一种利用高糖高抑制剂生物质水解液开放式发酵产油脂的方法

1.本发明涉及一种利用高糖高抑制剂生物质水解液产油脂的方法及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.能源是人类社会不断向前发展的动力之一。化石能源虽然储量丰富，但具有地域分布不均、开发难度大、环境不友好等一系列缺点。随着世界对能源的需求不断增加，亟需开发出新型能源以替代化石能源，来应对能源危机。
3.微生物油脂是指产油微生物在一定条件下生产的油脂，其主要成分为甘油三酯。甘油三脂中脂肪酸的组成与植物油、动物油相类似，通常为c1。-c1。的长链脂肪酸，以棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸为主。通过一步转酯化反应，便可将微生物油脂转化为脂肪酸甲酯，即生物柴油。此外，通过合成生物学手段，可以调控细胞合成特定长度和结构的脂肪酸，从而获得更高附加价值的产品。一些产油酵母例如rhodotorula toruloides、yarrowia lipolytica、cryptococcus curvatus等，能够积累占细胞干重约70％的油脂，并且具有生产周期短，不受季节限制，不占用耕地面积，原料来源广泛等优点。由于微生物油脂的成分与动植物油脂高度相似，可用于生产生物柴油，对生物柴油长远发展意义重大。
4.目前微生物油脂的生产成本依然较高，原料的成本高是主要因素之一。我国木质纤维素资源丰富，据统计农村秸秆年产量达到约8亿吨，但能源化利用率并不高。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三部分组成，其中纤维素和半纤维素水解可得到葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖等单糖，而木质素在处理过程中部分降解为水溶性酚类化合物。较高浓度的生物质水解液有利于获得高油脂产量，但其中含有大量的水解副产物，通常根据副产物的结构将其分为三类：弱酸类，包括甲酸、乙酸、阿魏酸、乙酰丙酸等；呋喃类，包括糠醛、糠醇、羟甲基糠醛等；酚类，包括对羟基苯甲醛/酸/醇、香草醛/酸/醇、丁香醛/酸/醇等。这些副产物会抑制菌株生长及油脂合成，例如糠醛和羟甲基糠醛会直接抑制乙醇脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和醛脱氢酶的活性，弱酸的存在使得胞内ph值降低，细胞复制活力呈下降趋势等。此外，高浓度的生物质水解液中糖浓度也相应增多，其会带来培养基渗透压的变化，影响细胞的活力。许多产油酵母被发现具有生物基抑制剂耐受性。然而，在抑制剂浓度较高时，产油酵母脱毒效率及生长效率不高。因此，从发酵菌株入手，通过实验室进化的手段，提高菌株对水解液副产物的抗逆性，能够提高利用水解液生产微生物油脂的生产效率。
5.发酵过程通常采用封闭体系，需要对发酵罐进行高温灭菌以及在发酵过程中通入无菌空气，以确保发酵过程不受杂菌影响。高温灭菌过程有着高能耗、高操作成本、费时等特点，无菌空气的制备也需要一定的成本。以甲醇作为底物、年产量为10万吨的单细胞蛋白质的工厂为例，高温灭菌中的能源、水以及无菌空气和其他辅助费用占生产成本的10％左右。高浓度的生物质水解液本身就含有大量的抑制剂，其他微生物难以生长，而产油酵母具
有耐受性，可以进行油脂生产。因此建立开放式的发酵体系完全可以满足微生物油脂的生产需要，同时可以简化操作过程，降低生产成本，减少能耗，提高生产微生物油脂的经济性。
6.微生物的实验室进化是选育优良性状的一种手段，实验室进化是指在特定的选择压力下连续培养以富集有益突变，进而改变微生物性状的过程。微生物实验室进化利用微生物生长周期短，生长速度快，可以在短时间内就可以富集到多种突变。此外，同样相较于微生物中常用的工程改造技术手段，实验室操作简单、表型获得容易，不需要进行复杂的基因工程构建。利用实验室进化的方法，能够快速选育获得耐受高浓度生物质水解液产油脂的菌株，与环境中的微生物相比，耐受菌株能够在高浓度生物质水解液中生长并成为优势菌株。因此建立开放发酵体系，省去油脂生产过程中灭菌的步骤，降低能耗及生产成本，有利于我国的生物柴油产业发展，为生物质的资源化利用和农业可持续发展提供一定基础。


