诊断性小鼠源化抗人CK抗体及其制备方法和应用与流程

诊断性小鼠源化抗人ck抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及抗体基因工程技术领域，尤其涉及一种诊断性小鼠源化抗人ck抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细胞角蛋白cytokeratin(ck)是一种中间丝蛋白，分子量为40～67kd，存在于上皮组织的胞质内细胞骨架中，是上皮细胞及其肿瘤的较特异标志物。据报道，人体中共有54个功能性角蛋白基因存在，这些基因可以转录成20种不同的多肽。
3.广谱细胞角蛋白(pan cytokeratin，pck)主要标记角化上皮、复层鳞状上皮、复层上皮、增生的角化细胞和单层上皮，用于鳞癌(包括梭形变异)、各种腺癌(包括肾上腺癌、肝细胞癌)、移行细胞癌、小细胞癌、恶性间皮瘤、生殖细胞肿瘤(除外精原细胞瘤)，部分滑膜肉瘤、平滑肌肉瘤可以阳性标记。在鉴别诊断中可联合ema和cea等指标进行上皮性肿瘤与非上皮性肿瘤的鉴别诊断，也可以用于各种癌的研究。
4.因此，开发出一种染色性能强、敏感度高的pck诊断抗体对于肿瘤的诊断和研究具有重要意义。


技术实现要素：

5.为实现上述目的，本发明提供了一种诊断性小鼠源化抗人ck抗体，所述抗体重链的氨基酸序列包括如seq no.1所示的序列，所述抗体轻链的氨基酸序列包括如seq no.2所示的序列。
6.优选地，所述诊断性小鼠源化抗人ck抗体的重链所对应的核苷酸序列包括如seq no.3所示的序列，其轻链所对应的核苷酸序列包括如seq no.4所示的序列。
7.进一步，本发明提供了所述诊断性小鼠源化抗人ck抗体的制备方法，其使用免疫小鼠法来产生抗体，其中免疫小鼠的抗原包括如序列表seq no.5～seq no.40所示的核苷酸序列所对应的蛋白。
8.进一步，本发明提供了所述诊断性小鼠源化抗人ck抗体的筛选方法，该方法从噬菌体展示和单b细胞抗体测序的交集克隆中筛选出最终亲和力强、解离时间长的抗体。
9.在本发明的一种优选实施方式中，所述诊断性小鼠源化抗人ck抗体的筛选方法包括步骤：
10.1)ck抗原蛋白的制备；
11.2)免疫小鼠；
12.3)抗体筛选；
13.其中抗体筛选包括步骤：
14.a)构建fab抗体库：建立抗体轻链重链scfv库，从而构建噬菌体初筛文库；
15.b)目标噬菌体淘选：目标区域经过biotin标记的目标抗原阳性淘选，以及非目标蛋白复合物的阴性淘选，获得与目标抗原结合的目标抗体的cdr表达克隆菌株；
16.c)抗体dna测序：噬菌体筛选后通过抗体dna测序获得候选单克隆的序列；
17.d)单b细胞序列测定：构建单b细胞测序文库并进行bcr测序，找到两个文库的共同克隆，选择候选抗体；
18.e)抗体表达：构建表达载体，对候选抗体进行表达及纯化，用elisa法筛选出与抗原蛋白具有稳定高亲和力的抗体；
19.f)确定抗体序列：通过对抗体特征的鉴定、比较，最终挑选出亲和力强、解离时间长的抗体。
20.进一步，本发明提供了所述诊断性小鼠源化抗人ck抗体的另一种制备方法，所述方法以seq no.3所示的抗体重链核苷酸序列和seq no.4所示的抗体轻链核苷酸序列为模板，通过基因重组表达方法来制备所述抗体。
21.在本发明的一种优选实施方式中，所述诊断性小鼠源化抗人ck抗体的制备方法包括步骤：构建抗体基因载体、制备tg1感受态、转化、鉴定阳性克隆、重组质粒大量提取、抗体的分离及纯化。
22.进一步，本发明提供了所述诊断性小鼠源化抗人ck抗体在广谱ck蛋白免疫检测中的应用，其中所述免疫检测包括免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联免疫法。
23.更进一步，本发明提供了一种广谱ck蛋白免疫组化检测试剂，该试剂含有所述诊断性小鼠源化抗人ck抗体。
