一种薰衣草发酵液的制备方法和产品及其应用与流程

1.本发明属于生物发酵领域，具体涉及到一种薰衣草发酵液的制备方法和产品及其应用。


背景技术：

2.随着微生物发酵液工业的发展，发酵在越来越多的领域有着重要的应用。发酵技术具有条件温和、安全性高和可操作性好等优点，在抗生素医药以及传统食物发酵、食品行业都占据了重要的地位，在化妆品领域的应用，也越来越广泛。
3.近年来，天然化妆品逐渐成为化妆品的发展方向之一，对天然植物进行发酵则成为了如今化妆品行业的热点。在生物发酵的过程中，植物中的大分子物质在微生物体内酶的作用下被分解成分子量较小的活性物质，易被皮肤吸收，且极大的保留了植物原有的蛋白、黄酮以及多酚等活性成分，并通过抑制细胞的活性氧减少体内自由基的生成，从而达到延缓肌肤衰老的目的。
4.薰衣草是唇形科薰衣草属多年生亚灌木植物，按其特征可将品种分为狭叶薰衣草、宽叶薰衣草、杂交薰衣草、头状薰衣草、羽状薰衣草等。薰衣草主要成分是挥发油、黄酮等，因而其具有抑菌、抗炎、抗氧化等作用，是珍贵的中药材和食品香料。如专利cn114306137a介绍了一种薰衣草精油型发酵多肽冻干粉的制备方法，该发酵液具有抗氧化的功效；专利cn105147585a介绍了一种嗜热链球菌发酵的薰衣草原浆的制备方法，该发酵液具有抗氧化的功效。专利cn108451008b介绍了一种生物发酵制备薰衣草净油的方法及其在卷烟中的应用。
5.目前，薰衣草越来越多的被应用于化妆品中，但更多的是以薰衣草精油的形式出现，同时功效也较为单一。