技术实现要素：

7.根据本技术的一个方面，提供了一种利用高糖高抑制剂生物质水解液产油脂的方法，该方法提供了一种以木质纤维素生物质为原料，进行微生物油脂制备的新方法。与传统微生物油脂制备方法相比，该方法建立了开放发酵体系，可以直接用来发酵，不需要进行高温灭菌过程，可以简化工艺步骤，减少能源消耗。同时该方法能够提高生物质的利用效率，降低生物柴油或其他高附加值产品生产的成本。该方法能够适用于不同类型的生物质材料以及不同类型的预处理方式，具有普适性。
8.所述利用高糖高抑制剂生物质水解液产油脂的方法，其特征在于，包括：对产油酵母实验室定向进化、对生物质原料进行高固载量预处理和高固载量酶水解以及建立开放式的发酵体系生产微生物油脂和生物柴油。
9.可选地，所述实验室定向进化以生物质水解液为进化条件，选用三种及以上不同浓度生物质水解液进行实验室进化，获得耐受高糖高抑制剂生物质水解液的菌株。
10.可选地，所述生物质预处理和酶水解固载量下限为15％(w/v，固液比)。可选地，所述生物质预处理和酶水解固载量上限为30％(w/v)。
11.可选地，所述生物质水解液的总还原糖浓度下限为70g/l。可选地，所述生物质水解液的总还原糖浓度上限为150g/l。
12.可选地，所述原料选自玉米秸秆、小麦秸秆、稻草中的至少一种。
13.可选地，所述生物质预处理方法选自球磨、挤压、酸预处理、碱预处理、干法预处理、蒸汽预处理中的至少一种。
14.可选地，所述酶水解包括向所述原料中添加酶；所述酶选自纤维素酶、木聚糖酶中的至少一种。
15.可选地，所述油脂发酵工艺包括制备发酵种子液和发酵产油培养。
16.可选地，所述种子培养基包括葡萄糖20g/l，酵母粉10g/l，蛋白胨10g/l；培养方法包括：将所述种子培养基灭菌后接种所述微生物，在25-32℃下，150-250rpm，摇床培养20-24h。
17.可选地，所述发酵产油培养包括：将所述发酵种子液接种于高浓度生物质水解液中，发酵体系为开放体系，水解液未经过高温灭菌处理，发酵过程未使用无菌空气；其中，所述发酵种子液与所述水解液的体积比1：15-1∶5；所述发酵产油培养的温度为28-32℃，ph为
4-6；所述水解液中溶解氧＞20％。
18.可选地，所述微生物菌株选自斯达油脂酵母lipomyces starkeyi、圆红冬孢酵母rhodotorula toruloides、粘红酵母rhodotorula glutinis、掷孢酵母sporobolomyces roseus、皮状丝孢酵母trichosporon cutaneum、发酵性丝孢酵母trichosporon fermentans、白色隐球酵母cryptococcus albidus、弯曲隐球酵母cryptococcus curvatus中的至少一种。
19.作为一个具体的实施方式，本发明通过下述技术方案实现：
20.(1)菌株的实验室进化：将菌株在种子培养基中活化好后，选用不同浓度的生物质水解液进行实验室进化。先将菌株接种于低浓度生物质水解液中，待菌株能够适应水解液组分并生长到一定od时，取部分菌液转接至更高浓度的生物质水解液中，重复此步骤，逐步提高菌株在水解液中的耐受性。
21.(2)高浓度生物质原料的预处理：选择一种木质纤维素生物质材料，进行物理或化学预处理，物理预处理方法包括球磨等，化学预处理方法包括酸预处理、碱预处理、干法预处理、高温预处理等。
22.(3)高浓度生物质原料的酶水解：预处理完成后，按照高固载量水平添加生物质材料，进行酶水解，酶水解完成后，固液分离收集得到高浓度的生物质水解液。
23.(4)油脂发酵种子液的制备：称取种子培养基(葡萄糖20g/l，酵母粉10g/l，蛋白胨10g/l)，灭菌冷却后，接种产油微生物，30℃，200rpm摇床培养24h。
