一种器官深度过冷保存方法

1.本发明属于生物医学工程领域技术领域，具体涉及一种器官深度过冷保存方法。


背景技术：

2.目前大型器官的保存方法大致可以分为两种：静态低温保存(static cold storage，scs)、机械灌注(machine perfusion，mp)。
3.静态低温保存的原理是将供体器官中的血液置换为器官保存液，并迅速将器官保存于低温状态(一般为4℃)。因为在低温下，细胞的代谢以及酶类的活性维持在较低水平，器官的新陈代谢得到抑制，器官对缺血、缺氧等不利因素的耐受性增强，所以器官能在离体的状态下保存一段时间。scs是目前最常采用的器官保存方法。然而，scs存在许多局限性，如保存时间短(24-36小时)，易引起细胞水肿、组织损伤、代谢物累积、酸中毒等不良反应，并且难以评估供体器官的功能和活力，器官修复的机会有限。
4.机械灌注的原理是将供体器官的血管与机械灌注系统相连，在器官保存、转运阶段通过该系统为器官持续提供代谢所需的营养物质并排除器官代谢产物。mp最主要的问题是设备复杂，价格昂贵，维护成本高，且携带和运输不方便。


技术实现要素：

5.为延长肾脏保存的时间、提高器官保存的质量，本发明提出了一种器官深度过冷保存方法，该方法可实现更低的过冷温度，进一步降低生物样品的代谢速率，增加保存时间。
6.为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.一种器官深度过冷保存方法，包括：
8.将离体器官放入盛有保存液的容器中，使离体器官浸没在保存液底部；
9.加入密封油使得密封油置于保存液上层表面，静置设定时间；
10.静置后吸取密封油和保存液交界面的气泡，再将容器转入设置好温度的保温设备中进行深度过冷保存；所述温度≤-4℃。
11.作为本发明进一步改进，所述保存液为uw液。
12.作为本发明进一步改进，所述保存液中还添加有0.1mol/l的sib。
13.作为本发明进一步改进，所述保存液为添加0.1mol/l sib、5％ peg和4％pva(9kd)的uw溶液。
14.作为本发明进一步改进，所述密封油加入量满足密封油完全覆盖于保存液上层表面，且交界面没有气泡的残留。
15.作为本发明进一步改进，所述密封油为矿物油、植物油或动物油。
16.作为本发明进一步改进，所述温度为≤-4℃，深度过冷保存时间为≥7天。
17.作为本发明进一步改进，所述温度为-10℃，深度过冷保存时间为4天。
18.作为本发明进一步改进，所述将离体器官放入盛有保存液的容器中之前还包括：
对离体器官进行在体灌注，灌注液为去掉羟乙基淀粉的uw溶液。
19.作为本发明进一步改进，进行深度过冷保存后，还包括梯度温度灌注复温步骤，所述梯度温度灌注复温步骤包括：
20.复温灌注液为dmem培养基，先对肾脏进行t1时间的4℃培养基灌注，然后t2时间的26℃灌注，最后t3时间的37℃灌注。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.本发明肾脏保存方法-深度过冷保存，密封油完全覆盖于保存液上层表面，能够稳定地将生物样品保存在-10℃甚至更低而不冻结。与一般的过冷保存方法相比，深度过冷技术可实现更低的过冷温度，进一步降低生物样品的代谢速率，增加保存时间，由于成本低廉、操作简便、效果优良，该方法在细胞治疗、组织工程和器官移植等领域有着广阔的应用前景。
附图说明
23.为了更清楚地说明本技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.附图用于展示本发明所用到的载体示意图以及实验结果，与本发明实施例一起用于解释本发明。
25.图1为本发明给出的器官深度过冷保存方法流程图；
26.图2为本发明实施例给出的深度过冷保存大鼠肾脏的方法流程图；
27.图3为本发明实施例给出的深度过冷保存流程流程图；
28.图4为本发明实施例给出的保存后肾脏的形貌结构，炎症损伤(he染色、masson染色)对比图；
29.图5为本发明实施例给出的肾脏的湿干重比；
30.图6为本发明实施例给出的优化保存液后的肾脏形貌结构(he染色)图；
31.图7为本发明实施例给出的肾损伤定量分析图；
32.图8为本发明实施例给出的损伤因子、功能因子、炎症因子的检测图。
具体实施方式
33.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
34.本技术中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b的情况。其中a，b可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
35.本技术中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表
示：a,b,c,a～b(即a和b),a～c,b～c,或a～b～c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