技术实现要素：

6.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
7.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
8.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种薰衣草发酵液的制备方法。
9.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种薰衣草发酵液的制备方法，包括，
10.取薰衣草花及叶片，粉碎过60～100目筛，按照50～75g/l的添加量加入去离子水中，同时加入10g/l的葡萄糖，大米粉5g/l，脱脂奶粉5g/l，调节体系ph为6.0～8.0，制得发酵培养基；
11.将发酵培养基在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，制得灭菌后的发酵培养基；
12.将酿酒酵母和植物乳杆菌分别接种于ypd培养基和mrs培养基中于37℃，200rpm培养18～24h，待菌体浓度达到106～107cfu/ml时，按一定比例以5％～10％的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中发酵培养后，陶瓷膜过滤，即得到薰衣草发酵滤液。
13.作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述薰衣草花为新鲜狭叶薰衣草，37℃烘干至恒重，粉碎，过80目筛；
14.作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述发酵培养基，其中，去离子水的添加量75g/l，优选的ph为6.5～7.0。
15.作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，其保藏编号为cgmcc no.21528，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；
16.所述酿酒酵母为商业来源酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，资源编号为atcc9080。
17.作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述ypd培养基，其配方包括，
18.酵母粉10.0g/l，葡萄糖20.0g/l，蛋白胨20.0g/l，琼脂粉20.0g/l，ph6.5～7.0；
19.所述mrs培养基，其配方包括，
20.蛋白胨10.0g/l，牛肉膏10.0g/l，酵母粉5.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.0g/l，乙酸钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph 6.2。
21.作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述两种菌的总接种量为8％；
22.其中，酿酒酵母的接种比例为25％～75％，所述植物乳杆菌的接种比例为75％～25％；
23.其中，酿酒酵母：植物乳杆菌为1:1。
24.作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述发酵培养，包括，
25.将接种酿酒酵母后的培养基于35
±
2℃，200rpm培养48～72h，待残糖为0时，终止发酵；
26.发酵结束后的发酵液在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液，先由200～300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经陶瓷膜过滤，得到薰衣草发酵滤液。
27.作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述经陶瓷膜过滤，其中，陶瓷膜滤径为200nm。
28.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种薰衣草发酵液的制备方法制得的产品，所述产品抑制mmp-1表达，具有抗衰功效；具有no清除能力，具有抗炎功效。
29.本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供所述产品在化妆品中作为抗衰成分的应用。
30.本发明有益效果：
31.(1)本发明提供一种具有抗衰效果的薰衣草发酵液的制备方法，该制备方法采用酿酒酵母和植物乳杆菌复配对薰衣草进行发酵，在此过程中，不添加任何有机试剂，发酵过程中条件温和，薰衣草活性成分结构不被破坏，保持了薰衣草的天然活性，同时，优选酿酒
酵母和植物乳杆菌的复配比例，实现良好的mmp-1抑制能力，通过两者发酵协同作用，实现更强的抗衰抗炎作用。
32.(2)本发明节约生产成本，充分保证产品质量的稳定性，且在发酵原浆中不添加香精等化学成分，确保产品对人体的安全性；可直接作为护肤品使用，且薰衣草发酵液中富含蛋白质、多糖、黄酮等，与发酵液中的一些发酵产物益生菌具有协同作用，从而展现出更强的抗衰抗炎作用。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
34.图1为本发明实施例中酿酒酵母单独发酵的薰衣草发酵液的mmp-1抑制活性图。
35.图2为本发明实施例中植物乳杆菌单独发酵的薰衣草发酵液的mmp-1抑制活性图。
36.图3为本发明实施例中酿酒酵母单独发酵的薰衣草发酵液的no清除能力图。
37.图4为本发明实施例中植物乳杆菌单独发酵的薰衣草发酵液的no清除能力图。
38.图5为本发明实施例中不同菌种配比薰衣草发酵液mmp-1抑制活性图。
39.图6为本发明实施例中不同菌种配比薰衣草发酵液no清除能力图。
具体实施方式
40.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
41.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
42.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
43.本发明中所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，其保藏编号为cgmccno.21528，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；本发明中酿酒酵母为商业来源酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，资源编号为atcc9080。
44.实施例1
45.酿酒酵母发酵薰衣草的筛选过程：
46.(1)ypd培养基：酵母粉10.0g/l，葡萄糖20.0g/l，蛋白胨20.0g/l，琼脂粉20.0g/l，ph6.5～7.0。
47.发酵培养基：精选薰衣草花朵及叶子，进行粉碎操作后，过80目筛，然后按照75g/l的添加量加入去离子水中，同时加入10g/l的葡萄糖，5g/l大米粉，5g/l脱脂奶粉，并调节ph 7.0；以上培养基在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min。
48.(2)将酿酒酵母接种于ypd培养基中于37℃，200rpm培养18～24h，待菌体浓度达到
106～107cfu/ml时，以8％的接种量接种于发酵培养基中。
49.(3)发酵培养：将接种酿酒酵母后的培养基于35
±
2℃，200rpm培养48～72h，待残糖为0时，终止发酵；
50.发酵结束后的发酵液在在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液，先由200～300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经由200nm陶瓷膜过滤，得到薰衣草发酵滤液。
51.实施例2
52.植物乳杆菌发酵薰衣草的筛选过程：
53.(1)mrs培养基：蛋白胨10.0g/l，牛肉膏10.0g/l，酵母粉5.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.0g/l，乙酸钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph 6.2；
