一种无花果愈伤组织提取物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及植物组织提取技术领域，具体涉及一种无花果愈伤组织提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.愈伤组织是在植物细胞受到创伤刺激后，在伤口表面形成体积增大，脱分化的薄壁细胞，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，进而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。
3.无花果原产于地中海沿岸，是世界上最古老的果树之一。无花果的根、茎、叶、果均可入药，含有补骨脂素、佛手苷内酯、苯甲醛、呋喃香豆素等多种药用成分。由于无花果提取液对癌细胞具有抑制作用，因此，也被认为是抗癌食品。
4.目前还没有对无花果愈伤组织性能的研究，本发明旨在研究无花果愈伤组织在化妆品领域的应用，鉴于此，申请本专利。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种无花果愈伤组织提取物及其制备方法和应用，在建立有效的提取方法的同时，研究其抗氧化和促修复的功效，开拓其在化妆品领域的应用。
6.本发明请求保护一种无花果愈伤组织提取物，以无花果愈伤组织细胞粉为原料，经提取溶剂预处理后进行离心制备而得。
7.优选的，所述提取溶剂为10％-50％乙醇，或20％dmso，提取溶剂还可以是甲醇。
8.更优选的，所述提取溶剂为20％dmso、10％乙醇。
9.优选的，所述无花果愈伤组织细胞粉在提取溶剂中的体积占比为2.5％。
10.本发明还提供了一种无花果愈伤组织提取物的制备方法，包括以下步骤：
11.s1、取一定量的无花愈伤组织细胞粉进行研磨，研磨后加入到提取溶剂中进行预处理，得到预处理液；
12.s2、将预处理液依次进行涡旋、超声、离心处理，取上清液，得到无花果愈伤组织提取物。
13.优选的，在s1中，所述研磨方式为液氮研磨。
14.优选的，在s2中，所述涡旋时间为10min，和/或超声时间为30min。
15.优选的，在s2中，所述离心条件为：转速为15000rpm，时间为10min。
16.本发明还提供了一种上述无花果愈伤组织提取物或上述的制备方法得到的无花果愈伤组织提取物在制备抗氧化和/或促修复化妆品中的应用。
17.本发明还提供了一种抗氧化的化妆品，包括上述的无花果愈伤组织提取物或上述制备方法制备得到的无花果愈伤组织提取物。
18.具体的，所述抗氧化的化妆品能够降低hacat细胞的氧化损伤。
19.本发明还提供了一种促修复的化妆品，包括上述的无花果愈伤组织提取物或上述制备方法制备得到的无花果愈伤组织提取物。
20.具体的，所述促修复的化妆品能够促进hacat细胞的修复。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果：
22.1、本发明通过醇或者二甲基亚砜进行无花果愈伤组织细胞粉的预处理，再通过涡旋、超声能够更高效更成分的提取有效物质。
23.2、本发明通过细胞活性试验，表明提取到的无花果愈伤组织提取物具有提高hacat细胞活性的作用。
24.3、本发明通过验证，表明提取到的无花果愈伤组织提取物能够降低hacat细胞的氧化损伤。
25.4、本发明通过验证，表明提取到的无花果愈伤组织提取物能够促进hacat细胞的修复。
具体实施方式
26.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
27.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
28.实验原料及仪器来源：
29.超声波清洗器(上海科导高频台式超声波清洗器，sk1200h)
30.高糖培养基(索莱宝，型号：12100)
31.mtt：3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazoliumbromide
32.hacat(humanimmortalizedkeratinocytes)
33.dmem(dulbecco'smodifiedeaglemedium)
34.pbs(phosphatebufferedsaline)
35.实施例1
36.无花果愈伤组织提取物及其制备：取无花果愈伤组织干粉在液氮中研磨成细腻的粉末，然后加入10％乙醇中，样品在提取溶剂中的体积占比为2.5％，涡旋10min混合均匀，继续超声30min，最后在转速15000rpm下离心10min，取上清即为制备好的愈伤组织的提取物，称为10％乙醇提取物。
37.实施例2
