一种通过敲除转录因子促进生产β-胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株、方法和应用

一种通过敲除转录因子促进生产
β-胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株、方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种通过敲除转录因子促进生产β-胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株、方法和应用。


背景技术：

2.裂殖壶菌(schiochytrium sp.)作为一种海洋单细胞异养微生物。因其底物谱广泛，生长速度快且脂质含量高逐渐成为受研究者追捧的优良宿主细胞。目前，裂殖壶菌通过培养条件的优化，可实现其脂质积累量达到干重细胞(dcw)的55％以上。此外，裂殖壶菌天然还存在甲羟戊酸(mva)途径。因此，裂殖壶菌可利用mva途径生产萜类化合物。
3.β-胡萝卜素(c
40h56
)作为一类四萜化合物，其常见于许多植物、真菌和藻类。在人体内，β-胡萝卜素是维生素a的前体物质。微生物a对于抗癌、抗氧化和抗心血管疾病起着至关重要的作用。2020年全球β-胡萝卜素市场达到4.511亿美元，预计从2020年到2027年将增长2.1％，到2027年规模为5.234亿美元。此外，在α-、β-和γ-胡萝卜素在内的三种异构体中，β-胡萝卜素是最稳定和有效的一种。传统上，β-胡萝卜素通常通过化学合成或者植物提取。但是这两种方法往往成本高、耗时长且不可持续发展。而利用微生物的方式生产β-胡萝卜素，具有占地面积小，受季节、天气影响较小的优势，并且这种方式是可持续发展的。
4.目前，利用代谢工程策略提高萜类化合物产量。常用策略是过表达前体乙酰-coa相关基因和提高辅因子nadph的供给，使更多的代谢流流向目标化合物的合成。但是这种单一层面上的代谢工程策略往往需要同时对代谢途径中多个基因进行改造，这就导致了工作量增大且耗时长。同时可能会造成细胞内环境的不平衡，影响菌株性能。而转录因子(transcription factors，tfs)可实现在细胞层面上调控多个基因表达水平，具有全局性、高效性调控细胞性能的优势。
5.通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的公开文献。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服目前通过繁琐的代谢工程改造促进β-胡萝卜素的生产，提供一种仅通过敲除转录因子实现快速提高β-胡萝卜素滴度的裂殖壶菌工程菌株、方法和应用。
7.本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
8.一种通过敲除转录因子促进生产β-胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株，所述工程菌株是通过分别敲除裂殖壶菌hx-308基因组上转录因子a1189基因、a9257基因获得的，实现在细胞水平对裂殖壶菌代谢流的全局调控，促进裂殖壶菌β-胡萝卜的积累；
9.其中，a1189基因的核苷酸序列为seq id no.1，a9257基因的核苷酸序列为seq idno.2。
10.进一步地，所述裂殖壶菌hx-308的保藏编号为cctcc no.m209059。
11.进一步地，所述工程菌株为裂殖壶菌
△
a1189和
△
a9257的工程菌株，裂殖壶菌
△
a1189、
△
a9257的工程菌株相较于野生型裂殖壶菌hx-308的β-胡萝卜素滴度分别提高1.3倍、3.9倍。
12.如上所述的裂殖壶菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
13.(1)根据hx-308基因组测序，获得启动子p2845，终止子t2845，基因a1189和a9257上下游同源臂序列a1189up、a1189dw、a9257up、a9257dw；g418抗性基因neor其序列seq id no.3所示，设计引物，通过pcr获得相应的dna片段，进一步通过pcr获得融合dna片段；其中，启动子p2845的核苷酸序列为seq id no.5，终止子t2845的核苷酸序列为seq id no.6，a1189up的核苷酸序列为seq id no.7，a1189dw的核苷酸序列为seq id no.8，a9257up的核苷酸序列为seq id no.9，a9257dw的核苷酸序列为seq id no.10；
14.(2)通过一步克隆方法将获得的融合dna片段插入pzpk载体(sun w，yang x，wang x，et al.homologous gene targeting of a carotenoids biosynthetic gene in rhodosporidium toruloides by agrobacterium-mediated transformation[j].biotechnology letters，2017，39(7)：1001-1007.)，构建用于敲除a1189基因和a9257基因的重组质粒zl-a1189和zl-a9257并将其转入大肠杆菌dh5α；
[0015]
(3)通过对大肠杆菌转化子测序，获得正确的重组质粒，保菌，备用；
[0016]
(4)将测序正确的重组质粒，转入农杆菌agl-1(购自北京兴华越洋生物)，获得重组农杆菌zl-a1189和zl-a9257菌株；
[0017]
(5)借助农杆菌介导裂殖壶菌转化方法(huang pw,xuys,sun xm*,shi tq,guy,ye c,huang h.development of an efficient gene editing tool in schizochytrium sp.and improving its lipid and terpenoid biosynthesis.front nutr.2021dec 14；8:795651.)，实现裂殖壶菌基因组上a1189基因和a9257基因的敲除，获得裂殖壶菌
△
a1189和
△
a9257的工程菌株。
[0018]
进一步地，具体包括如下步骤：
[0019]
(1)重组质粒zl-a1189、zl-a9257的构建：
[0020]
以裂殖壶菌hx-308基因组为模板，分别使用p2845-f/r，t2845-f/r，a1189up-f/r，a1189dw-f/r，a9257up-f/r，a9257dw-f/r引物对进行pcr扩增。同时，以pzpk质粒为模板，使用g418-f/r引物对进行pcr扩增。最终获得相应的启动子p2845，终止子t2845，g418抗性基因neor，a1189和a9257上下游同源臂dna片段。其中，p2845-f/r、t2845-f/r、g418-f/r、a1189up-f/r、a1189dw-f/r、a9257up-f/r、a9257dw-f/r的核苷酸序列依次为seq id no.11-24；
[0021]
以pzpk质粒为骨架，使用核酸内切酶ecori和hindiii对pzpk进行双酶切，胶回收获得线性化载体；使用诺唯赞的一步克隆试剂盒ultra one step cloning kit进行一步克隆，将上一步获得的融合dna片段插入pzpk，构建重组质粒zl-a1189和zl-a9257；
[0022]
连接体系在50℃，培养30min，将连接体系转化大肠杆菌感受态dh5α；进行大肠杆菌的转化，在220rpm，37℃培养1h，然后3000rpm离心3min，最后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，于37℃培养箱中倒置过夜培养，培养时间＞12h，待长出转化子；
[0023]
从每个转化平板挑取4-6个转化子于5ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基
中，培养6-8h；将菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌株，保菌至-80℃(含20％的甘油)，备用；
[0024]
(2)重组农杆菌agl-a1189，agl-a9257的构建：
[0025]
将大肠杆菌dh5α中测序正确的质粒zl-a1189、zl-a9257，提取质粒，备用；
[0026]
将保存于-80℃的100μl农杆菌agl-1感受态取出，置于冰上10min；加1μg测序正确的质粒，进行农杆菌转化，在220rpm，28℃培养1h，然后3000rpm离心3min，弃上清，将剩余100-200μl菌液吹打混匀，均匀涂布在含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，倒置培养在28℃培养箱，待长出转化子；；
[0027]