24.(5)发酵产油培养：油脂积累培养基为高糖高抑制剂生物质水解液，发酵体系为开放体系，未经过高温灭菌处理，发酵过程未使用无菌空气。接种量10％(v/v)，油脂发酵种子液种龄24h。发酵温度30℃，ph 5.5，溶解氧＞20％(通过调节搅拌转速和通气量控制)。待发酵液中还原糖不再降低时停止发酵。
25.本技术能产生的有益效果包括：
26.(1)本技术提供的方法通过对产油酵母进行实验室定向进化，获得能够耐受高浓度水解液的产油酵母，该产油酵母能够在高浓度生物质水解液中进行油脂生产，将廉价生物质转化为微生物油脂、生物柴油或其他高附加值产品。
27.(2)本技术提供的方法以木质纤维素类生物质为原料，经过原料预处理、酶水解和微生物油脂发酵三大工艺步骤，获得高糖高抑制剂的生物质水解液，利用该水解液实现微生物油脂的制备。该油脂含有一种或多种中长链脂肪酸及其衍生物，可用于制备生物柴油、功能性油脂或其他高附加值产品。
28.(3)本技术中提供的方法适用于不同预处理法获得的生物质水解液，具有普适性。针对不同生物质以及不同的预处理方法获得的不同种类的水解液，该方法都能够获得有效的生产菌株，实现微生物油脂以及生物柴油的生产。
29.(4)本技术中提供的方法建立了开放发酵工艺，无需高温灭菌、无需在发酵过程中使用无菌空气即可进行油脂发酵，发酵前不需要处理水解液中的抑制物，发酵过程中也不需要额外添加其他营养物质，具有工艺流程简短、原料利用效率高、油脂得率高、成本低、能耗低的技术优势，可改善微生物油脂的技术经济性，具有一定的经济效益和环保效益。
附图说明
30.图1为根据本技术实施例1的菌株的实验室进化过程中菌株od的变化情况。
具体实施方式
31.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
32.为了说明本发明所述的技术方案，下面通过具体实施例来进行说明。
33.实施例1
34.(1)高糖高抑制剂水解液的制备：玉米秸秆经球磨机球磨12h后，至于室温下储存备用。20％固载量(w/v)秸秆水解液制备方法为：取球磨秸秆100g于2l广口锥形瓶中，加入500ml 12g/l的naoh溶液，记录锥形瓶总重后于121℃蒸汽预处理1h。预处理结束后，冷却至室温，用4m hcl调节ph至4.8，加入10ml纤维素酶，0.5g木聚糖酶，500μl50g/l的氨苄西林钠溶液，补水至预处理前重量。于50℃，200rpm条件下酶水解48h，并在水解的第1、3h再次微调ph至4.8。水解结束后，将所有样品转移至离心瓶中，8000rpm离心10min，收集上清，对收集到的上清进行二次离心，再次收集上清，调节水解液ph至5.5，获得秸秆水解液。水解液直接用于发酵产油脂，不进行高温灭菌。
35.(2)菌株的实验室进化：从-80℃冻存管中挑取少量圆红冬孢酵母r.toruloides转接至10ml yepd培养基中培养，培养基置于50ml无菌离心管中，培养条件为30℃，200rpm。培养48h后，进行菌株的实验室进化，取10ml 7％(w/v)水解液，按1∶10(v∶v)的接种量接种上述活化好的菌液，做3个平行，记为第一代，待od
600
值达到20左右后，取生长最佳的1管转接至另一固载量的水解液中，同样做3个平行，按照此方法逐步提高水解液固载量。本实验共传代9代，每一代的水解液固载量分别为7％、12％、12％、15％、15％、16％、18％、18％、20％(w/v)，见图1。将获得的能够在20％(w/v)条件下生长的菌株进行涂布分离，获得单菌落。
36.(3)微生物油脂的生产：挑取实验室进化后的圆红冬孢酵母r.toruloides接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂及高附加值产品类胡萝卜素。
37.对比例1
38.(1)高糖高抑制剂水解液的制备：玉米秸秆经球磨机球磨12h后，至于室温下储存备用。20％固载量(w/w)秸秆水解液制备方法为：取球磨秸秆100g于2l广口锥形瓶中，加入500ml 12g/l的naoh溶液，记录锥形瓶总重后于121℃蒸汽预处理1h。预处理结束后，冷却至室温，用4m hcl调节ph至4.8，加入10ml纤维素酶，0.5g木聚糖酶，500μl 50g/l的氨苄西林钠溶液，补水至预处理前重量。于50℃，200rpm条件下酶水解48h，并在水解的第1、3h再次微调ph至4.8。水解结束后，将所有样品转移至离心瓶中，8000rpm离心10min，收集上清，对收集到的上清进行二次离心，再次收集上清，调节水解液ph至5.5，获得秸秆水解液。水解液于121℃高温灭菌20min，冷却后备用。