24.此外，本发明还提供了所述诊断性小鼠源化抗人ck抗体在制备肿瘤疾病诊断试剂中的应用，以及含有该诊断性小鼠源化抗人ck抗体的肿瘤疾病诊断试剂，所述肿瘤疾病包括但不限于鳞癌、腺癌、移行细胞癌、小细胞癌、恶性间皮瘤、生殖细胞肿瘤、滑膜肉瘤、平滑肌肉瘤。
25.本发明人在调取了uniprot数据库中36种ck蛋白dna序列的基础上，通过噬菌体展示和单b细胞抗体测序的交集克隆，最终筛选出了亲和力强、解离时间长的ck广谱(dgm037)抗体，其在免疫组化检测中阳性率与市售抗体相当，但染色强度明显高于市售ck广谱抗体，说明其敏感度更高，能有效避免假阴性结果。本发明提供的ck广谱抗体适于作为一种诊断性抗体用于肿瘤疾病的诊断。
附图说明
26.图1是ck广谱(dgm037)抗体和市售ck广谱抗体甲状腺乳头状癌的免疫组化染色结果对比图；
27.图2是ck广谱(dgm037)抗体和市售ck广谱抗体宫颈癌的免疫组化染色结果对比图；
28.图3是ck广谱(dgm037)抗体和市售ck广谱体胎盘的免疫组化染色结果对比图。
具体实施方式
29.实施例1ck广谱单克隆抗体的筛选
30.1.抗原蛋白的制备
31.根据参比ck(泛)蛋白抗体说明书，参比蛋白的结合抗原为分子量范围在40～64kd的多种ck蛋白。根据此要求，本实施例调取uniprot数据库中在此范围内的36种ck蛋白dna
序列(见序列表seq no.5～seq no.40)，通过常规的基因重组表达方法获得36种ck抗原蛋白。
32.2.免疫小鼠
33.选择6～8周龄、雌性、体重18～22g、毛色光泽、活动自如的健康balb/c小鼠5只，用制备的ck泛抗原(36种抗原蛋白等比例混合)进行免疫刺激，之后获取小鼠脾脏进行rna抽提和b细胞固定，并取血测效价。
34.3.抗体筛选
35.1)构建fab抗体库：通过反转录、体外基因扩增建立抗体轻链重链scfv库，从而构建噬菌体初筛文库，为下一步淘选做准备；
36.2)目标噬菌体淘选：目标区域经过biotin标记的目标抗原阳性淘选，以及非目标蛋白复合物的阴性淘选，获得与目标抗原结合的目标抗体的cdr表达克隆菌株，阳性克隆鉴定：用elisa初筛；
37.3)抗体dna测序：噬菌体筛选后通过抗体dna测序获得候选单克隆的序列；
38.4)单b细胞序列测定：构建单b细胞测序文库并进行bcr测序，找到两个文库的共同克隆，选择候选抗体；
39.5)抗体表达：构建表达载体，对候选抗体进行表达及纯化，用elisa法筛选出与抗原蛋白具有稳定高亲和力的抗体；
40.6)确定抗体序列：通过对抗体特征的鉴定、比较，最终挑选出亲和力强、解离时间长的抗体：ck广谱抗体(dgm037)，其重链的氨基酸序列如seq no.1所示，轻链的氨基酸序列如seq no.2所示。
41.实施例2免疫组化结果的比较
42.本实施例将本发明实施例1中获得的ck广谱(dgm037)抗体和市售ck广谱(ael/ae3/pck26)抗体的免疫组化结果做比较。
43.本实施例中免疫组化过程中除了一抗以外的其它试剂和实验条件均相同，一抗的浓度也相同，染色步骤可概括为：
44.1.脱蜡至水：
①
烤片；
②
用二甲苯脱蜡；
③
依次用无水乙醇、无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中浸泡，使其水化；
45.2.抗原修复：
①
用蒸馏水洗去切片表面的酒精；
②
将切片置入预热充分的修复缓冲液中，持续水浴煮沸后保温；
③
取出修复盒，使其自然冷却至室温；
46.3.滴加过氧化氢：pbs缓冲液清洗组织后，滴加3％h2o2，室温孵育；
47.4.滴加一抗：pbs缓冲液清洗组织后，滴加一抗，37℃孵育；
48.5.滴加二抗：pbs缓冲液清洗组织后，滴加二抗，室温孵育；
49.6.dab显色：
①
用pbs缓冲液清洗组织；
②
配制dab显色液；
③
滴加dab显色液，室温下镜检显色；
50.7.苏木素复染：
①
用自来水清洗切片表面；
②
将切片置入苏木素染色缸中浸泡，取出后用自来水清洗；
③
进入1％盐酸酒精中分化，迅速取出，自来水冲洗；
51.8.脱水封片：
①
将切片依次用90％乙醇、无水乙醇、无水乙醇浸泡；