挑取转化子用3ml含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，28℃，220rpm过夜培养，培养时间＞12h，将含有重组质粒的农杆菌agl-a1189、agl-a9257菌液保存于-80℃(含20％的甘油)；
[0028]
(3)重组裂殖壶菌
△
a1189和
△
a9257的构建：
[0029]
借助农杆菌介导的裂殖壶菌转化方法(huang pw,xuys,sun xm*,shi tq,guy,ye c,huang h.development ofan efficient gene editing tool in schizochytrium sp.and improving its lipid and terpenoid biosynthesis.front nutr.2021dec 14；8:795651.)，对裂殖壶菌hx-308基因组上a1189和a9257基因进行分别敲除。将农杆菌和裂殖壶菌分别处理后，各取两种菌液100μl等体积混合均匀，混合后的200μl菌液涂布于im固体培养基，诱导48h后，转移至gpys固体培养基，待长出转化子；从每个转化平板挑取三个转化子，分别命名为：
△
a1189和
△
a9257，保菌至-80℃(含20％甘油)。
[0030]
从每个转化平板挑取3个转化子，分别命名为：
△
a1189和
△
a9257，保菌至-80℃(含20％甘油)。
[0031]
如上所述的裂殖壶菌工程菌株在生产β-胡萝卜素方面中的应用。
[0032]
利用如上所述的裂殖壶菌工程菌株发酵生产β-胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
[0033]
从保菌管中取裂殖壶菌工程菌株于种子液中，28℃，170rpm/min培养，每隔24h转接一次，共转接两次，取第三代种子液转接到发酵培养基；发酵培养7天后，结束发酵，处理发酵液样品，测定β-胡萝卜素滴度(β-胡萝卜素滴度检测方法参考：harnkarnsujarit n,charoenrein s,roos yh.reversed phase hplc analysis ofstability and microstructural effects on degradation kinetics ofβ-carotene encapsulated in freeze-dried maltodextrin-emulsion systems.jagric food chem.2012sep 26；60(38):9711-8.)。
[0034]
进一步地，所述种子液培养基为：
[0035]
葡萄糖：50g/l，磷酸二氢钾：4g/l，酵母提取物：4g/l，硫酸钠：20g/l，七水硫酸镁：4.6g/l，硫酸铵：4.8g/l，氯化钠：1.25g/l，氯化钾：1g/l，味精：20g/l，0.1％微量元素，维生素b10.5 mg/l，维生素b60.5 mg/l，维生素b
12
0.25μg/l；其中，0.1％微量元素包含：七水硫酸锌：0.001g/l，五水硫酸铜：0.001g/l，硼酸：0.001g/l，硫酸铵：0.5g/l，一水硫酸锰：0.001g/l，一水锰酸钠：0.001g/l；
[0036]
发酵培养基为：葡萄糖：10g/l，磷酸二氢钾：4g/l，酵母提取物：4g/l，硫酸钠：12g/l，七水硫酸镁：2g/l，硫酸铵：4g/l，氯化钠：0.5g/l，硫酸钾：0.7g/l，氯化钙：0.15g/l，味精：20g/l，0.1％微量元素，维生素b10.5 mg/l，维生素b60.5 mg/l，维生素b
12
0.25μg/l；其
中，0.1％微量元素为：七水硫酸锌：8g/l，四水氯化镁：8g/l，六水氯化钴：0.1g/l，二水锰酸钠：0.1g/l，五水硫酸铜：6g/l，六水硫酸镍：6g/l，七水硫酸亚铁：20g/l；
[0037]
上述所有培养基在配置固体培养基时，需加入1.5％的琼脂。
[0038]
本发明取得的有益效果是：
[0039]
1、本发明避开了传统代谢工程策略，通过调控转录因子，实现对细胞全局性的调控，促进β-胡萝卜素的积累，提供了一种在蛋白质水平调控萜类化合物滴度的策略。
[0040]
2、本发明仅通过单一转录因子基因的敲除，显著提高了β-胡萝卜素的滴度。大大减少了传统代谢工程调控多个基因的繁琐步骤，提高了工作效率。
[0041]
3、本发明涉及两种转录因子的敲除促进裂殖壶菌生产β-胡萝卜素。转录因子a1189，所述转录因子a1189编码区长度为2637bp，编码的是氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶及其相关蛋白。转录因子a9257，所述转录因子a9257编码区长度为1044bp，编码的是锌转运蛋白及相关zip结构域蛋白。
[0042]
本发明通过分别敲除两个转录因子a1189和a9257，在细胞水平对裂殖壶菌进行全局调控，实现对细胞多基因表达水平的调控。不仅大大减少了多基因敲除的繁琐步骤，而且显著促进裂殖壶菌β-胡萝卜素的积累。
[0043]
4、本发明采用裂殖壶菌(schizochytrium sp.)hx-308为原始菌株，分别敲除转录因子a1189和a9257基因，促进裂殖壶菌β-胡萝卜素的积累，相较于原始菌株，β-胡萝卜素滴度分别提高1.3倍和3.9倍。本发明为提高β-胡萝卜素等萜类化合物滴度提供一个良好的策略。
附图说明
[0044]
图1为本发明中验证裂殖壶菌hx-308(wt)敲除a1189和a9257基因的琼脂糖凝胶电泳胶图；
[0045]
图2为本发明中野生型裂殖壶菌hx-308和工程菌株
△
a1189和
△
a9257生产β-胡萝卜素的滴度图；
[0046]
图3为本发明中转化子抗性基因neor测序结果验证图。
具体实施方式
[0047]
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
[0048]
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
[0049]
一种通过敲除转录因子促进生产β-胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株，所述工程菌株是通过分别敲除裂殖壶菌hx-308基因组上转录因子a1189基因、a9257基因获得的，通过在细胞水平对裂殖壶菌代谢流的全局调控，促进裂殖壶菌β-胡萝卜的积累；
[0050]
其中，a1189基因的核苷酸序列为seq id no.1，a9257基因的核苷酸序列为seq idno.2。
[0051]
较优地，所述裂殖壶菌hx-308的保藏编号为cctcc no.m209059。
[0052]
较优地，所述工程菌株为裂殖壶菌
△
a1189和
△
a9257的工程菌株，裂殖壶菌
△
a1189、
△
a9257的工程菌株相较于野生型裂殖壶菌hx-308的β-胡萝卜素滴度分别提高1.3倍、3.9倍。
[0053]
如上所述的裂殖壶菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0054]
(1)根据hx-308基因组测序，获得启动子p2845，终止子t2845，基因a1189和a9257上下游同源臂序列a1189up、a1189dw、a9257up、a9257dw；g418抗性基因neor其序列seq id no.3所示，设计引物，通过pcr获得相应的dna片段，进一步通过pcr获得融合dna片段；其中，启动子p2845的核苷酸序列为seq id no.5，终止子t2845的核苷酸序列为seq id no.6，a1189up的核苷酸序列为seq id no.7，a1189dw的核苷酸序列为seq id no.8，a9257up的核苷酸序列为seq id no.9，a9257dw的核苷酸序列为seq id no.10；
[0055]
(2)通过一步克隆方法将获得的融合dna片段插入pzpk载体(sun w，yang x，wang x，et al.homologous gene targeting of a carotenoids biosynthetic gene in rhodosporidium toruloides by agrobacterium-mediated transformation[j].biotechnology letters，2017，39(7)：1001-1007.)，构建用于敲除a1189基因和a9257基因的重组质粒zl-a1189和zl-a9257，并将其转入大肠杆菌dh5α；
[0056]
(3)通过对大肠杆菌转化子测序，获得正确的重组质粒，保菌，备用；
[0057]
(4)将测序正确的重组质粒，转入农杆菌agl-1，获得重组农杆菌zl-a1189和zl-a9257菌株；
[0058]