39.(2)菌株的实验室进化：从-80℃冻存管中挑取圆红冬孢酵母r.toruloides，转接
至10ml yepd培养基中培养，培养基置于50ml无菌离心管中，培养条件为30℃，200rpm。培养48h后，进行菌株的实验室进化，取10ml 20％(w/v)水解液，按1∶10(v∶v)的接种量接种上述活化好的菌液，做3个平行，记为第一代，待od
600
值达到20左右后，取生长最佳的1管转接至另一固载量的水解液中，同样做3个平行，按照此方法逐步提高水解液固载量。本实验共传代9代，每一代的水解液固载量分别为7％、12％、12％、15％、15％、16％、18％、18％、20％(w/v)。将获得的能够在20％(w/v)条件下生长的菌株进行涂布分离，获得单菌落。
40.(3)微生物油脂的生产：挑取实验室进化的圆红冬孢酵母r.toruloides接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂及高附加值产品类胡萝卜素。
41.对比例2
42.(1)高糖高抑制剂水解液的制备：玉米秸秆经球磨机球磨12h后，至于室温下储存备用。20％固载量(w/v)秸秆水解液制备方法为：取球磨秸秆100g于2l广口锥形瓶中，加入500ml 12g/l的naoh溶液，记录锥形瓶总重后于121℃蒸汽预处理1h。预处理结束后，冷却至室温，用4m hcl调节ph至4.8，加入10ml纤维素酶，0.5g木聚糖酶，500μl50g/l的氨苄西林钠溶液，补水至预处理前重量。于50℃，200rpm条件下酶水解48h，并在水解的第1、3h再次微调ph至4.8。水解结束后，将所有样品转移至离心瓶中，8000rpm离心10min，收集上清，对收集到的上清进行二次离心，再次收集上清，调节水解液ph至5.5，获得秸秆水解液。水解液直接用于发酵产油脂，不进行高温灭菌。
43.(2)微生物油脂的生产：挑取野生型的圆红冬孢酵母r.toruloides接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于5g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂及高附加值产品类胡萝卜素。
44.实施例2
45.(1)高糖高抑制剂水解液的制备：将小麦秸秆用去离子水洗涤干净后，烘干粉碎后备用。配制5％的naoh-甲醇溶液，待naoh完全溶解后，按50％(w/v)向反应器中加入秸秆原料，并通过搅拌充分混合均匀。随后将体系密封后于80℃反应60min。反应结束后洗涤三次，并过滤烘干。25％固载量(w/v)秸秆水解液制备方法为：向2l锥形瓶中加入125g预处理秸秆，加入适量水并调节ph至4.8。再按15fpu/g秸秆的载酶量加入诺维信纤维素酶以及50mg/l氨苄青霉素，然后将酶解体系体积用去离子水补至500ml，充分混匀后于50℃水浴摇床中酶解72h，离心收集上清冻存备用。水解液直接用于发酵产油脂，不进行高温灭菌。
46.(2)菌株的实验室进化：从-80℃冻存管中挑取少量圆红冬孢酵母r.toruloides，转接至10ml yepd培养基中培养，培养基置于50ml无菌离心管中，培养条件为30℃，200rpm。培养48h后，进行菌株的实验室进化，取10ml 15％(w/v)水解液，按1∶10(v∶v)的接种量接种上述活化好的菌液，做3个平行，记为第一代，待od
600
值达到20左右后，取生长最佳的1管转接至另一固载量的水解液中，同样做3个平行，按照此方法逐步提高水解液固载量。本实验共传代6代，每一代的水解液固载量分别为15％、17％、20％、22％、24％、25％(w/v)，将获得
的能够在25％(w/v)条件下生长的菌株进行涂布分离，获得单菌落。