38.无花果愈伤组织提取物及其制备：取无花果愈伤组织干粉在液氮中研磨成细腻的
粉末，然后加入20％乙醇中，样品在提取溶剂中的体积占比为2.5％，涡旋10min混合均匀，继续超声30min，最后在转速15000rpm下离心10min，取上清即为制备好的愈伤组织的提取物，称为20％乙醇提取物。
39.实施例3
40.无花果愈伤组织提取物及其制备：取无花果愈伤组织干粉在液氮中研磨成细腻的粉末，然后加入30％乙醇中，样品在提取溶剂中的体积占比为2.5％，涡旋10min混合均匀，继续超声30min，最后在转速15000rpm下离心10min，取上清即为制备好的愈伤组织的提取物，称为30％乙醇提取物。
41.实施例4
42.无花果愈伤组织提取物及其制备：取无花果愈伤组织干粉在液氮中研磨成细腻的粉末，然后加入40％乙醇中，样品在提取溶剂中的体积占比为2.5％，涡旋10min混合均匀，继续超声30min，最后在转速15000rpm下离心10min，取上清即为制备好的愈伤组织的提取物，称为40％乙醇提取物。
43.实施例5
44.无花果愈伤组织提取物及其制备：取无花果愈伤组织干粉在液氮中研磨成细腻的粉末，然后加入50％乙醇中，样品在提取溶剂中的体积占比为2.5％，涡旋10min混合均匀，继续超声30min，最后在转速15000rpm下离心10min，取上清即为制备好的愈伤组织的提取物，称为50％乙醇提取物。
45.实施例6
46.无花果愈伤组织提取物及其制备：取无花果愈伤组织干粉在液氮中研磨成细腻的粉末，然后加入20％dmso中，样品在提取溶剂中的体积占比为2.5％，涡旋10min混合均匀，继续超声30min，最后在转速15000rpm下离心10min，取上清即为制备好的愈伤组织的提取物，称为20％dmso提取物。
47.对比例1-6
48.对比例1-6采用无花果组织作为原料，使用不同提取溶剂进行提取，得到无花果组织提取物。对比例1-6采用的提取方法与实施例一致，对比例1-6采用的提取溶剂依次为10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％乙醇、50％乙醇、20％dmso。
49.试验1无花果愈伤组织提取物的细胞活力测定
50.实验方法：采用mtt法测定细胞活力。无花果愈伤组织提取物使用dmem高糖培养基稀释至0.1％后，过滤除菌，备用。将生长良好的hacat细胞以每孔5
×
103个的密度接种于96孔培养板中，放入37℃，5％co2环境中培养过夜。第二天弃培养液，分别加入经dmem稀释的样品(稀释至0.1％)，样品组分别为：不同比列乙醇、20％dmso、不同比例乙醇提取物以及20％dmso提取物，对照组加入不加任何样品的纯dmem培养液，每个处理组设5个重复，培养24h。培养后吸弃培养基，使用ph＝7.4的pbs缓冲液洗两次，加入100μlmtt(1.0g/l)溶液，放入37℃，5％co2环境中培养4h后，弃液，加入100μldmso，37℃下放置30min后于490nm波长下测定各孔吸光度值。
51.细胞活力v(％)＝(od
样品-od
空白对照
)/(od
细胞对照-od
空白对照
)
×
100％，od
样品
：含有待测样反应体系的吸光度，od
空白对照
：不含任何物质的空板吸光度，od
细胞对照
：不含待测样反应体系的吸光度。
52.无花果愈伤组织提取物的细胞活力测定结果见表1所示。
53.表1无花果愈伤组织提取物对hacat细胞活力的影响
[0054][0055][0056]
结论：由表1可以看出，通过对比样品组和对照组，添加无花果组织提取物的组较不添加的组均可提高hacat细胞的活力，在相同的提取体系下，添加无花果愈伤组织提取物的组较添加无花果组织提取物的组可明显提高hacat细胞活力，综上可说明无花果愈伤组织提取物可以明显提高hacat细胞的活力，尤其是提取体系为10％的乙醇，无花果愈伤组织的添加量为1％时，hacat细胞的活力是无花果组织提取物的1.35倍，是10％乙醇的1.36倍，是对照组的1.35倍。
[0057]
试验2无花果愈伤组织提取物对h2o2诱导的hacat细胞的氧化损伤保护作用
[0058]
选取细胞存活率在20％左右的h2o2浓度，建立h2o2诱导的hacat细胞衰老模型：取对数生长期的hacat细胞，按5
×
103个/孔接种于96孔板，于37℃、5％co2的培养箱中培养过夜，24h后去除培养液，使用pbs缓冲液清洗2遍，加入无血清培养基培养过夜，24h后弃培养液，pbs缓冲液清洗2遍，每孔加入不同浓度的h2o2(25、50、100、150、200μmol/l)培养24h后；弃培养液，pbs清洗2遍，采用mtt法于490nm波长下用酶标仪测定各孔吸光值，计算细胞存活率，存活率(％)＝(od处理/od空白)
×