(5)借助农杆菌介导裂殖壶菌转化方法(huang pw,xuys,sun xm*,shi tq,guy,ye c,huang h.development of an efficient gene editing tool in schizochytrium sp.and improving its lipid and terpenoid biosynthesis.front nutr.2021dec 14；8:795651.)，实现裂殖壶菌基因组上a1189基因和a9257基因的敲除，获得裂殖壶菌
△
a1189和
△
a9257的工程菌株。
[0059]
较优地，具体包括如下步骤：
[0060]
(1)重组质粒zl-a1189、zl-a9257的构建：
[0061]
以裂殖壶菌hx-308基因组为模板，分别使用p2845-f/r，t2845-f/r，a1189up-f/r，a1189dw-f/r，a9257up-f/r，a9257dw-f/r引物对进行pcr扩增。同时，以pzpk质粒为模板，使用g418-f/r引物对进行pcr扩增。最终获得相应的启动子p2845，终止子t2845，g418抗性基因neor，a1189和a9257上下游同源臂dna片段。其中，p2845-f/r、t2845-f/r、g418-f/r、a1189up-f/r、a1189dw-f/r、a9257up-f/r、a9257dw-f/r的核苷酸序列依次为seq id no.11-24；
[0062]
以pzpk质粒为骨架，使用核酸内切酶ecori和hindiii对pzpk进行双酶切，胶回收获得线性载体；使用诺唯赞的一步克隆试剂盒ultra one step cloning kit进行一步克隆，，将上一步获得的融合片段插入pzpk，构建重组质粒zl-a1189和zl-a9257；
[0063]
连接体系在50℃，培养30min，将连接体系转化大肠杆菌感受态dh5α；进行大肠杆菌的转化，在220rpm，37℃孵育1h，然后3000rpm离心3min，最后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，于37℃培养箱中倒置过夜培养，培养时间＞12h，待长出转化子；
[0064]
从每个转化平板挑取4-6个转化子于5ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，培养6-8h；将菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌株，保菌至-80℃冰箱(含20％的甘油)，备用；
[0065]
(2)重组农杆菌agl-a1189，agl-a9257的构建：
[0066]
将大肠杆菌dh5α中测序正确的质粒zl-a1189、zl-a9257，提取质粒，备用；
[0067]
将保存于-80℃的100μl农杆菌agl-1感受态取出，置于冰上10min；加1μg测序正确的质粒；进行农杆菌转化，在220rpm，28℃培养1h，然后3000rpm离心3min，弃上清，将剩余100-200μl菌液吹打混匀，均匀涂布在含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，倒置培养在28℃培养箱，待长出转化子；
[0068]
挑取转化子用3ml含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素lb液体培养基，28℃，220rpm过夜培养，培养时间＞12h，将含有重组质粒的农杆菌agl-a1189、agl-a9257菌液保存于-80℃(含20％的甘油)；
[0069]
(3)重组裂殖壶菌
△
a1189和
△
a9257的构建：
[0070]
借助农杆菌介导的裂殖壶菌转化方法(huang pw,xuys,sun xm*,shi tq,guy,ye c,huang h.development ofan efficient gene editing tool in schizochytrium sp.and improving its lipid and terpenoid biosynthesis.front nutr.2021dec 14；8:795651.)，对裂殖壶菌hx-308基因组上a1189和a9257基因进行分别敲除；将农杆菌和裂殖壶菌分别处理后，各取两种菌液100μl等体积混合均匀，混合后的菌液涂布于im固体培养基，诱导48h后，转移至gpys固体培养基，待长出转化子，从每个转化平板挑取三个转化子，分别命名为：
△
a1189和
△
a9257，保菌至-80℃(含20％甘油)。
[0071]
如上所述的裂殖壶菌工程菌株在生产β-胡萝卜素方面中的应用。
[0072]
利用如上所述的裂殖壶菌工程菌株发酵生产β-胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
[0073]
从保菌管中取裂殖壶菌工程菌株于种子液中，28℃，170rpm/min培养，每隔24h转接一次，共转接两次，取第三代种子液转接到发酵培养基；发酵培养7天后，结束发酵，处理发酵液样品，测定β-胡萝卜素滴度(β-胡萝卜素滴度检测方法参考：harnkarnsujarit n,charoenrein s,roos yh.reversed phase hplc analysis ofstability and microstructural effects on degradation kinetics ofβ-carotene encapsulated in freeze-dried maltodextrin-emulsion systems.jagric food chem.2012sep 26；60(38):9711-8.)。
[0074]
较优地，所述种子液培养基为：
[0075]
葡萄糖：50g/l，磷酸二氢钾：4g/l，酵母提取物：4g/l，硫酸钠：20g/l，七水硫酸镁：4.6g/l，硫酸铵：4.8g/l，氯化钠：1.25g/l，氯化钾：1g/l，味精：20g/l，0.1％微量元素，维生素b10.5 mg/l，维生素b60.5 mg/l，维生素b
12
0.25μg/l；其中，0.1％微量元素包含：七水硫酸锌：0.001g/l，五水硫酸铜：0.001g/l，硼酸：0.001g/l，硫酸铵：0.5g/l，一水硫酸锰：0.001g/l，一水锰酸钠：0.001g/l；
[0076]
发酵培养基为：葡萄糖：10g/l，磷酸二氢钾：4g/l，酵母提取物：4g/l，硫酸钠：12g/l，七水硫酸镁：2g/l，硫酸铵：4g/l，氯化钠：0.5g/l，硫酸钾：0.7g/l，氯化钙：0.15g/l，味精：20g/l，0.1％微量元素，维生素b10.5 mg/l，维生素b60.5 mg/l，维生素b
12
0.25μg/l；其中，0.1％微量元素为：七水硫酸锌：8g/l，四水氯化镁：8g/l，六水氯化钴：0.1g/l，二水锰酸钠：0.1g/l，五水硫酸铜：6g/l，六水硫酸镍：6g/l，七水硫酸亚铁：20g/l；
[0077]
上述所有培养基在配置固体培养基时，需加入1.5％的琼脂。
[0078]
具体地，相关的制备及检测如下：
[0079]
下述各实施例中采用的培养基如下：
[0080]
lb液体培养基：氯化钠10g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，抗生素(包括：羧苄青霉素50mg/l，卡那霉素50mg/l)。
[0081]
im液体培养基：葡萄糖：2g/l，磷酸二氢钾：1.45g/l，磷酸氢二钾：2.05g/l，硝酸铵：0.5g/l，氯化钠：0.01g，七水硫酸镁：0.6g，氯化钠：0.3g，0.1％微量元素(包含：七水硫酸锌：0.001g/l，五水硫酸铜：0.001g/l，硼酸：0.001g/l，硫酸铵：0.5g/l，一水硫酸锰：0.001g/l，一水锰酸钠：0.001g/l)，吗啉乙磺酸一水合物：8.7g/l，丙三醇：5g/l，乙酰丁香酮：200μm。
[0082]
gpys液体培养基：葡萄糖：50g/l，海盐：20g/l，蛋白胨：10g/l，酵母提取物：5g/l，抗生素(包括：噻孢霉素：300μg/ml和g418：500μg/ml)。
[0083]
种子液培养基：葡萄糖：50g/l，磷酸二氢钾：4g/l，酵母提取物：4g/l，硫酸钠：20g/l，七水硫酸镁：4.6g/l，硫酸铵：4.8g/l，氯化钠：1.25g/l，氯化钾：1g/l，味精：20g/l，0.1％微量元素(包含：七水硫酸锌：0.001g/l，五水硫酸铜：0.001g/l，硼酸：0.001g/l，硫酸铵：0.5g/l，一水硫酸锰：0.001g/l，一水锰酸钠：0.001g/l)维生素b10.5mg/l，维生素b60.5 mg/l，维生素b
12
0.25μg/l。
[0084]
发酵培养基：葡萄糖：10g/l，磷酸二氢钾：4g/l，酵母提取物：4g/l，硫酸钠：12g/l，七水硫酸镁：2g/l，硫酸铵：4g/l，氯化钠：0.5g/l，硫酸钾：0.7g/l，氯化钙：0.15g/l，味精：20g/l，0.1％微量元素(七水硫酸锌：8g/l，四水氯化镁：8g/l，六水氯化钴：0.1g/l，二水锰酸钠：0.1g/l，五水硫酸铜：6g/l，六水硫酸镍：6g/l，七水硫酸亚铁：20g/l)维生素b10.5 mg/l，维生素b60.5 mg/l，维生素b