②
用电吹风吹干残留组织表面的酒精，树脂封片；
52.9.免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原
部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：
①
样本为弱阳性；标记为“+”；
②
样本为中度阳性；标记为“++”；
③
样本为高度阳性；标记为“+++”；
④
样本为阴性，标记为
“‑”
。
53.结果：
54.将本ck广谱(dgm037)抗体和市售ck广谱抗体在不同人体肿瘤组织芯片(包括91例肿瘤组织)的检测，检测组织涉及食管、胃、结肠、直肠、肝、胰腺、肺、乳腺、肾、前列腺、卵巢、子宫、宫颈的组织芯片，进行同步检测并比较检测结果。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表：
[0055][0056]
图1为甲状腺乳头状癌，图2为宫颈癌，图3为胎盘的免疫组化染色结果对比图，其中左侧为ck广谱(dgr037)抗体的染色结果，右侧为市售ck广谱抗体的染色结果，图中可以看出ck广谱(dgm037)抗体的染色强度更强(颜色更深、对比度更强)。
[0057]
以上结果显示ck广谱(dgm037)抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在免疫组化检测中，阳性率与市售抗体相当，但染色强度高于市售抗体，ck广谱(dgm037)抗体染色强度明显高于市售ck广谱的染色强度，说明其敏感度更高，能有效避免假阴性结果。
[0058]
实施例3ck广谱(dgm037)抗体的制备
[0059]
1.构建抗体基因载体
[0060]
1)pcr
[0061]
在抗体重链(seq no.3)两端引入msci和noti酶切位点，设计引物如下：
[0062]
anti-ck-h-f5
’‑
tggccagcaatgtacttgggactgaactgtgtattcatagtttttctct-3’anti-ck-h-r5
’‑
gcggccgcttacatggtcccaggcattgctgggtgct-3’[0063]
在抗体轻链(seq no.4)两端引入ecori和hindiii酶切位点，设计引物如下：
[0064]
anti-ck-l-f5
’‑
gaattcgcaatgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctgga-3’anti-ck-l-r5
’‑
aagcttacactcattcctgttgaagctcttgacaat-3’[0065]
pcr体系及反应条件：
[0066]
试剂体积10
×
pcr buffer50μl25mm mgcl25μl10mm dntp mixture4μl50μm1μl上下游引物1μltaq dna polymerase(5u/μl)1μl模板dna1μl
ddh2o36μl
[0067]
首次循环前模板预变性94℃，5分钟；
[0068]
变性94℃，30秒；
[0069]
退火55℃，45秒；
[0070]
延伸72℃，45秒；
[0071]
反应30个循环，在末次循环后，样品仍需72℃继续延伸10分钟以补平末端，4℃保存。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，分别在相应的长度处回收目的片段。
[0072]
2)载体连接
[0073]
上述pcr反应产物连接至ptt5载体：取7μl pcr反应产物，加入1μl ptt5载体、10
×
连接缓冲液1μl、t4 dna连接酶1μl，16℃连接过夜。连接后的载体命名为：ptt5-anti-ckh和ptt5-anti-ckl。
[0074]
2.制备tg1感受态：
[0075]
1)挑取单一tg1菌落于液体lb培养基中，37℃振荡培养过夜后再按1∶100的比例接种于lb培养基中，37℃振荡培养至od
260
值为0.5；
