正常结肠组织ki-67抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞核阳性抗原，与dapi共定位效果良好，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，通过与aie分子式一进行的正常清洗的方式进行染色对比，发现不管是使用免洗还是清洗方式染色效果一致，表明aie分子式一可以进行免洗以节省操作时间。
[0145]
实施例15是利用aie分子式二进行的用于免疫荧光组化间接法检测正常结肠组织ki-67抗原的染色方法，从图16和表41中可看出当用aie分子式二使用免洗的方式进行检测正常结肠组织ki-67抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞核阳性抗原，与dapi共定位效果良好，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，通过与aie分子式二进行的正常清洗的方式进行染色对比，发现不管是使用免洗还是清洗方式染色效果均一致，表明aie分子式二可以进行免洗以节省操作时间。
[0146]
实施例16是利用aie分子式六进行的用于免疫荧光组化间接法检测正常胃肠道组织ck-7抗原的染色方法，从图17和表43中可看出当用aie分子式六使用免洗的方式进行检测正常胃肠道组织ck-7抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色弱阳性（+），并且染色效果佳，通过与aie分子式六进行的正常清洗的方式进行染色对比，发现不管是使用免洗还是清洗方式染色效果均一致，表明aie分子式六可以进行免洗以节省操作时间。
[0147]
实施例17是利用aie分子式八进行的用于免疫荧光组化间接法检测正常胃肠道组织ck-20抗原的染色方法，从图18和表45中可看出当用aie分子式八使用免洗的方式进行检测正常胃肠道组织ck-20抗原时，在dapi复染定位下显示明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色中等阳性（++），并且染色效果佳，通过与aie分子式八进行的正常清洗的方式进行染色对比，发现不管是使用免洗还是清洗方式染色效果均一致，表明aie分子式八可以进行免洗以节省操作时间。
[0148]
对比例1是利用cy5-tsa进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图19和表48中可看出当用cy5-tsa进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示较为明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色弱阳性（+），染色效果不如aie分子式一到十一，在整个染色过程中需要对cy5-tsa进
行特殊避光处理，不能用共聚焦显微镜长时间观察，荧光信号容易淬灭。
[0149]
对比例2是利用cy5-tsa进行的用于免疫荧光组化间接法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图20和表50中可看出当用cy5-tsa进行检测cea抗原时，在dapi复染定位下显示较为明显的胞质阳性抗原，胞质阳性荧光染色清晰可见，通过软件定量计算抗原丰度得出染色弱阳性（+），染色效果不如aie分子式一，在整个染色过程中需要对cy5-tsa进行特殊避光处理，不能用共聚焦显微镜长时间观察，荧光信号容易淬灭。
[0150]
对比例3是利用cy5-tsa进行的用于免疫荧光组化间接法检测结肠癌组织ki-67抗原的染色方法，从图21和表52中可看出当用cy5-tsa进行检测ki-67抗原时，在dapi复染定位下显示较为明显的胞核阳性抗原，通过软件定量统计ki-67细胞增值指数为49.40%，得出染色中等阳性（++），但是通过空白对照试剂的染色效果cy5-tsa具有一定程度的非特异性染色现象，染色效果不如aie分子式一，染色背景不干净。
[0151]
对比例4是利用aie分子式三进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图22和表53中可看出当使用免洗操作时，在dapi复染定位下显示比实施例四更多的胞质阳性荧光信号，并且存在非特异性染色现象，通过软件定量计算抗原丰度得出染色强阳性（+++），染色效果与实施例四不一致，表明aie分子式三不能进行免洗。
[0152]
对比例5是利用aie分子式四进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图23和表54中可看出当使用免洗操作时，在dapi复染定位下显示比实施例五更多的胞质阳性荧光信号，并且存在非特异性染色现象，通过软件定量计算抗原丰度得出染色强阳性（+++），染色效果与实施例五不一致，表明aie分子式四不能进行免洗。
[0153]
对比例6是利用aie分子式五进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图24和表55中可看出当使用免洗操作时，在dapi复染定位下显示比实施例六更多的胞质阳性荧光信号，并且存在非特异性染色现象，通过软件定量计算抗原丰度得出染色强阳性（+++），染色效果与实施例六不一致，表明aie分子式五不能进行免洗。
[0154]
对比例7是利用aie分子式七进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图25和表56中可看出当使用免洗操作时，在dapi复染定位下显示比实施例八更多的胞质阳性荧光信号，并且存在非特异性染色现象，通过软件定量计算抗原丰度得出染色强阳性（+++），染色效果与实施例八不一致，表明aie分子式七不能进行免洗。
[0155]
对比例8是利用aie分子式九进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图26和表57中可看出当使用免洗操作时，在dapi复染定位下显示比实施例十更多的胞质阳性荧光信号，并且存在非特异性染色现象，通过软件定量计算抗原丰度得出染色强阳性（+++），染色效果与实施例十不一致，表明aie分子式九不能进行免洗。