12
0.25μg/l。
[0085]
上述所有培养基在配制固体培养基时，需加入1.5％的琼脂。
[0086]
实施例1
[0087]
重组质粒zl-a1189和zl-a9257的构建：
[0088]
重组质粒zl-a1189和zl-a9257是为了将其导入农杆菌，分别对裂殖壶菌hx-308基因组(菌株保藏编号为cctcc no.m209059)中a1189和a9257基因进行敲除。基因a1189和a9257的核苷酸序列为seq id no.1、seq id no.2，具体如下：
[0089]
(1)根据基因组注释，找到组成型表达基因三磷酸甘油醛脱氢酶，其编号为a2845(seq id no.4)，以a2845起始密码子上游1kb为启动子p2845(seq id no.5)，终止密码子下游500bp为终止子t2845(seq id no.6)。
[0090]
基因a2845(1014bp)
[0091]
atggccgagcgcaagattcgcgtgggcgtcaatggctttgggcgcatcggacggctggcgacgaggttcctcctggactccgaggtctgcgaggtggtccacgtcaacgagctcaacgcagacgtgagcgtgtcggcgtaccttttggagttcgactcgatccatggcaagtgcggcaagaagattgaggtggacgatggctgcatcgttgtggatggcaagaaaatcacctattcgagctgcagcacgcccggcgaggtcgcctggaaggatactcaagttgatctcgtcctcgagtgctcgggcaagttcaacgacgagaccaagttgcaagcctacttttcgagcgatgtcaagcgtgtcctcgtgagcgcacccgtcaagggcgctgtcaacgttgtcgtcggctgcaatgagaacctcgtcgagccggataccaagattgtcactgctgccagctgcacaactaactgcatcgggcccgtcatcaagtgcatcgacgaaacctttggcatcgagcgcggtgtcattaacactgtgcacaacgttaccaacacacagagcattatggatgcgccaaacacgaaaaaggatgacccgcgtcgtgctcgtgcaggcatgctcaatctggcgccgacctcgacggggtccgccaaggctattaccatgatttttccgcacttgc
agggcaaactcaacggcgtggccattcgagtgcccttgcagaatgcctccatcaccgaccttacactcgagctcaagcgtaacgtcagcaaagaggaggtcaacgaggctctctccgctgctgctgatgaccatgtgctcggcttcgagacgcgtggtctcgtctcgacagattatattaacgacacacgttcttctattgtggacgccctttccactatggttgtcgacgacaagctcgtcaagattcttgcctggtatgataacgaaatgggctacagctcacgtatgcgcgatatcgccgagctcatggccaagcaaatgcaatag
[0092]
启动子p2845(1022bp)
[0093]
tttctcgacacttgtctccgggagtgtctgctcacgcatcagggactactcaagacacttgccaaactcatgaccacttgtttgctctttgcagagcagattggccgtttcgcgaatcagctccaggtcgacgagtcatccatgactgcggcactcgcagagcaaggtggtgcggggtcgaaagcaggtccaggccctggtcgcccgggaaagcaatctgcgtcgtcgtccgaggctgctgctgctgctgctgctgccaagaagcgcgcgcttcgcaaaacgcgcatcaaggttcaggagcagcacattcgtcgcatcgttacgcaggacagctatcagcaaatgattctacgatcacaagagaccttcgacggaatgcttagtcagttcatggacgagcttctcaaagaggccactcagggtgagtaccactcgcacctcaccaacctttgtacgcgcctcgactttaacgccttttaccaaaagtaggctggtgtagtactagtactagtataaattttgtcgtaaccttcgtcatccacgcctcatctcttgccttctgaattccaaacccatgcgcgtgcacttcgccgcaaccaccagtcacagctaaaagtgctggccactatcatcatcatcatggcaaaaagaacggcgaggcctaggcccccacaatgctggcagtgtgcatgaccgaagtgtaggtatagcgggcccttcctccactccaaggtgacggacgcatggcctcacacacaagtttcaaggaggtcgcccttgatccggtatcgaatcttctccgcactaaagcccgctccgcacggataaattcgggaccccgaaagcatcaacgtagtagctcgaattgcttcgtggatgagcagccaatcagacattgattgccagacaagcaaggcaaggcaaggcaaggcaaggcaaggcaaggcaaggcaaggcaaggcaaggcaaggcgaggcgaggcaaagcgggcagtcctgggccagcgagaggcgagagaaaag
[0094]
终止子t2845(508 bp)
[0095]
aaagtcgcacgcgagctttttacttttcctattattattttttttcttcctccgatccctcttgttgcaccagaaaacaacgcagaaacacgggagcttgacagcgtgaccacaggaaagatactatggatgagaacggaacgccaggtggaatacagaagtcgagggcatatctttgcgagcaacacatgttcgagccgcggaatcgaccccggacgccatggctggctggctgactggctgactgatccatgctcatgaaagcatggcaactcttgctggcgccggggcctctgtcgctcttgccgcttccgtgccacgttttgcctggacttgctccctttgtttgtttctcgcttccaggtccttctcgcgttctgcctcttcctcttccctttcccagtcctcttcttcaatatccatgtcgtcgtcttcgaatgcaaagtcacgcgaatcagagccaaattgtgctgcaaattcagcatactgctctagggtagccttatcg
[0096]
(2)根据基因组注释，分别找到编码氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶及其相关蛋白，其编号为a1189；编码氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶及其相关蛋白，其编号为a9257。分别选a1189和a9257起始密码子上游1 kb和终止密码子下游1 kb作为敲除目的基因的上下游同源臂(a1189up-seq id no.7，a1189dw-seq id no.8，a9257up-seq id no.9，a9257dw-seq id no.10。)。
[0097]
a1189up(1136 bp)
[0098]
cggcgatggtgacgatgatcaagacatggacgaagattgtgagatgacctttgatggcggtcatacaggatatggtcggatcattgacgaagaggatgaagaacttttgcaggcattctccaatgtgcacgtaccgaatgctcaccacttgtccggtcgcttttcaggctttcgcagtgtgactccggagcgaccatcgaatccaatggcgcaaatgcttgcctatgagcagcagcagcaacaccagcagcagcaacaccatgagcaacagcaactgaccctgaatattccgcagcatgcaagtctacgcccgatacacagccctggcgcagcctggtctcacggggcgcgtgccatctctcgatcgccgcatccaa