36.研究表明，当水-油界面取代了水-空气界面后，冰晶在水表面异相成核的能垒几乎能提高到均相成核的水平。深度过冷技术基于此原理，用适当的油相密封水溶液，去除水-空气界面这一主要的冰晶异相成核区域，可以有效地抑制冰晶生成，使水溶液的过冷度提高，过冷时间延长。
37.为延长肾脏保存的时间、提高肾脏保存的质量，本发明提出了一种器官深度过冷保存方法，具体以肾脏保存方法-深度过冷保存为例进行说明。深度过冷保存是利用超低温技术对生物样品进行长期保存的方法，能够稳定地将生物样品保存在-10℃甚至更低而不冻结。如图1所示，该方法具体包括如下步骤：
38.s1，将离体器官放入盛有保存液的容器中，使离体器官浸没在保存液底部；
39.s2，加入密封油使得密封油置于保存液上层表面，静置设定时间；
40.s3，静置后吸取密封油和保存液交界面的气泡，再将容器转入设置好温度的保温设备中进行深度过冷保存；所述温度≤-4℃。
41.与一般的过冷保存方法相比，深度过冷技术可实现更低的过冷温度，进一步降低生物样品的代谢速率，增加保存时间，由于成本低廉、操作简便、效果优良，该方法在细胞治疗、组织工程和器官移植等领域有着广阔的应用前景。
42.作为具体实施例，本发明实施例的保存液为uw液。为降低结冰率，保存液中还添加有0.1mol/l的sib。
43.作为研究表明，本发明实施例采用的保存液优选为添加0.1mol/l sib、5％peg和4％ pva(9kd)的uw溶液。
44.上述方法中，密封油加入量满足密封油完全覆盖于保存液上层表面。确保密封油对保存液进行密封。所述密封油为石蜡油或其他类似性能的矿物质油均可。也可以是橄榄油、肉豆蔻油、轻矿物油等其他密封油。即所述密封油为矿物油、植物油或动物油。
45.本技术实施例中深度过冷保存的温度为≤-4℃，深度过冷保存时间为≥7天。一般可以满足温度为-13℃～-4℃，深度过冷保存时间为0～7天。
46.研究表明还可以保存超过7天，目前探索最优保存效果的条件为：温度为-10℃，保存时间为4天。当然本发明实施例还可以为温度为-13℃，时间为7天，温度为-12℃，时间为6天，温度为-8℃，时间为3天，温度为-4℃，时间为2天。
47.为了提高保存效果，将离体器官放入盛有保存液的容器中之前还包括：对器官进行在体灌注，灌注液为去掉羟乙基淀粉的uw溶液。
48.同时，进行深度过冷保存后，还包括梯度温度灌注复温步骤，所述梯度温度灌注复温步骤包括：
49.复温灌注液为dmem培养基，先对肾脏进行t1时间的4℃培养基灌注，然后t2时间的26℃灌注，最后t3时间的37℃灌注。
50.以下以具体实施例和附图为例对本发明的具体内容进行详细说明。
51.实施例
52.图2所示为深度过冷保存肾脏的方法示意图。将摘取的处理好的大鼠肾脏放入盛有15ml uw液离心管中，使肾脏浸没在底部，将石蜡油(sigma，cas：8012-95-1，po)沿着离心
管壁缓缓加入约3ml，石蜡油置于保存液上层表面，静置片刻，将移液枪的枪头缓慢伸入液体，吸取石蜡油和保存液交界面的气泡(气泡的干扰将影响过冷的成功率)，最后将离心管转入设置好温度的冰箱中，一个过冷样本就制备完成了。为降低结冰率，保存液中添加了0.1mol/l的肌醇类冰晶抑制剂sib。其中，石蜡油还可以用其他矿物油代替。
53.图3所示为深度过冷保存流程，手术获取肾脏，摘取前进行在体灌注，灌注液为去掉羟乙基淀粉的uw溶液，约25ml即可，通过深度过冷保存后，进行梯度温度灌注复温，复温灌注液为dmem培养基，首先对肾脏进行10分钟的4℃培养基灌注，然后常温26℃灌注15分钟，最后37℃(水浴锅加热)灌注30分钟，接下该肾脏便可以进行移植手术等后续使用了。
54.图4为保存后的肾脏he染色、masson染色。设置了4℃低温、-4℃过冷、-10℃深度过冷三组对照，三种工况第四天的结果差异不大，随温度的降低保存结果的形貌结构越优，第七天的结果便具有了明显性差异。与新鲜组对照，-10℃保存4天和7天后肾脏结构最为完整，肾皮质和肾髓质结构层清晰；而4℃状况最差，-4℃次之，两种工况第七天的结果层级结构模糊，肾锥体弥散在肾皮质肾髓质中，基本无法辨别。结冰后的样本发生了严重的损伤，具有严重的间质水肿。对肾小体的微观结构进行了定量化分析，4℃平均肾小体面积最大，发生肿胀，具有显著性差异；4℃的样本肾小囊肾小球间隙增大，部分肾小体近乎囊球分离，黑色五角星所示区域。-10℃与新鲜组对比，没有显著性差异。马松染色结果统计胶原容积比可以看出，4℃纤维化程度最严重，具有较强的炎症反应，-10℃的纤维化程度最低。肾脏纤维化是由肾脏损伤所引起的反应，其过程中炎症可能是其中的一部分。
55.图5为肾脏的湿干重比。对照组为新鲜的肾脏，本发明中所使用的sd大鼠的重量在180-230g之间。三种工况下保存7天的湿干重比都要比保存4天的大，说明保存时间越长，水肿程度越大，肾脏损伤越严重。根据保存7天的湿干重比，4℃的样本和新鲜的对比具有显著性差异，-10℃的样本没有显著性差异，说明了肾脏在零下10摄氏度保存7天水肿程度轻微，从而验证了肾脏深度过冷的有效性。可见延长肾脏保存的时间、提高肾脏保存的质量。