[0076]
2)离心沉淀细菌，加入预冷的100mm cacl2溶液，冰浴30分钟；
[0077]
3)再次离心沉淀细菌，加入预冷的100mm cacl2溶液，冰浴1小时以上，备用。
[0078]
3.转化：
[0079]
1)取30～50ng重组表达质ptt5-anti-ckh和ptt5-anti-ckl、100μl感受态细菌，混合冰浴30分钟；
[0080]
2)42℃热休克90秒，冰浴2分钟；
[0081]
3)加液体lb培养基，37℃振荡培养45分钟；
[0082]
4)低速离心后重悬细菌，将之涂布于含50μg/ml amp的lb固体平板；
[0083]
5)37℃平放20分钟，恒温培养箱倒置培养12～14小时；
[0084]
6)挑取单个菌落于lb液体培养基(含氨苄)中，37℃振荡培养过夜。
[0085]
4.鉴定阳性克隆：
[0086]
1)各载体挑取3个单克隆菌落，接种于含50μg/ml amp的lb液体培养基，37℃振荡培养过夜；
[0087]
2)10000rpm离心1分钟收获细菌，提取质粒dna；
[0088]
3)测od260/od280决定质粒含量；
[0089]
4)取eppendorf管，依次加入
[0090]
质粒dna2μl10
×
酶切缓冲液5μlecori、hindiii各1μl去离子水22μl
[0091]
置37℃，1小时；
[0092]
5)1％琼脂糖凝胶电泳检测；
[0093]
6)测序：取50μl酶切鉴定正确的克隆菌液送测序。
[0094]
5.重组质粒的大量提取
[0095]
1)质粒构建成功的菌种接种入lb液体培养基中，37℃恒温180rpm摇床培养12～14
小时；
[0096]
2)用无内毒素质粒大提试剂盒对菌液提取质粒dna。
[0097]
6.重组质粒瞬时转染hek293e细胞
[0098]
1)采用pei转染法，将其重组质粒dna瞬时转染hek293e细胞；
[0099]
2)转染前12～24小时内，将hek293e细胞在含胎牛血清的10％dmem培养基悬液中进行传代培养，传代密度为4
×
105ml。
[0100]
3)制备质粒dna-pei混合物，pei与dna比例为3∶1，配方如下表所示：
[0101][0102][0103]
4)将待转染的hek293e细胞移入无血清dmem培养基中，然后将dna-pei混合物滴加至其中；
[0104]
5)细胞转染3小时后，换用等体积的含有10％胎牛血清的10％dmem的培养基；
[0105]
6)在37℃、5％co2培养箱中培养36～48小时后，将收获的细胞上清液进行分离与纯化。
[0106]
7.抗体的分离及纯化
[0107]
利用proteina柱进行抗体纯化，具体步骤如下：
[0108]
1)样品预处理：将表达抗体的细胞上清用6000rpm，离心20分钟，弃沉淀，向上清中加入na2hpo4·
12h2o颗粒，搅拌溶解，调节溶液的ph至8.0～8.5，然后用0.4μm滤膜过滤，去除细胞碎片等杂质；
[0109]
2)将akta出液口和进液口连接，清洗机器，将a、b管插入到0.2mol/lnaoh溶液(gradient：50％b)，流速设置为5～10ml/min，直到ph上升至10.6左右并保持稳定后停止进液。再将a、b管插入naoh的部分用ddh2o冲洗干净，浸入ddh2o的瓶中(gradient：50％b)，流速仍为5～10ml/min，使ph降低，uv值至稳定状态；
[0110]
3)流速调为2ml/min装柱，避免装柱过程中产生气泡；
[0111]
4)柱平衡：将a管插入0.2mol/lna2hpo4·
12h2o溶液，b管插入0.1mol/l柠檬酸，gradient：100％b(100％柠檬酸)，流速5ml/min，使ph稳定至8.2～8.5，将uv值调零；
[0112]
5)上样：将a管插入样品溶液中，gradient：0％b，流速5ml/min；
[0113]
6)柱清洗：将a管口用ddh2o冲洗后，插入na2hpo4·