[0156]
对比例9是利用aie分子式十进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图27和表58中可看出当使用免洗操作时，在dapi复染定位下显示比实施例十一更多的胞质阳性荧光信号，并且存在非特异性染色现象，通过软件定量
计算抗原丰度得出染色强阳性（+++），染色效果与实施例十一不一致，表明aie分子式十不能进行免洗。
[0157]
对比例10是利用aie分子式十一进行的用于免洗方式的免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色方法，从图28和表59中可看出当使用免洗操作时，在dapi复染定位下显示比实施例十二更多的胞质阳性荧光信号，并且存在非特异性染色现象，通过软件定量计算抗原丰度得出染色强阳性（+++），染色效果与实施例十二不一致，表明aie分子式十一不能进行免洗。
[0158]
对比例11是基于利用aie分子式一进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片和利用cy5-tsa进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片同时在0.5mw的情况下，对两种染色切片进行50次连续扫描成像，得到荧光信号损失率图，从图29和表60中可以看出cy5-tsa在50次扫描后荧光信号损失过大并且达到了5.49%，而aie分子式一仅有2.44%的荧光荧光信号损失率，表明了aie分子式一进行染色的切片具有比cy5-tsa染色的切片更好的抗光漂白性。
[0159]
对比例12是基于利用aie分子式一进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片和利用cy5-tsa进行的用于免疫荧光组化sabc法检测肝癌组织cea抗原的染色切片同时在室温放置30天后进行观察光漂白效应，从图30中可看出aie分子式一染色切片在放置30天后，荧光几乎没有明显衰减，cy5-tsa染色切片显示荧光微弱，表明商用染料cy5-tsa在染色完毕后荧光衰减幅度较大，保存时间过短，显示出聚集诱导发光材料优异的光稳定性。
[0160]
在本发明中，所述酪胺化的aie化合物用于免疫荧光组化sabc法和间接法进行免疫荧光染色，成像效果佳，并且除了能放大靶抗原处的信号外，能减少非特异性染色现象，背景干净，检测结果更稳定，染色荧光强度更高，并且aie化合物能减少一定程度的抗体使用量，并且在染色过程中不需要全程避光和防淬灭处理，尤其是以aie式a（aie化合物一）、aie式b（aie化合物二）、aie式f（aie化合物六）、aie式h（aie化合物八）为代表的化合物可以实现免清洗的操作，减少了洗涤步骤，大大节省了染色操作时间，并且抗光漂白性更好，染色切片保存时间更长，而cy5-tsa等传统荧光素染料为代表的现有tsa染色计数会产生一定的非特异性染色现象，并且全程需要避光操作，保存时间短，染色荧光强度不如aie-tsa化合物。
[0161]
本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用化合物的等效替换及应用方法体系中辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料，其特征在于，结构式如下:其中，aie代表聚集诱导发光基团，l代表接头。2.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料，其特征在于，所述接头为脂族基团接头、杂脂族基团接头或者具有取代或未取代的烷基链接头；所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的激发波长为360nm-600 nm，发射波长为450nm-700nm。3.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料，其特征在于，所述基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料选自如下结构式a-式k中的至少一种：式k中的至少一种：式k中的至少一种：式k中的至少一种：式k中的至少一种：式k中的至少一种：式k中的至少一种：式k中的至少一种：式k中的至少一种：
其中，r1，r2，r3和r4各自独立地选自氢、羟基、氰基、烷氧基、卤素、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基、胺基、取代或未取代的c3-c30氮杂芳基、取代或未取代的c6-c30含氰基芳基、取代或未取代的c3-c30含氰基杂芳基、取代或未取代的c6-c30含卤素芳基、取代或未取代的c3-c30含卤素杂芳基、取代或未取代的c1-c20烷基、取代或未取代的c1-c20烯基、取代或未取代的c2-c20烷氧基、取代或未取代的c6-c30芳基、取代或未取代的c3-c30杂芳基中的任意一种；所述取代的c3-c30氮杂芳基、取代的c6-c30含氰基芳基、取代的c3-c30含氰基杂芳基、取代的c6-c30含卤素芳基、取代的c3-c30含卤素杂芳基、取代的c1-c20烷基、取代的c1-c20烯基、取代的c2-c20烷氧基、取代的c6-c30芳基、取代的c3-c30杂芳基中的取代基为卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基；所述烷氧基、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基的碳原子数为1至20个。4.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料，其特征在于，所述基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料选自式（一）-式（十一）中的至少一种：式（十一）中的至少一种：式（十一）中的至少一种：