47.(3)微生物油脂的生产：挑取实验室进化的菌接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于10g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂。
48.实施例3
49.(1)高糖高抑制剂水解液的制备：将粉碎的天然干燥玉米秸秆40目筛后，在1l的三角瓶中称取50g秸秆，用600ml去离子水溶解，使得秸秆的固含量为7.5％，加入1ml浓硫酸，混匀，封口。放入灭菌锅中，于121℃处理90min。结束后，对样品抽滤，实现固液分离，得到的固体即为稀酸预处理后的物料。30％固载量(w/v)秸秆水解液制备方法为：向2l锥形瓶中加入150g预处理秸秆，加入适量水并调节ph至4.8。再按15fpu/g秸秆的载酶量加入诺维信纤维素酶以及50mg/l氨苄青霉素，最后将酶解体系体积用去离子水补至500ml，充分混匀后于50℃水浴摇床中酶解24h，离心收集上清冻存备用。水解液直接用于发酵产油脂，不进行高温灭菌。
50.(2)菌株的实验室进化：从-80℃冻存管中挑取少量弯曲隐球酵母ccurvatus，转接至10ml yepd培养基中培养，培养基置于50ml无菌离心管中，培养条件为30℃，200rpm。培养48h后，进行菌株的实验室进化，取10ml 10％(w/v)的水解液，按1∶10(v∶v)的接种量接种上述活化好的菌液，做3个平行，记为第一代，待od
600
值达到20左右后，取生长最佳的1管转接至另一固载量的水解液中，同样做3个平行，按照此方法逐步提高水解液固载量。本实验共传代7代，每一代的水解液固载量分别为10％、15％、18％、22％、25％、28％、30％(w/v)，将获得的能够在30％(w/v)条件下生长的菌株进行涂布分离，获得单菌落。
51.(3)微生物油脂的生产：挑取实验室进化的菌接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于10g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂。
52.实施例4
53.(1)高糖高抑制剂水解液的制备：将风干后的小麦秸秆粉碎并过40目筛。取100g粉碎后的秸秆和200g离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([emim]ac)置于1l耐压瓶中，于130℃烘箱中放置1.5h，取出，冷却至室温后，向体系中缓慢加入200ml去离子水，离心、沉淀洗涤至上清液无色。取预处理后的样品，加入25fpu/g的纤维素酶和ph值为4.8的0.05mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，定容至400ml。50℃、100r/min条件下进行酶水解反应，即为25％(w/v)小麦秸秆水解液。水解液直接用于发酵产油脂，不进行高温灭菌。
[0054]
(2)菌株的实验室进化：从-80℃冻存管中挑取少量皮状丝孢酵母t.cutaneum，转接至10ml yepd培养基中培养，培养基置于50ml无菌离心管中，培养条件为30℃，200rpm。培养48h后，进行菌株的实验室进化，取10ml 10％(w/v)水解液，按1∶10(v∶v)的接种量接种上述活化好的菌液，做3个平行，记为第一代，待od
600
值达到20左右后，取生长最佳的1管转接至另一固载量的水解液中，同样做3个平行，按照此方法逐步提高水解液固载量。本实验共传代8代，每一代的水解液固载量分别为10％、12％、15％、17％、18％、20％、22％、25％(w/v)，将获得的能够在25％(w/v)条件下生长的菌株进行涂布分离，获得单菌落。
[0055]
(3)微生物油脂的生产：挑取实验室进化的菌接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于10g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂。
[0056]