acagcgggatggtggccggcaagagaacaggcgaagcatcgccattaccgatgcttatgtcttccgagtatttctcgcctcgaaaaatgaagcgaagttccatgctggactctgggcgtagcaacagcatgagcagtcatggcagcgtaggcagcttcggaatggactcccttacaaggtccacgtctggtattcagtatggaaagtactggcctgatgcgagctcaatggcgcgtgccccaagtcgttgcggtattcgcgagacagacgagggatccatgtatggatctgacttgtctttccttgacgatagctccgagatcctctacactcctcgagatcagcatggggagcgatcccgtacctttagcatacactcgctatccccatcaccgcgcccaggccagttgcgtggtgggggtacgccaaaatccatatcaggcgcttctgctagcgcgactctcgatcgggccggcaatgtggcggccgcggcagcggcgaggtcggtggatggtctctccccgcttcgcgatgtgatgcgccaggttgggctttgaggcacagatatatatattcggaccaagtgaagactccgtctcgcaatgcagtcctgagattgctttttgctcaatgctctctctctctctctcttgttaagtgatgcgcaaaatatgtatacatacagaatctctcccgttttttttgttttgttttttctttcgagcctctcgagtgcaacacatgatggggaaaattgat
[0099]
a1189dw(925 bp)
[0100]
cctctccagctagctcttccttctcctctgcgccaccgcgcgagggcccgctgcgctccgctgcgctccgctccgctccgcacagctcggcgcaggccgcacccgggctctgtctccgccgcgccgcgatcggtgtatgcctgtctgtgcctgtctgcgcgcgcgcaagcaagcaagtaaggcaggcaaaaagcaagaaagcagtcgctgggactctcagccaggtgatgtattatagtagtccgtagtacgtattatagtagagtgtagtactacgccgcaaagagccccgccttctttgcgcttatttcgcgcctgctttgcttgcgcctttgggcgaacggggcgggcctcttccggccagcggggaggaagccccgccgctcccgccgcaatccgtcgctcgccggccggccgggtgctcatgacccgcgagctctcgcacgatgcgggcgctggcgcgcatgcgcacgcggcgatgcggcatcgccgcggaggctgcgccgatcttgatcgcgccaacgcggccgccccctcacccacgtcgcctgcgtcccctctgcgcgcggcggggccgcctgctcgctgaaaagcgttgcgcaggatatcctcgtccagaagtacaggatatcctaggcacctcccctgccggcgaggatatcctcttgcgcgtcaccgcgcgatgcgccatcatcgcggtttgcgcaagagggcgcggcgccgcgccgccccggaccgcgaggccggcgcggaagagctcgtcctcggggagcacgagctcgccacgcacagcccgagcagcgcggaaacccgcgccgcctccgggcctgccgcctcccgcgcgccccgctgcgcccgcacactcgcgcgcgcacccgcggacggcgcgagcggcgcgataaagggcgacgataggcacatcgtc
[0101]
a9257up(1008 bp)
[0102]
ggcccaacggctccttttcggcccatcaggctttccaccacagagagcatcgttttcgtttcgcttcattccactcttctttaataaaatccgtttgcgtcagcagcgcctcttgcgaggctgtcaaatgagagctcgtccgattgcaagaggagagtcgagcaacccctccagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaaagaaagaaaggaaatagtgtgaaggtcctactatcatgataaatgtagaacattgtccttgagcgaatcttttaggttttcacatggtgatgttctccttatacctacctacgcgttggttcgacaacctttccatggttagctcctgaaagcttgtgaatccaagtttcgtccgaagatttaggccgcaatacattcgtggatctgtctgccagtgggcaataaacgctttaaccacgaggcttaaaagtaggggctaactccaagctcttcgcgcagcctgtgcaacagagctcgacagtgagccctattttttctcagaaaagggaggaaatcggtgctattgtgaaactcgggctcagatggtaggcctctcatctttttttgcataacgtttgcaaagcggacattcgtggcgggggaaagtctaagatctatactaggtcccaggcaacaccatcgggtcacagattgattcgttgcctcttcgtactcacatttgcgccgagtgctggctgacccttgcctttgattcaagaatttaaaaaaaaaaaagtaagaaaatgggcatgtaggctacgtatacgaggctcgggcgagtaggcggcgactgaatcattcgaacaaaacggcttgggctatctatctgtcgtggcgcgcgacgacgtgcgcggcgacgcgcgttgacaatcaagagccgtctgtgaacaggcaccggacagggtgctgttcgcgtgcgcgaccgtcagcgccacgtttgctagcggcgtccgcggttggacaagaaaagtagctgcg
[0103]
a9257dw(1074 bp)
[0104]
agatgaaattagcatgagtgaaagcaagagctgtacagaactgatgtgagtaaacttgattacagcattattgagggatagggtagaacctgctttttcgactgagtttcatatgaaattggaattttcttcgtttcaaattagatggctcgaagaataggcgtagtcctatttttccatgcgaacaagccaaaaaaagggggcgcaatgagcttatgcgcaaagcccgctccaatctacctggccctccctggccgtctccatgacaacgtacgactggcttgaaggtttttgttcatttcataacagcgcctgcccatgcgcaagaagtgacaacaattctttgcaatgtgtctgactcgctttgtattttagcatcacttcattctcatgtaccaggcctatttgacaaaccattcaaccgtcttcatgcttccgaagtctcatcagagggttgcgttgccaaacaggctgtccttatttccaaagcgatcgcaaaacgcccttgtacgaaaactgtctccatgactttgttttccctactcccagccagttcggccgtacagcgcggacggcttcaagttctttttggtcgaaagaagacaagttaggcagctcgagtgactgcgagacgttgagaatgggtatcaagagaggcctatttttaaaacgacagaggttcaggctaacacgagccggactgtcctttggcctctaactgtctccgaattccccaatcatctccctttccatgactcatacaaaattcgttgtgtaccgggtcatacagccgcgtacaaccaaccacccattgcgttctcccgtgtcgcctaagtgcacggtccaatgcaatgcgacggtgactggagtcatgcttacagctgcgagctgactgcggggctaggcttagatgccagccattctacaaatgctctttacttcccgttcggcgccatggcagcgacacgacaactcctcgcgaaaagaatccaatcgccgcatcggtggccgtgccgatcgatgtaaagccaggctccgtataccgcctgcgccggccaggaaaggtgaaaatgg
[0105]