56.本发明通过对保存溶液进行了优化，如表1，排除掉结冰率高的工况，对剩余工况进行筛选，如图6所示为优化保存液后的肾脏形貌结构(he染色)。
57.表1添加cpa对深度过冷成功率的影响
[0058][0059][0060]
宏观来看，三个方向的切片没有显著性差异，肾皮质形成连续的光滑的外层区域，其间有一些突起的肾柱，延伸至肾锥体，结构完整，组织基本没有发生破裂。将倍数放大，可以看到肾小球充盈，肾小管和间质结构清晰，上皮细胞排列整齐，三种优化条件均未出现4℃、-4℃中肾小球缩小变圆，肾小管上皮细胞脱落或坏死的情况。在peg+pva(31kd)工况的结果中，伴有轻微的间质水肿和炎症细胞浸润，肾小管管腔有扩张状态。使用了图像处理软
件对切片扫描结果进行了可视化处理(黄绿色为肾实质，蓝色为组织间隙)，并对其进行了定量统计。
[0061]
图7为肾损伤定量分析。atn(acute tubular necrosis)是肾脏急性损伤的一种类型，包括肾小管的细胞坏死和功能障碍。肾实质比用来反映肾脏水肿程度和受到损伤的程度，肾实质比越低代表损伤越严重。atn和肾实质比中，peg+pva(31kd)与新鲜样本对比具有显著性差异，peg+pva(9kd)结果比较优异。peg+pva(9kd)的alt、ast含量最接近新鲜样本的含量，也低于对照组和纯pva(9kd)的含量，也说明了该工况保存效果最为优异。
[0062]
图8为优化前后损伤因子、功能因子、炎症因子的检测。kim-1为大鼠肾损伤标志物，可以看到优化方法后保存4天和7天的肾脏损伤与新鲜的样本的p值都大于0.05，不具备显著性差异，该保存结果可以接受。bun和cre是肾功能标志物，分析得出，优化方法保存4天的结果与新鲜对比不具有显著性差异，保存结果可以接受。hif-1α和hmgb-1能表征炎症水平，结果与上述讨论具有一致性，保存4天要比保存7天的炎症水平更接近新鲜的含量，可以得出，4天是最优保存时长。
[0063]
综上，本发明提出的对于移植前的肾脏深度过冷保存流程：预处理灌注-深度过冷保存-灌注复温，最优保存液为添加0.1mol/l sib、5％ peg和4％pva(9kd)的uw溶液，最优保存时长为4天，可能保存时长为7天及以上，保存温度为-10℃。
[0064]
本发明以大鼠肾脏为例进行说明，其他人体或动物体的器官均可以采用本发明的方法进行保存。器官离开供体后，血液循环的停止会对其造成缺血、缺氧以及代谢物累积等一系列损伤。因此，开发一种能够最大限度减少器官损伤、延长保存时间的方法尤为重要。本发明针对于这一临床问题，本发明提出了一种新的肾脏保存方法-深度过冷保存，可以使得肾脏的保存时间延长至7天。
[0065]
实验结果表明，深度过冷技术保存大鼠肾脏样本的效果良好，能够在很大程度上减少样本损伤，延长保存时间。与静态低温保存、一般过冷保存等方法相比，深度过冷技术在维持样本基本组织形态结构(如图4、图5、图6所示)、抑制纤维化和炎症反应(如图4、8所示)、降低功能损伤(如图8所示)等方面表现出明显的优越性。除此之外，该方法还具有成本低廉、操作简便、效果优良等优点。该方法可以一定程度解决肾脏移植供体短缺、保存时间太短造成浪费的实际科学问题，为器官保存提供新的思路。
[0066]
该方法还具有成本低廉、操作简便、效果优良等优点。该方法可以一定程度解决肾脏移植供体短缺、保存时间太短造成浪费的实际科学问题，为器官保存提供新的思路。
[0067]
以上披露的所有文章和参考资料，包括专利申请和出版物，出于各种目的通过援引结合于此。描述组合的术语“基本由
…
构成”应该包括所确定的元件、成分、部件或步骤以及实质上没有影响该组合的基本新颖特征的其他元件、成分、部件或步骤。使用术语“包含”或“包括”来描述这里的元件、成分、部件或步骤的组合也想到了基本由这些元件、成分、部件或步骤构成的实施方式。这里通过使用术语“可以”，旨在说明“可以”包括的所描述的任何属性都是可选的。
[0068]
多个元件、成分、部件或步骤能够由单个集成元件、成分、部件或步骤来提供。另选地，单个集成元件、成分、部件或步骤可以被分成分离的多个元件、成分、部件或步骤。用来描述元件、成分、部件或步骤的公开“一”或“一个”并不说为了排除其他的元件、成分、部件或步骤。
[0069]
应该理解，以上描述是为了进行图示说明而不是为了进行限制。通过阅读上述描述，在所提供的示例之外的许多实施例和许多应用对本领域技术人员来说都将是显而易见的。因此，本教导的范围不应该参照上述描述来确定，而是应该参照前述权利要求以及这些权利要求所拥有的等价物的全部范围来确定。出于全面之目的，所有文章和参考包括专利申请和公告的公开都通过参考结合在本文中。在前述权利要求中省略这里公开的主题的任何方面并不是为了放弃该主体内容，也不应该认为申请人没有将该主题考虑为所公开的发明主题的一部分。