。5.一种基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的免疫组化染色试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料。6.根据权利要求5所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的免疫组化染色试剂盒，其特征在于，所述免疫组化染色试剂盒包括抗靶抗原的单克隆抗体、生物素标记的二抗、hrp标记的链霉亲和素、基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的底物液；或所述免疫组化染色试剂盒包括抗靶抗原的单克隆抗体、hrp酶标记的二抗、基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的底物液；所述免疫组化染色试剂为免洗免疫组化染色试剂，染色处理后不需要进行清洗；所述免疫组化染色试剂中的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料为式a、式b、式f或式h。7.权利要求5-6任一项所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的免疫组化染色试
剂盒在免疫组化染色中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫组化染色包括基于亲和素-生物素的免疫组化染色和间接法免疫组化染色；所述亲和素为链霉亲和素或卵白素；所述免疫组化染色中的靶抗原为生物组织样本中的蛋白质、半抗原、脂质、碳水化合物、磷脂、核酸；所述免疫组化染色的组织切片为实体瘤组织和正常组织。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基于亲和素-生物素的免疫组化染色包括以下步骤：将组织切片预处理，向预处理后的组织切片上加入抗靶抗原的单克隆抗体进行孵育，而后加入生物素标记的二抗进行孵育，然后加入hrp标记的链霉亲和素进行孵育，然后加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液进行孵育，最后进行复染封片；其中，所述向预处理后的组织切片上加入抗靶抗原的单克隆抗体进行孵育的操作为：向预处理后的组织切片中央区域加入抗靶抗原的单克隆抗体工作溶液，在2~8℃过夜孵育12~24h；所述抗靶抗原的单克隆抗体工作溶液为抗靶抗原的单克隆抗体浓缩液溶解在缓冲液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0；所述抗靶抗原的单克隆抗体工作溶液中单克隆抗体浓缩液与缓冲液的体积比为1：50-1000；所述生物素标记的二抗为生物素标记的羊抗兔igg抗体或生物素标记的羊抗鼠igg抗体；所述生物素标记的二抗中生物素的标记数量为3-5个；所述加入生物素标记的二抗进行孵育的操作为：向抗靶抗原的单克隆抗体孵育后的组织切片上加入生物素标记的二抗溶液，室温孵育30-60 min；所述生物素标记的二抗溶液为生物素标记的二抗溶解在缓冲液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0；所述生物素标记的二抗溶液中生物素标记的二抗工作液浓度为1~20μg/ml；所述加入hrp标记的链霉亲和素进行孵育的操作为：向生物素标记的二抗孵育后的切片上加入hrp标记的链霉亲和素溶液，室温孵育20-60 min；所述hrp标记的链霉亲和素溶液为hrp标记的链霉亲和素溶解在缓冲液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0；所述hrp标记的链霉亲和素溶液中hrp标记的链霉亲和素的工作液浓度为1~20μg/ml；所述的加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液进行孵育的操作为：加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液，在室温孵育5-20min；所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液为基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料溶解在缓冲液和有机相溶液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0，所述的有机相的体积含量为0-40%，所述有机相为二甲基亚砜或n,n-二
甲基甲酰胺；所述预混液中基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的浓度为100-500μm，信号激发剂的质量浓度为0.001-0.01%；所述的信号激发液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述信号激发液的溶剂为水，所述信号激发液的质量浓度为0.001-0.01%；所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液的配制具体为：将信号激发液加入到基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液中；所述复染封片具体为：用4',6-二脒基-2-苯基吲哚水溶液复染胞核5-10 min，然后滴加中性树胶封片液于组织切片上，盖上盖玻片；所述4',6-二脒基-2-苯基吲哚水溶液的浓度为0.5-10 μg/ml；所述间接法免疫组化染色包括以下步骤：将组织切片预处理，向预处理后的组织切片上加入抗靶抗原的单克隆抗体工作液进行孵育，而后加入hrp酶标记的二抗进行孵育，然后加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液，最后进行复染封片；其中，所述向预处理后的组织切片上加入抗靶抗原的单克隆抗体进行孵育的操作为：向预处理后的组织切片中央区域加入抗靶抗原的单克隆抗体工作溶液，在2~8℃过夜孵育12~24h；所述抗靶抗原的单克隆抗体工作溶液为抗靶抗原的单克隆抗体浓缩液溶解在缓冲液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0；所述抗靶抗原的单克隆抗体工作溶液中单克隆抗体浓缩液与缓冲液的体积比为1：50-1000；所述hrp酶标记的二抗为羊抗兔igg抗体或羊抗鼠igg抗体；所述加入hrp酶标记的二抗进行孵育的操作为：加入hrp酶标记的二抗工作溶液，室温孵育30-60 