实施例5
[0057]
(1)高糖高抑制剂水解液的制备：将稻草切碎后烘干，然后用机械粉碎机粉碎，筛至100μm。配制质量分数为1％的h2so4溶液，固液比为1：20，室温浸泡24h，处理后的玉米秸秆用水冲洗至ph为6.8，然后于60℃烘干至恒重。取150g预处理后秸秆，加入10fpu/g的纤维素酶和ph值为4.8的0.05mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，定容至500ml。50℃、200r/min条件下进行酶水解反应，待糖浓度不再变化时，结束酶水解，即为30％(w/v)稻草秸秆水解液。水解液直接用于发酵产油脂，不进行高温灭菌。
[0058]
(2)菌株的实验室进化：从-80℃冻存管中挑取少量皮状丝孢酵母t.cutaneum，转接至10mlyepd培养基中培养，培养基置于50ml无菌离心管中，培养条件为30℃，200rpm。培养48h后，进行菌株的实验室进化，取10ml 10％(w/v)水解液，按1∶10(v∶v)的接种量接种上述活化好的菌液，做3个平行，记为第一代，待od
600
值达到20左右后，取生长最佳的1管转接至另一固载量的水解液中，同样做3个平行，按照此方法逐步提高水解液固载量。本实验共传代11代，每一代的水解液固载量分别为10％、12％、15％、17％、18％、20％、22％、25％、27％、27％、30％(w/v)，将获得的能够在30％(w/v)条件下生长的菌株进行涂布分离，获得单菌落。
[0059]
(3)微生物油脂的生产：挑取实验室进化的菌接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于10g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂。
[0060]
实施例6
[0061]
(1)高糖高抑制剂水解液的制备：将稻草切碎后烘干，然后用机械粉碎机粉碎，筛至100μm。配制质量分数为1％的naoh溶液，固液比为1：20，室温浸泡24h，处理后的玉米秸秆用水冲洗至ph为6.8，然后于60℃烘干至恒重。取150g预处理后秸秆，加入10fpu/g的纤维素酶和ph值为4.8的0.05mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，定容至500ml。50℃、200r/min条件下进行酶水解反应，待糖浓度不再变化时，结束酶水解，即为30％(w/v)稻草秸秆水解液。水解液直接用于发酵产油脂，不进行高温灭菌。
[0062]
(2)菌株的实验室进化：从-80℃冻存管中挑取少量皮状丝孢酵母t.cutaneum，转接至10ml yepd培养基中培养，培养基置于50ml无菌离心管中，培养条件为30℃，200rpm。培养48h后，进行菌株的实验室进化，取10ml 10％(w/v)水解液，按1∶10(v∶v)的接种量接种上述活化好的菌液，做3个平行，记为第一代，待od
600
值达到20左右后，取生长最佳的1管转接至另一固载量的水解液中，同样做3个平行，按照此方法逐步提高水解液固载量。本实验共传代9代，每一代的水解液固载量分别为10％、14％、17％、18％、20％、22％、25％、27％、30％(w/v)，将获得的能够在30％(w/v)条件下生长的菌株进行涂布分离，获得单菌落。
[0063]
(3)微生物油脂的生产：挑取实验室进化的菌接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤
(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于10g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂。
[0064]
实施例7
[0065]