(3)根据基因组测序获得的序列，设计相应的引物，引物序列如表3所示。以裂殖壶菌hx-308基因组为模板，分别使用p2845-f/r，t2845-f/r，a1189up-f/r，a1189dw-f/r，a9257up-f/r，a9257dw-f/r引物对进行pcr扩增，pcr扩增程序分别如下表1和2所示，pcr扩增结束后，跑胶，切胶回收，扩增得到获得相应的启动子p2845，终止子t2845，a1189上下游同源臂，a9257上下游同源臂dna片段。
[0106]
(4)g418抗性基因neor其序列seq id no.3所示，根据neor的序列设计相应引物g418-f/r，以pzpk质粒为模板(sunw，yang x，wang x，et al.homologous gene targeting ofa carotenoids biosynthetic gene in rhodosporidium toruloides byagrobacterium-mediated transformation[j].biotechnology letters，2017，39(7)：1001-1007.)，使用g418-f/r引物对进行pcr扩增，获得相应的g418抗性基因neor的dna片段。最后通过pcr获得融合片段。验证结果如图3所示。
[0107]
表1 pcr扩增体系
[0108]
试剂体积(μl)2*primestarmax25引物p11引物p21模板1ddh2o22
[0109]
表2 pcr程序
[0110][0111]
表3引物序列
[0112][0113][0114]
(5)重组质粒zl-a1189，zl-a9257是以pzpk质粒为骨架，使用核酸内切酶ecori和hindiii对pzpk-neor进行双酶切，胶回收获得线性化载体。使用诺唯赞的一步克隆试剂盒ultra one step cloning kit进行一步克隆，将上一步获得的包含a1189和a9257上下同源臂融合片段插入pzpk，构建出重组质粒zl-a1189和zl-a9257。
[0115]
连接体系：
[0116]
试剂体积(μl)片段1酶切质粒2ddh2o5.72
×
ultraonestepcloningmix10
[0117]
于冰上配置连接体系，50℃孵育30min，将连接体系转化大肠杆菌感受态dh5α(购自北京擎科生物技术有限公司)，具体操作如下：
[0118]
(6)取-80℃冰箱中保藏的感受态细胞100μl，冰上解冻，使用移液枪将连接产物至于感受态细胞，吹打混匀混匀。冰浴30min后转入42℃水浴热激90s，再次冰浴3min。加入1ml lb液体培养基，220rpm，37℃孵育1h。3000g，离心3min，最后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，于37℃培养箱中倒置过夜培养(＞12h)，待长出转化子。
[0119]
(7)从平板挑取4-6个转化子于5ml lb(含有50μg/ml卡那霉素)液体培养基，培养6-8h。将菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌株，保菌至-80℃(含20％的甘油)，备用。结果如图3所示。
[0120]
实施例2
[0121]
重组农杆菌agl-a1189，agl-a9257的构建：
[0122]
(1)将实施例1中测序正确的质粒zl-a1189，zl-a9257，提取质粒，备用。
[0123]
(2)将保存于-80℃的100μl农杆菌agl-1感受态取出，置于冰上10min。加1μg测序正确的质粒，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。液氮速冻5min，37℃培养5min，立即冰浴2min。加入1ml lb液体培养基，28℃，220rpm培养1h。3000g，离心5min收集菌体。去除900μl上清后，用100μl液体重悬菌体，并均匀涂布在lb固体培养基(含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)，28℃培养箱，倒置培养待长出转化子。
[0124]
(3)挑取3-4个转化子用3mllb液体培养基(含50μg/ml carb和50μg/ml kan)，28℃，220rpm过夜培养(＞12h)，将含有重组质粒的农杆菌agl-a1189和agl-a9257菌液保存于-80℃(含20％的甘油)。
[0125]
实施例3
[0126]
重组裂殖壶菌
△
a1189和
△
a9257的构建：
[0127]
(1)取-80℃保存的野生型裂殖壶菌hx-308于种子液培养基中培养。取-80℃保存的实施例2最后制备的含有重组质粒的重组农杆菌agl-a1189，agl-a9257菌液，于lb固体培养基(含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)上划线。具体农杆菌介导裂殖壶菌转化方法参考文章huang pw,xu ys,sun xm*,shi tq,gu y,ye c,huang h.development of an efficient gene editing tool in schizochytrium sp.and improving its lipid and terpenoidbiosynthesis.front nutr.2021 dec 14；8:795651.。
[0128]
(2)将农杆菌和裂殖壶菌分别处理后，各取100μl菌菌液混合均匀，混合后的200μl菌液涂布于im固体培养基，诱导48h后，含有300μg/ml头孢噻肟钠和500μg/ml g418抗生素的gpys固体培养基进行筛选，28℃培养箱培养，待长出转化子。
[0129]
(3)从每个转化平板挑取4-6个转化子，提取转化子基因组。以提取的基因组为模板，分别利用引物对a1189-yz-f/r验证基因a1189是否敲除；引物对a9257-yz-f/r验证基因a9257是否敲除(结果如图1所示)。验证正确的工程裂殖壶菌分别命名为：
△
a1189，
△
a9257，保菌，备用。
[0130]
验证引物如下所示：
[0131]
a1189-yz-f：gcgtctaatggtcgcgaagatg
[0132]
a1189-yz-r：cgtgacccatggcgatgc
[0133]
a9257-yz-f：gtcagaccttggccgagc
[0134]
a9257-yz-r：cgaatcttctccgcactaaagcc
[0135]
实施例4
[0136]
重组裂殖壶菌
△
a1189和
△
a9257发酵，测定β-胡萝卜素产量：
[0137]
对裂殖壶菌工程菌株
△
a1189和
△
a9257发酵培养，测定β-胡萝卜素产量。
[0138]
从保菌管中取2ml工程菌株
△
a1189和
△
a9257在50ml种子液，28℃，170rpm/min培养，每隔24h转接一次，共转接两次，取2ml第三代种子液转接到发酵培养基。发酵培养7天
后，取1ml发酵液，对发酵液进行处理，并测定β-胡萝卜素滴度(结果如图2和表4所示)。具体发酵液处理和β-胡萝卜素测定方法参考文献：harnkarnsujarit n et al.reversed phase hplc analysis ofstability and microstructural effects on degradation kinetics ofβ-carotene encapsulated in freeze-dried maltodextrin-emulsion systems.j agric food chem.2012.60(38):9711-8。
[0139]
本发明借助农杆菌介导的裂殖壶菌转化方法，对野生型裂殖壶菌hx-308基因组上转录因子a1189和a9257基因进行敲除，获得工程裂殖壶菌a1189和a9257。通过对工程裂殖壶菌进行发酵，测定β-胡萝卜素的产量，从图2和表4可以看出，相较于野生型菌株，工程裂殖壶菌a1189和a9257的β-胡萝卜素滴度分别提高1.3倍和3.9倍。这为微生物提高β-胡萝卜素等萜类化合物滴度提供一个方便、快捷的策略。
[0140]
表4
[0141][0142]
现有技术中，郭建琦等人发明高产β-胡萝卜素的重组解脂亚罗酵母、其构建法与应用中涉及多个基因，多拷贝的整合提高β-胡萝卜素滴度(cn 114686385 b)。最优工程菌株β-胡萝卜素产量在对照菌株的基础上提高37.2％。而本发明仅敲除单个的转录因子就使得β-胡萝卜素滴度显著提高(敲除a9257基因，β-胡萝卜素滴度是对照的3.9倍)。
[0143]
本发明中使用的序列如下：
[0144]
seq id no.1：a1189(2637bp)核苷酸序列
[0145]