min；所述hrp酶标记的二抗工作溶液为hrp酶标记的二抗浓缩液溶解在缓冲液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0；所述hrp酶标记的二抗工作溶液中hrp酶标记的二抗工作液的浓度为1~20μg/ml；所述的加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液进行孵育的操作为：加入基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液，在室温孵育5-20min；所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液为基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料溶解在缓冲液和有机相溶液中得到的溶液，所述缓冲液为pbs或tris-hcl，所述缓冲液的ph为7.0-8.0，所述的有机相的体积含量为0-40%，所述有机相为二甲基亚砜或n,n-二甲基甲酰胺；所述预混液中基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的浓度为100-500 μm，信号激发剂的质量浓度为0.001-0.01%；所述的信号激发液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述信号激发液的溶剂为水，所述信号激发液的质量浓度为0.001-0.01%；所述的基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液和信号激发液的预混液的配制具
体为：将信号激发液加入到基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料底物液中；所述复染封片具体为：用4',6-二脒基-2-苯基吲哚水溶液复染胞核5-10 min，然后滴加中性树胶封片液于组织切片上，盖上盖玻片；所述4',6-二脒基-2-苯基吲哚水溶液的浓度为0.5-10 μg/ml。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述基于亲和素-生物素的免疫组化染色中组织切片预处理的过程包括烤片、脱蜡水化、微波抗原修复、内源性过氧化物酶位点封闭、内源性生物素封闭和非特异性位点封闭；所述间接法免疫组化染色中组织切片预处理的过程包括烤片、脱蜡水化、微波抗原修复、内源性过氧化物酶位点封闭和非特异性位点封闭；所述烤片为将石蜡切片面朝上放置，置于55-65℃的恒温烤箱中烤片60-120 min，而后恢复室温；所述脱蜡水化为：将烤片后的石蜡切片置于新鲜的脱蜡透明液中，浸泡1次，每次10-20min，然后换新鲜的脱蜡液浸泡1次，每次10-20 min；接着置于无水乙醇中，浸泡3-5min；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡3-5min；接着置于85%乙醇中，浸泡3-5 min；接着置于75%乙醇中，浸泡3-5min；最后放入pbst漂洗3-5分钟；所述pbst为1
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pbs磷酸盐缓冲液，含0.05%tween-20；所述微波抗原修复为：将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，整体浸入抗原修复液中，放入微波炉，先高火加热3-5min至抗原修复液沸腾，然后转为中低火或中火继续沸腾10-20min，然后静置5min，待锅中液体自然冷却至室温取出切片；所述抗原修复液为ph8.0的1mm edta溶液或ph6.0的含有0.05%吐温-20的10mm柠檬酸钠修复液；所述内源性过氧化物酶位点封闭为：向微波抗原修复后的切片目标区域滴加内源性过氧化物酶阻断剂，湿盒室温孵育10-30 min，完成后放入pbst中浸洗3次，每次3min；所述内源性生物素封闭的具体过程为：向内源性过氧化物封闭后的切片目标区域滴加卵白素，湿盒中室温孵育10-20min；完成后放入pbst中浸洗3次，每次3min；接着向切片目标区域滴加d-生物素溶液，湿盒中室温孵育10-20min，完成后放入pbst中浸洗3次，每次3min；所述非特异性位点封闭的过程为：向内源性生物素封闭后的切片或内源性过氧化物酶位点封闭后的切片目标区域滴加2%-5% bsa或1%-10%羊血清，湿盒中室温孵育30-60min。

技术总结
本发明公开了一种基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料、免疫组化染色试剂盒及其应用；本发明基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料的结构式为；所述免疫组化染色试剂盒包括基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料。所述免疫组化染色包括基于亲和素-生物素的免疫组化染色和间接法免疫组化染色。本发明通过标记AIE荧光基团的酪酰胺的信号放大技术及其染色试剂盒，使用上述的AIE酪胺荧光化合物进行的免疫荧光染色，能解决现有酪酰胺荧光免疫组化技术可能引起的非特异性染色的现象，增强了靶抗原处的目标信号，并降低了背景信号，还可以实现“免洗”操作，减少洗涤次数、节省染色时间。节省染色时间。节省染色时间。


技术研发人员：唐本忠 马晓峰 刘勇 王志明 李亚伟 刘冲
受保护的技术使用者：广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/7/21