(1)高糖高抑制剂水解液的制备：将玉米秸秆切碎后烘干，然后用机械粉碎机粉碎，筛至40目。采用蒸汽预处理：取150g秸秆，加入500ml水，于121℃预处理60min，取出冷却至室温，加入10fpu/g的纤维素酶定容至500ml，于50℃、200r/min条件下进行酶水解反应48h，每隔12h调节水解液ph至4.8，水解结束后离心收集上清，即为30％(w/v)稻草秸秆水解液。水解液直接用于发酵产油脂，不进行高温灭菌。
[0066]
(2)菌株的实验室进化：从-80℃冻存管中挑取少量斯达油脂酵母l.starkeyi，转接至20ml yepd培养基中培养，培养基置于50ml摇瓶中，培养条件为30℃，200rpm。培养48h后，进行菌株的实验室进化，取20ml10％(w/v)水解液，按1∶10(v∶v)的接种量接种上述活化好的菌液，做3个平行，记为第一代，待od
600
值达到20左右后，取生长最佳的1管转接至另一固载量的水解液中，同样做3个平行，按照此方法逐步提高水解液固载量。本实验共传代9代，每一代的水解液固载量分别为10％、14％、17％、18％、20％、22％、25％、27％、30％(w/v)，将获得的能够在30％(w/v)条件下生长的菌株进行涂布分离，并连续传代，验证其稳定性后，获得能够耐受高糖高抑制剂水解液的单菌落。
[0067]
(3)微生物油脂的生产：挑取实验室进化的菌接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到发酵液中还原糖含量低于10g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂。
[0068]
实施例8
[0069]
(1)高糖高抑制剂水解液的制备：玉米秸秆经球磨机球磨12h后，至于室温下储存备用。30％(w/v)秸秆水解液制备方法为：取球磨秸秆30g于250ml广口锥形瓶中，加入100ml 6％(w∶w)的naoh溶液，记录锥形瓶总重后于121℃蒸汽预处理1h。预处理结束后，冷却至室温，用压滤机压滤出部分液体，脱去部分毒副产物。用4m hcl调节ph至4.8，加入10ml纤维素酶，0.5g木聚糖酶，500μl 50g/l的氨苄西林钠溶液，补水至预处理前重量。于50℃，200rpm条件下酶水解24h，并在水解的第1、3h再次微调ph至4.8。水解结束后，将所有样品转移至离心瓶中，8000rpm离心10min，收集上清，对收集到的上清进行超滤，获得不含固体杂质的水解液。水解液直接用于发酵产油脂，不进行高温灭菌。
[0070]
(2)菌株的实验室进化：从-80℃冻存管中挑取少粘红酵母r.glutinis菌落，转接至10ml yepd培养基中培养，培养基置于50ml无菌离心管中，培养条件为30℃，200rpm。培养48h后，进行菌株的实验室进化，取10ml 20％(w/v)水解液，按1∶10(v∶v)的接种量接种上述活化好的菌液，做3个平行，记为第一代，待od
600
值达到20左右后，取生长最佳的1管转接至另一固载量的水解液中，同样做3个平行，按照此方法逐步提高水解液固载量。本实验共传代7代，每一代的水解液固载量分别为15％、17％、20％、22％、25％、28％、30％(w/v)。将获得的能够在30％(w/v)条件下生长的菌株进行涂布分离，获得单菌落。
[0071]
(3)微生物油脂的生产：挑取实验室进化的粘红酵母r.glutinis接种于种子培养基(20g/l葡萄糖、10g/l酵母粉、10g/l蛋白胨)中，在30℃下振荡培养24h，获得种子液。将种子液接种于步骤(1)中的水解液培养基中，接种量10％(v/v)，在30℃下通气振荡培养，待到
发酵液中还原糖含量低于5g/l时结束发酵，固液分离，收集菌体提取微生物油脂及高附加值产品类胡萝卜素。
[0072]
综上，本发明提供了一种以高糖高抑制剂生物质水解液为原料，进行微生物油脂制备的方法。与传统微生物油脂制备方法相比，该方法普适性强，能够适用于不同生物质以及不同预处理方法，同时建立开放发酵体系，无需高温灭菌以及使用无菌空气，简化了工艺步骤，减少了能耗，提高了生物质的利用效率，降低生物柴油或其他高附加值产品生产的成本。
[0073]