atgacgagcatggtggccaacttcgtggacaggctcgtcgcggaggtgcgacgcggcaacctggccgtcgcagggaccctcttcgtggtgctctgggtggcggtgaacgtggtgcagcaccgccgcgccatggcgaaaaaccgcgcggaacgcgccgagattaagcaaaagaacgccgaggcgcgcaagaggctcgcggacaagctcaagctgcccgtccgccccggcaaagacggctgggagttccgcaccggcccgcccagcatcggcaagctggaggtcttgggctcgggcattggccgcgccacttggctccctggcgaggaagactcgtgcaaatccttcccctttgaccgcgaaactaatgcaaactcccaggacaaggtctttcgcgatctcatgctcaaccgcgacaatgccggcggctccaagggcgtcacaactgctgtcgaaaatggcgagtccgtgtccgaggcggagcttgccgccaccacggctgcccgaggctctgtgttttattcgcgtctccagactgacgagggctggtgggctggcgactatggtggacccatgttcttgctgcccggactcgttttcgcgtgctatgctacgggtgtcgatctcggcagcgctcgccgcagcgccatcctgcgctacattatgaaccatcagcaagccctcgacggtggctggggcatgcatattgaaggccatagcactgtctttggcagtgttctcaactactcagccgcgcgcatgtgcggactcgagcatgacgacccgcgtgcggcccgcggccgcgaattcatcaaggcgcacggtggcgccgtcgcggcgccacagtgggccaaattctggctcgcctccatcggagcctacgagtggaccggtgtcaaccccacaccccccgagctctggctgctgccgtactggtttcccttccacccgggtcgcatgtggtgccactgccgcatggtttaccttccaatgagtgctctctttggctcgcgctgggtctacgaggacgccgaaaccgatccgctcgttgccagtctgcgcaaggagctctacacgaacgactacaagtccatcaactggggaagctttgccgtgcgcgagtgcatttcgcccaccgacctttacaacc
cgcaaagctggctcatgactgcagccaaccatgtcctgcacaacacgctggagaatcccattttgcgcgctgtctttcactaccctctcgacgttttgcgccgcgccggcaacaagttcgcctttgactacatccatgccgaggatgtccacacgaactggatcgacatcggacctgtgaacaaagccttccacgtgattgccaactatgccgcctttggcgccgactcggacaatttcctcaaccacgttgcccgcatcgacgactttttgtggctcgccgaggatggtctcaagatgcagggctacaatggctccatgttctgggacacctgctttgccacgcacgctctcgccaacgctgtcgtggcctccaagctcaagtctgaccagactgtcatcaccgacgctgatcgcgagcacatgtatcgcagcctcgtcaaggcctccaagtttgtcgacgatatgcaggtccgtgaggacgtctgggagagacacacctactttcgcgccgagtccgttggtggctggccctttagctcgcgtgaccacggatggcccatttccgattgcacggccgaaggtcttcgcgcctccattcttctcagcacctttccggattttaaggatgacaagaacctccaccacattccccaggagcgtctcgagcaggccgtcaagatcatgattgaactgcaaaatacatcgaccaacaatggctgggcctcgtatgagcttaaccgtggatacgactggtacgagctgctcaatccggcacaggtttttggcaacatcatgattgactattcatatgtggagtgcagctctgcctcggtgcaggccctctgcgagttttacaagcactttccgcagtccaagtacgccgatgctgcgctcacctcggcggccaagggtgttgagttcattattgatgttcagcgttccgacggctcctggtacggctcctgggcggtgtgctttacgtacggtgcctggttcggcatcgagggtctcgttgccggcctcgacacctgcggagaccgcatctccaagaagacgcgcgaagctgccaaaagtgcacttgtcaagggctgtgactttttattgtcgatgcaggacccgcaagatggcggctggggcgaatccatccgtgcttgcgccgcgcacgagtgggttgcgaacaaagaaggtagccaagtcgtcaatacggcttggtcgcttcttgcctttctccgtgccatcgagtatcttactgagaacgatgcagcgaactcgaggccctttttgcaaaagctcaagacgtcggcgcaccgtgccagtgtctttttgcgtgagcgccagctcgacgatggcgactgggcccaagagggtatttctggcgtgttcaaccactcctgctccattacgtacacggcctaccggaatgtctttcctatctgggctctcgctcgctacgccattgtcaattttgcagaggaaacgccaaagtaa
[0146]
seq id no.2：a9257(1044bp)核苷酸序列
[0147]
atgatcatcctcccgccagggttcgaagactatgacgccgtatggcagggggtgtacgggacgtgctttacgtggttcgtgacagcactcggggcagccatcgtcatgctcgtgccagaaggccttgcagaagcaacagaaggaaaattcctcgatgcaagtcttgggttcgctggcggcgtcatgctggcggcgagctactggtcccttcttgcaccgtctatcgaaatggccgaagaagctggctatggtgatttaagctttttgccagcagccatcggatttctcgcaggtgctttattcgtatttctggctgactttgtcctgcctgaatccgccgatgacccagaggcctacctgcgcgaagcagcagagttgcacgccaaaaagacggacgacgccattcggtacgatcccacaacatccagcaacacaaacacagaaacgtcagctagtgcgaccaatgttcgtcatcgtaaaaaggataataccaaggtgtcgtcctcggtcaagcccgaagaaaacctttcagccagcaatctcgagcgtgaagcacgcattttggctcagcaaaagtccaagtcatggcgccgtttgcttcttcttgtcatcgcggttactattcacaattttccagagggacttgccgtcggcgtgggctttggaggtgttggagtcacgaaatctgccacgcttgaggctgccgaagtgcttacgctcggtattgggattcaaaatttcccagaaggtctcgctgtctcgctgcccatgcgtagacttggctactccaagtggtggtgcttcttctacggtcaattgagcggcatggtggaaccaattggtggatttcttggcgccgctggtgtgcaatatgcacaacctgcgctcccttatgcactcgcctttgcagccggggccatggtctacgtcgtggtggactctattgtgcccgaagcacaaacccgaggaaatagcaagatggccacctggggtgccatggttggcttcctcgtgatgatgactcttgatgttgcccttggctaa
[0148]
seq id no.3：neor(795bp)核苷酸序列
[0149]
atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcg
ttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
[0150]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

技术特征：