技术特征：
1.一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，包括：将离体器官放入盛有保存液的容器中，使离体器官浸没在保存液底部；加入密封油使得密封油置于保存液上层表面，静置设定时间；静置后吸取密封油和保存液交界面的气泡，再将容器转入设置好温度的保温设备中进行深度过冷保存；所述温度≤-4℃。2.根据权利要求1所述的一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，所述保存液为uw液。3.根据权利要求2所述的一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，所述保存液中还添加有0.1mol/l的sib。4.根据权利要求1所述的一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，所述保存液为添加0.1mol/l sib、5％peg和4％pva(9kd)的uw溶液。5.根据权利要求1所述的一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，所述密封油加入量满足密封油完全覆盖于保存液上层表面，且交界面没有气泡的残留。6.根据权利要求1所述的一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，所述密封油为矿物油、植物油或动物油。7.根据权利要求1所述的一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，所述温度为≤-4℃，深度过冷保存时间为≥7天。8.根据权利要求1所述的一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，所述温度为-10℃，深度过冷保存时间为4天。9.根据权利要求1所述的一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，所述将离体器官放入盛有保存液的容器中之前还包括：对离体器官进行在体灌注，灌注液为去掉羟乙基淀粉的uw溶液。10.根据权利要求1所述的一种器官深度过冷保存方法，其特征在于，进行深度过冷保存后，还包括梯度温度灌注复温步骤，所述梯度温度灌注复温步骤包括：复温灌注液为dmem培养基，先对肾脏进行t1时间的4℃培养基灌注，然后t2时间的26℃灌注，最后t3时间的37℃灌注。

技术总结
本发明公开了一种器官深度过冷保存方法，属于生物医学工程领域技术领域，方法包括：将离体器官放入盛有保存液的容器中，使离体器官浸没在保存液底部；加入密封油使得密封油置于保存液上层表面，静置设定时间；静置后吸取密封油和保存液交界面的气泡，再将容器转入设置好温度的保温设备中进行深度过冷保存；所述温度-10℃。本发明方法可实现更低的过冷温度，进一步降低生物样品的代谢速率，增加保存时间，延长器官保存的时间、提高器官保存的质量。提高器官保存的质量。提高器官保存的质量。


技术研发人员：黄海水 李志杰 李云开
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/7/28