以上所述，仅是本技术的几个实施例，并非对本技术做任何形式的限制，虽然本技术以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本技术，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本技术技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

技术特征：
1.一种利用高糖高抑制剂生物质水解液开放式发酵产油脂的方法，其特征在于，对产油酵母进行实验室定向进化提升菌株对生物质基抑制剂的耐受性，使得菌株能够在含高浓度抑制剂的生物质水解液中进行生长和发酵产微生物油脂；生物质原料通过高固载量预处理和高固载量酶水解，提高生物质的利用效率；此外，建立非灭菌发酵产油体系，产油酵母可以在无需灭菌的条件下直接利用含高糖高抑制剂的生物质水解液，简化发酵工艺，减少发酵成本，提高生物质生产微生物油脂和生物柴油的经济性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实验室进化以生物质水解液为进化条件，提升菌株对生物质基抑制剂的耐受性。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理和酶水解固载量均为15％-30％(w/v，固液比)。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水解液的总还原糖浓度为70g/l-150g/l。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物质选自玉米秸秆、小麦秸秆、稻草中的至少一种。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物质预处理方法选自球磨、酸预处理、碱预处理、干法预处理、蒸汽预处理中的至少一种。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶水解包括向所述原料中添加酶；所述酶选自纤维素酶、半纤维素酶中的至少一种。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油脂发酵工艺包括制备发酵种子液和发酵产油培养。其中发酵产油培养体系为开放体系，无需对水解液进行高温灭菌。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为具有一定抑制剂耐受性的产油酵母及其进化菌株，具体包括斯达油脂酵母lipomyces starkeyi、圆红冬孢酵母rhodotorula toruloides、粘红酵母rhodotorula glutinis、掷孢酵母sporobolomyces roseus、皮状丝孢酵母trichosporon cutaneum、发酵性丝孢酵母trichosporon fermentans、白色隐球酵母cryptococcus albidus、弯曲隐球酵母cryptococcus curvatus中的至少一种。10.根据权利要求1-9所述的方法，其特征在于，所制备的微生物油脂可以作为生物柴油、功能性油脂应用。

技术总结
本发明提供了一种利用高糖高抑制剂生物质水解液开放式发酵产油脂的方法，具体包括：对产油酵母进行实验室定向进化提升菌株对生物质基抑制剂的耐受性；生物质原料进行高固载量预处理和直接酶水解制备高糖高抑制剂水解液；产油酵母通过非灭菌发酵直接利用水解液生产微生物油脂。该方法采用实验室进化的方法，显著强化了产油酵母对生物质水解液抑制剂的耐受性，产油酵母可以在非灭菌条件下直接利用高糖高抑制剂生物质水解液发酵产油脂。基于菌株具有较强的水解液耐受性，水解液无需灭菌，降低微生物油脂制备的能耗、过程成本和设备成本。此外，该方法能够利用廉价生物质生产生物柴油，具有显著的经济效益和环保效益。具有显著的经济效益和环保效益。具有显著的经济效益和环保效益。


技术研发人员：龚志伟 张珺璐 周文婷
受保护的技术使用者：武汉科技大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/7/28