54.发酵培养基：精选薰衣草花朵及叶子，进行粉碎操作后，过80目筛，然后按照75g/l的添加量加入去离子水中，同时加入10g/l的葡萄糖，5g/l大米粉，5g/l脱脂奶粉，并调节ph 7.0；以上培养基在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min。
55.(2)将植物乳杆菌接种于mrs培养基中于37℃，200rpm培养18～24h，待菌体浓度达到106～107cfu/ml时，以8％的接种量接种于发酵培养基中；
56.(3)发酵培养：将接种植物乳杆菌后的培养基于35
±
2℃，200rpm培养48～72h，待残糖为0时，终止发酵；
57.发酵结束后的发酵液在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液，先由200～300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经由200nm陶瓷膜过滤，得到薰衣草发酵滤液。
58.实施例3
59.植物乳杆菌、酿酒酵母共同发酵薰衣草的筛选过程：
60.采用实施例1～2中筛选得到的最佳植物乳杆菌、酿酒酵母，按酿酒酵母的接种比例为25％～75％，所述植物乳杆菌的接种比例为75％～25％，两种菌的总接种量为8％组合后再接种至薰衣草发酵培养基中进行共同发酵；
61.其中，接种比例为1:1，2:1，3:1，1:2，1:3(体积比)。
62.(1)发酵培养基：精选薰衣草花朵及叶子，进行粉碎操作后，过80目筛，然后按照75g/l的添加量加入去离子水中，同时加入10g/l的葡萄糖，5g/l大米粉，5g/l脱脂奶粉，并调节ph 7.0；以上培养基在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min。
63.(2)发酵培养：将接种酿酒酵母和植物乳杆菌的培养基于35
±
2℃，200rpm培养48～72h，待残糖为0时，终止发酵；
64.发酵结束后的发酵液在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液，先由200～300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经由200nm陶瓷膜过滤，得到薰衣草发酵滤液。
65.实施例4
66.将实施例1～3中制得的不同菌种发酵液mmp-1抑制活性比较：
67.mmp-1抑制活性检测：(使用sigma试剂盒)
68.mmp-1试剂盒组成：
69.mmp-1assaybuffer:25ml(使用前加热到室温)；
70.mmp-1substrate:0.2ml；
71.mmp-1enzyme:1vl(加入220μl mmp-1assay buffer，用移液枪吹打均匀，在-70℃保存，重建后1周内使用)；
72.inhibitor control,1μm gm6001:100μl。
73.试剂准备：
74.样品制备：
75.(用mmp-1assaybuffer将样品稀释到4
×
样品溶液)
76.inhibitor control
77.(1μl inhibitor control+24μlmmp-1assaybuffer)
78.为矫正样品背景，应做样品空白组(不加mmp-1enzyme)，样品组读数-样品空白组读数；
79.enzyme control(酶对照组)
80.(用mmp-1assaybuffer代替样品)
81.加入25μl样品组(4
×
样品液)，样品空白组(4
×
样品液)，酶对照组(mmp-1assaybuffer)，inhibitor control于96孔板中。
82.实验过程：
[0083][0084]
数据处理：
[0085]
slope＝(flu2-flu1)/(t2-t1)
[0086]
relative inhibition％＝(slopeec-slopesm)/slopeec
×
100
[0087]
实验结果如图1所示，sc-2，sc-3的mmp-1抑制活性相对较高，如图2所示，lp-1，lp-5的mmp-1抑制活性相对较高，在与图3、图4的no清除能力对比后选择sc-2，lp-1进行复配，结果如图5所示，sc-2与lp-1复配比例为1:1时，mmp-1抑制能力最好。
[0088]
实施例5
[0089]
将实施例1～3中制得的不同菌种发酵液no清除活性比较：
[0090]
no清除实验：
[0091]
溶液准备：
[0092]
griess试剂a：称取100mg磺胺，加入200μl浓磷酸，加水至10ml；
[0093]
griess试剂b：称取10mgn-(1-萘基)乙二胺盐酸盐，加水至10ml；
[0094]
0.2m pbs(ph7.4)：称取3.1192g的nah2po4
·
2h2o溶于100ml水中，称取7.1628g的na2hpo4
·
12h2o溶于100ml水中，调节ph至7.4；
[0095]
0.5mm snp溶液：称取2.9775mgsnp，用1mlph为7.4的pbs(0.2m)溶液溶解，为10mm的snp溶液，再梯度稀释到0.5mm。
[0096]
实验步骤如表格所示：
[0097][0098]
数据处理：
[0099]
no抑制率(％)＝[1-(as-ab)/(ac-acb)]
×
100
[0100]
实验结果如图3、图4所示，sc-2，lp-1的no清除活性较高；
[0101]
与图1、图2的结果相结合，选择sc-2，lp-1复配进行发酵，如图6所示，sc-2与lp-1复配比例为1:1时，no清除能力最好；
[0102]
其中，lp-1来自于江苏瑞霆生物科技有限公司自建菌种库，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：cgmcc no.21528；sc-2为商业来源酿酒酵母saccharomyces cerevisiae(atcc 9080)。
[0103]
其中，lp-2购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：cicc24202；lp-3编号为cicc22838，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；lp-4编号为cgmcc no.6077，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心；lp-5编号为cgmcc no.9551，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心；lp-6编号为cctcc no.m206033，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0104]
sc-1到sc-6均为酵母菌，其中，sc-1购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：cicc1392；sc-3购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：cicc1001；sc-4购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：cicc1385；sc-5购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：cicc1386；sc-6购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：cicc1288。
[0105]
实施例6
[0106]
薰衣草发酵液安全性测试：
[0107]
封闭性斑贴实验
[0108]
试验的人员：18～35岁的志愿者30名，选用合格的斑试器，以封闭式斑贴试验方
法，将0.020ml的样品涂于斑试器内，24小时后去除受试物，分别于去除后0.5、24、48小时观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应分级标准记录其结果。
[0109]
样品：1号样品——薰衣草发酵滤液，依据实施例3中的方法按照sc-2与lp-1复配比例为1:1制得的薰衣草发酵滤液；
[0110]
阴性对照——纯水。
[0111]
表3皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
[0112][0113]
表4皮肤封闭型斑贴试验试验结果
[0114][0115]
从表中可以看出涂抹1号样品的志愿者的试验结果均为阴性，无不良皮肤反应发生。表明薰衣草发酵滤液温和、无刺激，安全性好。
[0116]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。