1.一种通过敲除转录因子促进生产β-胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌株是通过分别敲除裂殖壶菌hx-308基因组上转录因子a1189基因、a9257基因获得的，实现在细胞水平对裂殖壶菌代谢流的全局调控，促进裂殖壶菌β-胡萝卜的积累；其中，a1189基因的核苷酸序列为seq id no.1，a9257基因的核苷酸序列为seq idno.2。2.根据权利要求1所述的裂殖壶菌工程菌株，其特征在于：所述裂殖壶菌hx-308的保藏编号为cctccno.m209059。3.根据权利要求1或2所述的裂殖壶菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌株为裂殖壶菌
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a1189和
△
a9257的工程菌株，裂殖壶菌
△
a1189、
△
a9257的工程菌株相较于野生型裂殖壶菌hx-308的β-胡萝卜素滴度分别提高1.3倍、3.9倍。4.如权利要求1至3任一项所述的裂殖壶菌工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)根据裂殖壶菌hx-308基因组测序，获得启动子p2845，终止子t2845，基因a1189和a9257上下游同源臂序列a1189up、a1189dw、a9257up、a9257dw；g418抗性基因neor，neor的序列为seq id no.3所示，设计引物，通过pcr获得相应的dna片段，进一步通过pcr获得融合dna片段；其中，启动子p2845的核苷酸序列为seq id no.5，终止子t2845的核苷酸序列为seq id no.6，a1189up的核苷酸序列为seq id no.7，a1189dw的核苷酸序列为seq id no.8，a9257up的核苷酸序列为seq id no.9，a9257dw的核苷酸序列为seq id no.10；(2)通过一步克隆方法将获得的融合dna片段插入pzpk载体，构建用于敲除a1189基因和a9257基因的重组质粒zl-a1189和zl-a9257，并将其转入大肠杆菌dh5α；(3)通过对大肠杆菌转化子测序，获得正确的重组质粒，保菌，备用；(4)将测序正确的重组质粒，转入农杆菌agl-1，获得重组农杆菌zl-a1189和zl-a9257菌株；(5)借助农杆菌介导裂殖壶菌转化方法，实现裂殖壶菌基因组上a1189基因和a9257基因的敲除，获得裂殖壶菌
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a1189和
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a9257的工程菌株。5.根据权利要求4所述的裂殖壶菌工程菌株的构建方法，其特征在于：具体包括如下步骤：(1)重组质粒zl-a1189、zl-a9257的构建：以裂殖壶菌hx-308基因组为模板，分别使用p2845-f/r，t2845-f/r，a1189up-f/r，a1189dw-f/r，a9257up-f/r，a9257dw-f/r引物对进行pcr扩增；同时，以pzpk质粒为模板，使用g418-f/r引物对进行pcr扩增；最终获得启动子p2845，终止子t2845，g418抗性基因neor，a1189和a9257上下游同源臂dna片段；其中，p2845-f/r、t2845-f/r、g418-f/r、a1189up-f/r、a1189dw-f/r、a9257up-f/r、a9257dw-f/r的核苷酸序列依次为seq id no.11-24；以pzpk质粒为骨架，使用核酸内切酶ecori和hindiii对pzpk进行双酶切，胶回收获得线性化载体；使用试剂盒进行一步克隆，将上一步获得的融合dna片段插入pzpk，构建重组质粒zl-a1189和zl-a9257；连接体系在50℃，培养30min，将连接体系转化大肠杆菌感受态dh5α；进行大肠杆菌的转化，在220rpm，37℃培养1h，然后3000rpm离心3min，最后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，于37℃培养箱中倒置过夜培养，培养时间＞12h，待长出转化子；
从每个转化平板挑取4-6个转化子于5ml含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，培养6-8h；将菌液测序，选择测序正确的菌株，用20％甘油保菌至-80℃，备用；(2)重组农杆菌agl-a1189，agl-a9257的构建：将大肠杆菌dh5α中测序正确的质粒zl-a1189、zl-a9257，提取质粒，备用；将保存于-80℃的100μl农杆菌agl-1感受态取出，置于冰上10min；加1μg测序正确的质粒，进行农杆菌转化，在220rpm，28℃培养1h，然后3000rpm离心3min，弃上清，将剩余100-200μl菌液吹打混匀，均匀涂布在含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，倒置培养在28℃培养箱，待长出转化子；挑取转化子用3ml含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，28℃，220rpm过夜培养，培养时间＞12h，将含有重组质粒的农杆菌agl-a1189、agl-a9257菌液用20％的甘油保存于-80℃；(3)重组裂殖壶菌
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a1189和
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a9257的构建：借助农杆菌介导的裂殖壶菌转化方法，对裂殖壶菌hx-308基因组上a1189和a9257基因进行分别敲除；将农杆菌和裂殖壶菌分别处理后，各取两种菌液等体积混合均匀，混合后的菌液涂布于im固体培养基，诱导48h后，转移至gpys固体培养基，待长出转化子；从每个转化平板挑取三个转化子，分别命名为：
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a1189和
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a9257，用20％甘油保菌至-80℃。6.如权利要求1至3任一项所述的裂殖壶菌工程菌株在生产β-胡萝卜素方面中的应用。7.利用如权利要求1至3任一项所述的裂殖壶菌工程菌株发酵生产β-胡萝卜素的方法，其特征在于：包括如下步骤：从保菌管中取裂殖壶菌工程菌株于种子液培养基中，28℃，170rpm/min培养，每隔24h转接一次，共转接二次，取第三代种子液转接到发酵培养基；发酵培养7天后，结束发酵，得到β-胡萝卜素。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述种子液培养基为：葡萄糖：50g/l，磷酸二氢钾：4g/l，酵母提取物：4g/l，硫酸钠：20g/l，七水硫酸镁：4.6g/l，硫酸铵：4.8g/l，氯化钠：1.25g/l，氯化钾：1g/l，味精：20g/l，0.1％微量元素，维生素b10.5mg/l，维生素b60.5mg/l，维生素b
12
0.25μg/l；其中，0.1％微量元素包含：七水硫酸锌：0.001g/l，五水硫酸铜：0.001g/l，硼酸：0.001g/l，硫酸铵：0.5g/l，一水硫酸锰：0.001g/l，一水锰酸钠：0.001g/l；发酵培养基为：葡萄糖：10g/l，磷酸二氢钾：4g/l，酵母提取物：4g/l，硫酸钠：12g/l，七水硫酸镁：2g/l，硫酸铵：4g/l，氯化钠：0.5g/l，硫酸钾：0.7g/l，氯化钙：0.15g/l，味精：20g/l，0.1％微量元素，维生素b10.5mg/l，维生素b60.5mg/l，维生素b
12
0.25μg/l；其中，0.1％微量元素为：七水硫酸锌：8g/l，四水氯化镁：8g/l，六水氯化钴：0.1g/l，二水锰酸钠：0.1g/l，五水硫酸铜：6g/l，六水硫酸镍：6g/l，七水硫酸亚铁：20g/l；上述所有培养基在配置固体培养基时，需加入1.5％的琼脂。

技术总结
本发明公开了一种通过敲除转录因子促进生产β-胡萝卜素的裂殖壶菌工程菌株，所述工程菌株是通过敲除裂殖壶菌HX-308基因组上转录因子A1189基因、A9257基因获得的，实现在细胞水平对裂殖壶菌代谢流进行全局调控，促进裂殖壶菌β-胡萝卜的积累；其中，A1189基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，A9257基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。本发明避开了传统代谢工程策略，通过调控转录因子，实现对细胞全局性的调控，促进β-胡萝卜素的积累。胡萝卜素的积累。胡萝卜素的积累。


技术研发人员：黄和 孙小曼 闫春晓 郭东升 马旺
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：2023.02.21
技术公布日：2023/7/26