100％，细胞存活率在20％左右的h2o2浓度为50μmol/l。
[0059]
设立空白组、模型组、样品组和对照组。空白组为：不含任何物质的空板。模型组为：dmem培养液+50μmol/lh2o2。样品组为：含0.1％样品(不同比例乙醇、20％dmso、不同比例乙醇提取物、20％dmso提取物)的dmem培养液+50μmol/lh2o2。对照组为：dmem培养液。
[0060]
实验方法：取生长状态良好的hacat细胞以每孔5
×
103个的密度接种于96孔培养板中，于37℃，5％co2环境中培养过夜，弃培养液，按照模型组和样品组加入样品，每个处理
设5个重复。培养24h后，加入50μmol/l的h2o2，继续培养24h后，吸弃培养基，用ph＝7.4的pbs缓冲液洗两次，加入100μlmtt(1.0g/l)溶液，放入37℃，5％co2环境中培养4h后，弃液，加入100μldmso，37℃下放置30min后于490nm波长测定各孔吸光度值。
[0061]
细胞活力v(％)＝(od
样品-od
空白对照
)/(od
细胞对照-od
空白对照
)
×
100％，od
样品
：含有待测样反应体系的吸光度；od
空白对照
：不含任何物质的空板吸光度；od
细胞对照
：不含待测样反应体系的吸光度。
[0062]
无花果愈伤组织提取物对h2o2诱导的hacat细胞的氧化损伤保护作用如表2所示。
[0063]
表2无花果对h2o2诱导的hacat细胞的氧化损伤保护作用
[0064][0065][0066]
结论：由表2可知，无花果组织和愈伤组织提取液都可以缓解h2o2诱导的hacat细胞的氧化损伤，在相同的提取液体系下(10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％乙醇、50％乙醇、dmso)以及相同的添加量下，添加无花果愈伤组织的组较添加无花果组织的组可对抗h2o2诱导的hacat细胞的氧化损伤，综上可说明无花果愈伤组织提取液都可显著对抗h2o2诱导的hacat细胞的氧化损伤，尤其是提取体系为10％乙醇时，添加量为1.00％的无花果愈伤组织，细胞活力是无花果组织的2.88倍，是提取溶剂的2.91倍，是模型组的3.11倍。
[0067]
试验3无花果愈伤组织提取物对hacat细胞迁移率的影响
[0068]
将生长状态良好的hacat细胞以每孔1x106个细胞接种于6孔板中，放入37℃，5％co2培养箱培养24h。第二天用10μl枪头比着直尺，垂直交叉画两条线(+字形)，然后用pbs缓冲液洗细胞3次，去除划下的细胞，每孔加入2ml不同浓度样品(20％dmso提取物)，以无血清dmem培养基为对照组。放入37℃，5％co2培养箱培养，分别在上样后0、6、12、24h后于倒置显微镜下观察，拍照。
[0069]
使用imagej软件进行数据分析，计算细胞迁移率如表3所示，细胞迁移率(％)＝(0h划痕面积-培养时间划痕面积)/0h划痕面积*100。
[0070]
表3无花果愈伤组织提取物对hacat细胞迁移率的影响
[0071][0072]
结论：由表3可知，在相同培养时间下，添加无花果提取物的组比未添加的组的细胞迁移率更高，说明无花果提取物可以提高细胞划痕的修复能力，在相同的添加量以及培养时间下，添加无花果愈伤组织提取物的组较添加无花果组织提取物的组的细胞迁移率更高(除添加量为1.00％，培养时间为6h)。尤其是无花果愈伤组织添加量为0.10％，培养时间为24h时，细胞迁移率高于无花果组织及对照组，为无果组织的1.68倍，为对照组的1.77倍。
[0073]
试验4无花果愈伤组织提取物中黄酮含量测定
[0074]
芦丁标准品全波长扫描：0.5ml(0.2mg/ml)芦丁标准品25ml容量瓶，加1ml5％nano2(0.5g亚硝酸钠+9.5g离子水)，摇匀静置6min，加入1ml10％al(no3)3(1g硝酸铝+46.8ml水)，摇匀静置6min，加入10ml4％naoh(3g氢氧化钠+72ml水)，加50％乙醇定容，摇匀静置20min，全波长扫描(400-600nm，采样间隔1nm)，确定最佳吸光度。
[0075]
总黄酮测定：芦丁标准品10mg于50ml容量瓶，加入50％乙醇溶解，定容，取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml分别置于25ml容量瓶，各加入50％乙醇至10ml(9.5、9、8、7、6、5、4ml)，加入1ml5％nano2(0.5g亚硝酸钠+9.5g离子水)，摇匀静置6min，加入1ml10％al(no3)3(1g硝酸铝+46.8ml水)，摇匀静置6min，加入10ml4％naoh(3g氢氧化钠+72ml水)，加50％乙醇定容，摇匀静置。510nm测吸光值，制作标曲。
[0076]