技术特征：
1.一种薰衣草发酵液的制备方法，其特征在于：包括，取薰衣草花及叶片，粉碎过60～100目筛，按照50～75g/l的添加量加入去离子水中，同时加入10g/l的葡萄糖，大米粉5g/l，脱脂奶粉5g/l，调节体系ph为6.0～8.0，制得发酵培养基；将发酵培养基在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，制得灭菌后的发酵培养基；将酿酒酵母和植物乳杆菌分别接种于ypd培养基和mrs培养基中于37℃、200rpm培养18～24h，待菌体浓度达到106～107cfu/ml时，按一定比例以5％～10％的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中发酵培养后，陶瓷膜过滤，即得到薰衣草发酵滤液。2.如权利要求1所述薰衣草发酵滤液的制备方法，其特征在于：所述薰衣草花为新鲜狭叶薰衣草，37℃烘干至恒重，粉碎，过80目筛。3.如权利要求1或2所述薰衣草发酵滤液的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基，其中，去离子水的添加量75g/l，ph为6.5～7.0。4.如权利要求1或2所述薰衣草发酵滤液的制备方法，其特征在于：所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，其保藏编号为cgmccno.21528，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；所述酿酒酵母为商业来源酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，资源编号为atcc9080。5.如权利要求1或2所述薰衣草发酵滤液的制备方法，其特征在于：所述ypd培养基，其配方包括，酵母粉10.0g/l，葡萄糖20.0g/l，蛋白胨20.0g/l，琼脂粉20.0g/l，ph6.5～7.0；所述mrs培养基，其配方包括，蛋白胨10.0g/l，牛肉膏10.0g/l，酵母粉5.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.0g/l，乙酸钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，ph6.2。6.如权利要求1或2所述薰衣草发酵滤液的制备方法，其特征在于：所述两种菌的总接种量为8％；其中，酿酒酵母的接种比例为25％～75％，所述植物乳杆菌的接种比例为75％～25％；其中，酿酒酵母：植物乳杆菌的体积比为1:1。7.如权利要求1或2所述薰衣草发酵滤液的制备方法，其特征在于：所述发酵培养，包括，将接种酿酒酵母后的培养基于35
±
2℃，200rpm培养48～72h，待残糖为0时，终止发酵；发酵结束后的发酵液在121℃、0.1mpa的条件下灭菌20min，将灭菌发酵液，先由200～300目纱布过滤除去固体不溶物，然后将过滤的清液经陶瓷膜过滤，得到薰衣草发酵滤液。8.如权利要求6所述薰衣草发酵滤液的制备方法，其特征在于：所述经陶瓷膜过滤，其中，陶瓷膜滤径为200nm。9.如权利要求1～8中任一所述薰衣草发酵滤液的制备方法制得产品，其特征在于：所述产品抑制mmp-1表达，具有抗衰功效；具有no清除能力，具有抗炎功效。10.权利要求9所述产品在化妆品中作为抗衰成分的应用。

技术总结
本发明公开了一种薰衣草发酵液的制备方法和产品及其应用，包括，取薰衣草花及叶片，粉碎过筛，制得发酵培养基；将发酵培养基在121℃、0.1Mpa的条件下灭菌20min，制得灭菌后的发酵培养基；将酿酒酵母和植物乳杆菌分别接种于YPD培养基和MRS培养基中于37℃，200rpm培养18～24h，待菌体浓度达到106～107CFU/mL时，以5％～10％的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中发酵培养后，陶瓷膜过滤，即得到薰衣草发酵滤液。本发明薰衣草发酵液中富含蛋白质、多糖、黄酮等，与发酵液中的一些发酵产物益生菌具有协同作用，从而展现出更强的抗衰抗炎作用。从而展现出更强的抗衰抗炎作用。从而展现出更强的抗衰抗炎作用。


技术研发人员：武安琪 杜养标 赵炳天
受保护的技术使用者：江苏瑞霆生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.17
技术公布日：2023/7/26