12h2o溶液中，gradient：5％b，流速6ml/min；
[0114]
7)柱洗脱：gradient：75％b，流速不变，此时应注意uv峰值变化，如果出现迅速上升的情况，就可以收集样品，并预先在收集管中加入适量的na2hpo4·
12h2o固体颗粒；
[0115]
8)再次平衡柱子，μradient：100％b，flow rate：5ml/min；
[0116]
9)纯化完后，将a、b管口用ddh2o冲洗后插入20％乙醇中，gradient：50％b，流速8ml/min。
[0117]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种诊断性小鼠源化抗人ck抗体，其特征在于，所述抗体重链的氨基酸序列包括如seq no.1所示的序列，所述抗体轻链的氨基酸序列包括如seq no.2所示的序列。2.如权利要求1所述的诊断性小鼠源化抗人ck抗体，其特征在于，所述抗体的重链所对应的核苷酸序列包括如seq no.3所示的序列，所述抗体的轻链所对应的核苷酸序列包括如seq no.4所示的序列。3.一种如权利要求1或2所述的诊断性小鼠源化抗人ck抗体的制备方法，其特征在于，使用免疫小鼠法来产生所述抗体，其中免疫小鼠的抗原包括如序列表seq no.5～seq no.40所示的核苷酸序列所对应的蛋白。4.一种如权利要求1或2所述的诊断性小鼠源化抗人ck抗体的筛选方法，其特征在于，所述方法从噬菌体展示和单b细胞抗体测序的交集克隆中筛选出最终亲和力强、解离时间长的抗体。5.如权利要求4所述的诊断性小鼠源化抗人ck抗体的筛选方法，其特征在于，包括步骤：1)ck抗原蛋白的制备；2)免疫小鼠；3)抗体筛选；其中抗体筛选包括步骤：a)构建fab抗体库：建立抗体轻链重链scfv库，从而构建噬菌体初筛文库；b)目标噬菌体淘选：目标区域经过biotin标记的目标抗原阳性淘选，以及非目标蛋白复合物的阴性淘选，获得与目标抗原结合的目标抗体的cdr表达克隆菌株；c)抗体dna测序：噬菌体筛选后通过抗体dna测序获得候选单克隆的序列；d)单b细胞序列测定：构建单b细胞测序文库并进行bcr测序，找到两个文库的共同克隆，选择候选抗体；e)抗体表达：构建表达载体，对候选抗体进行表达及纯化，用elisa法筛选出与抗原蛋白具有稳定高亲和力的抗体；f)确定抗体序列：通过对抗体特征的鉴定、比较，最终挑选出亲和力强、解离时间长的抗体。6.一种如权利要求1或2所述的诊断性小鼠源化抗人ck抗体的制备方法，其特征在于，以seq no.3所示的抗体重链核苷酸序列和seq no.4所示的抗体轻链核苷酸序列为模板，通过基因重组表达方法来制备所述抗体。7.权利要求1或2所述的诊断性小鼠源化抗人ck抗体在广谱ck蛋白免疫检测中的应用。8.权利要求1或2所述的诊断性小鼠源化抗人ck抗体在制备肿瘤疾病诊断试剂中的应用。9.一种广谱ck蛋白免疫组化检测试剂，其特征在于，所述试剂含有如权利要求1或2所述的诊断性小鼠源化抗人ck抗体。10.一种肿瘤疾病诊断试剂，其特征在于，所述试剂含有如权利要求1或2所述的诊断性小鼠源化抗人ck抗体。

技术总结
本发明公开了一种诊断性小鼠源化抗人CK抗体及其制备方法和应用，所述抗体重链的氨基酸序列包括如SEQ NO.1所示的序列，所述抗体轻链的氨基酸序列包括如SEQ NO.2所示的序列；所述抗体的重链所对应的核苷酸序列包括如SEQ NO.3所示的序列，所述抗体的轻链所对应的核苷酸序列包括如SEQ NO.4所示的序列。本发明在调取了UNIPROT数据库中36种CK蛋白DNA序列的基础上，通过噬菌体展示和单B细胞抗体测序的交集克隆，最终筛选出了亲和力强、解离时间长的CK广谱抗体，其在免疫组化检测中阳性率与市售抗体相当，但染色强度明显高于市售CK广谱抗体，说明其敏感度更高，能有效避免假阴性结果。能有效避免假阴性结果。能有效避免假阴性结果。


技术研发人员：季天海 林清源 邵巍 李亚伟 陈俊
受保护的技术使用者：上海大格生物科技有限公司
技术研发日：2023.01.20
技术公布日：2023/7/26