总黄酮溶液(xml或xg)加入50ml容量瓶，加50％无水乙醇定容，加入总黄酮溶液0.5ml于25ml容量瓶中(0.5ml50％乙醇为空白对照)，按上述测定步骤，测定吸光度。
[0077]
黄酮提取量见表4所示。
[0078]
表4无花果愈伤组织提取物与无花果组织黄酮含量测定
[0079] 黄酮提取量(mg/g)50％乙醇无花果愈伤组织提取物204.896950％乙醇无花果组织提取物12.15022
[0080]
由表4可知，无花果愈伤组织提取物中黄酮含量是无花果组织提取物中黄酮含量的17倍，说明无花果愈伤组织具有很强的抗氧化能力，能够清除氧自由基，相比于无花果组织，无花果愈伤组织在化妆品领域的应用具有意料不到的技术效果。
[0081]
试验5无花果愈伤组织提取物中多酚含量测定
[0082]
没食子酸标准液：称取没食子酸50mg充分溶于10ml无水乙醇，蒸馏水定容至100ml。分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于25ml容量瓶中定容。分别取不同质量浓度的没食子酸标液1.0ml，加5ml水，1ml福林酚试剂，震荡混匀，8min内加入3ml7.5％na2co3(7.5g碳酸钠+100ml水)避光反应2h，于765nm波长下测定吸光度值。
[0083]
取稀释倍数后的样品1ml，加5ml水，1mlfc试剂，混匀震荡，8min内加入3ml7.5％na2co3避光反应2h，于765nm波长下测定吸光度值，代入标曲。
[0084]
总酚含量见表5所示。
[0085]
表5无花果愈伤组织提取物与无花果组织总酚含量测定
[0086] 多酚含量(mg/g)50％乙醇无花果愈伤组织提取物30.8350％乙醇无花果组织提取物0.80
[0087]
由表5可知，无花果愈伤组织提取物中多酚含量是无花果组织提取物中黄酮含量的38倍，说明无花果愈伤组织具有很强的抗氧化能力，能够清除氧自由基，相比于无花果组织，无花果愈伤组织在化妆品领域的应用具有意料不到的技术效果。
[0088]
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种无花果愈伤组织提取物，其特征在于，以无花果愈伤组织细胞粉为原料，经提取溶剂预处理后进行离心制备而得。2.如权利要求1所述的一种无花果愈伤组织提取物，其特征在于，所述提取溶剂为10％-50％乙醇，或20％dmso。3.如权利要求1所述的一种无花果愈伤组织提取物，其特征在于，所述无花果愈伤组织细胞粉在提取溶剂中的体积占比为2.5％。4.如权利要求1-3任一项所述的一种无花果愈伤组织提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、取一定量的无花愈伤组织细胞粉进行研磨，研磨后加入到提取溶剂中进行预处理，得到预处理液；s2、将预处理液依次进行涡旋、超声、离心处理，取上清液，得到无花果愈伤组织提取物。5.如权利要求4所述的一种无花果愈伤组织提取物的制备方法，其特征在于，在s1中，所述研磨方式为液氮研磨。6.如权利要求4所述的一种无花果愈伤组织提取物的制备方法，其特征在于，在s2中，所述涡旋时间为10min，和/或超声时间为30min。7.如权利要求4所述的一种无花果愈伤组织提取物的制备方法，其特征在于，在s2中，所述离心条件为：转速为15000rpm，时间为10min。8.一种权利要求1-3任一项所述的无花果愈伤组织提取物或权利要求4-7任一项所述的制备方法得到的无花果愈伤组织提取物在制备抗氧化和/或促修复化妆品中的应用。9.一种抗氧化的化妆品，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的无花果愈伤组织提取物或权利要求4-7任一项所述的制备方法得到的无花果愈伤组织提取物。10.一种促修复的化妆品，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的无花果愈伤组织提取物或权利要求4-7任一项所述的制备方法得到的无花果愈伤组织提取物。

技术总结
本发明公开了一种无花果愈伤组织提取物及其制备方法和应用，涉及植物组织提取技术领域，其技术要点为：以无花果愈伤组织细胞粉为原料，经提取溶剂预处理后进行离心制备而得。所述提取溶剂为10％-50％乙醇，或20％DMSO。本发明通过验证，表明提取到的无花果愈伤组织提取物能够降低HaCaT细胞的氧化损伤；表明提取到的无花果愈伤组织提取物能够促进HaCaT细胞的修复。的修复。


技术研发人员：陈家悦 崔媛媛 王志伟 李淑雅 田美萍
受保护的技术使用者：杭州拾光欣雅生物技术有限公司
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/7/26