藤仓赤霉菌、含有该菌的菌剂及它们的应用以及生产赤霉素的方法

1.本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种藤仓赤霉菌、含有该菌的菌剂及它们的应用以及生产赤霉素的方法。


背景技术：

2.赤霉素(ga)是五大植物激素之一，结构为双萜类化合物，广泛存在于高等植物、真菌和细菌中。目前赤霉素的种类繁多，根据发现的时间编号为ga1-ga136，其中ga1、ga3、ga4和ga7具有较显著的生物活性。作为常见的植物激素，赤霉素能够打破种子休眠并促进茎和果实的生长，被广泛应用于农业、林业和酿造业等诸多领域，具有广阔的市场前景以及良好的经济价值和社会效益。ga的生产方法主要包括植物提取、化学合成和微生物发酵，而植物提取法受限于产量低，成本高的缺点，已被摒弃；化学合成法存在步骤多、污染多的限制。随着合成生物学的快速发展，微生物生产ga因过程绿色、原料可再生的优势逐渐受到人们的关注。目前，ga可以由许多真菌产生，例如藤仓赤霉菌、黑曲霉、尖孢镰刀菌等；研究发现，赤霉素合成需要复杂的p450酶系发挥作用，这也是赤霉素异源合成少有报道的重要原因，目前只在解脂耶氏酵母中导入赤霉素生物合成途径，但赤霉素产量仅为10mg/l，因此研究重点仍然放在天然优势菌株生产赤霉素上。
3.藤仓赤霉菌由于其天然生产ga的能力和可控的发酵过程，被认为是赤霉素的主要工业生产微生物，而藤仓赤霉菌液态深层发酵也是目前工业生产赤霉素的主要方式。现有的藤仓赤霉菌多从患有水稻恶苗病菌的禾本科植物中分离筛选得到，例如，公开号为cn1222575a的专利中，从浙江农村水稻田的恶苗病植株中分离出编号46的赤霉素生产菌株，这类从温和环境中分离的赤霉菌对温度、ph、渗透压等具有严格的要求，不利于应用在工业化生产赤霉素中，从工业角度出发，分析筛选出能抵抗生产过程中不利条件的菌种是至关重要的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术存在的赤霉素生产菌不能抵抗生产过程中不利条件的问题，提供一种藤仓赤霉菌、含有该菌的菌剂及它们的应用以及生产赤霉素的方法，该藤仓赤霉菌能够耐受γ射线辐照，具有良好的环境适应性和赤霉素生产潜力，适合工业化生产。
5.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种藤仓赤霉菌，所述藤仓赤霉菌(fusarium fujikuroi)的保藏编号为cctcc no:m 20221848。
6.本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的藤仓赤霉菌。
7.优选地，所述菌剂含有所述藤仓赤霉菌的活菌体和/或死菌体；优选为含有活菌体。
8.优选地，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂。
9.本发明第三方面提供上述的藤仓赤霉菌、上述的菌剂在生产赤霉素中的应用。
10.本发明第四方面提供一种生产赤霉菌的方法，该方法包括以下步骤：
11.(1)将上述的藤仓赤霉菌和/或上述的菌剂接种至种子培养基中进行种子培养得到种子液；
12.(2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
13.优选地，步骤(1)中所述种子培养基含有：葡萄糖、黄豆饼粉、花生饼粉、糊精、kh2po4、(nh4)2so4和mgso4·
7h2o。
14.优选地，所述种子培养基含有：葡萄糖20-50g/l，黄豆饼粉10-30g/l，花生饼粉8-15g/l，糊精20-40g/l，kh2po
4 0.8-1.6g/l，(nh4)2so
4 0.1-0.3g/l，mgso4·
7h2o 0.5-1.5g/l。
15.优选地，步骤(1)中所述种子培养的条件至少包括：温度为26-30℃，转速为250-350rpm，时间为40-60h。
16.优选地，步骤(2)中所述发酵培养基含有：碳源、氮源、豆油、mgso4·
7h2o、(nh4)2so4、kh2po4、znso4、mnso4；其中，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的至少一种，所述氮源选自酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米粉和黄豆饼粉中的至少一种。
17.优选地，所述发酵培养基含有：碳源40-120g/l，氮源25-40g/l，豆油0.8-1.6g/l，mgso4·
7h2o 0.8-1.6g/l，(nh4)2so
4 0.2-0.5g/l，kh2po
4 1.5-4g/l，znso
4 0.05-0.1g/l，mnso
4 0.05-0.1g/l。
18.优选地，步骤(2)中所述发酵培养的条件至少包括：接种量为3-8体积％，温度为26-30℃，转速为250-350rpm，时间为8-12天。
19.通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
20.本发明提供的藤仓赤霉菌能够高效生产赤霉素，发酵水平可达1250mg/l，且该藤仓赤霉菌对环境的耐受性强，能够在30kgry剂量的γ射线条件下存活，可应对高辐射的复杂生长环境，有望在工业发酵中发挥抗逆优势。
21.本发明提供的藤仓赤霉菌具有良好的生长环境适应性和赤霉素生产潜力，适合工业化生产。
22.本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
23.生物保藏
24.本发明提供的菌株为藤仓赤霉菌(fusarium fujikuroi)，编号为nnu-01，并于2022年11月30日被保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学校内，邮政编码：430072，保藏单位的缩写为cctcc)，保藏编号为cctcc no:m 20221848。
附图说明
25.图1是实施例1中纯化菌株nnu-01的菌种形态及显微镜照片，其中a为初生菌丝照片，b为菌苔照片，c为显微镜照片；
26.图2是实施例2中γ射线的辐射剂量与菌株nnu-01致死率的关系图；
27.图3是实施例3中纯化菌株nnu-01的发酵液中赤霉素的含量与时间的生产曲线图。
具体实施方式
28.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
29.本发明第一方面提供一种藤仓赤霉菌，所述藤仓赤霉菌(fusarium fujikuroi)的保藏编号为cctcc no:m 20221848。
30.本发明提供的藤仓赤霉菌分离自新疆地区辐射污染区的土壤，所述藤仓赤霉菌的分离可以采用本领域常规的用于新菌株分离的方法，例如，采用“分级筛选”策略——液相富集法。
31.液相富集法具体可以包括：收集新疆地区辐射污染区土壤，在灭完菌的研钵中碾碎后放入装有无菌生理盐水的锥形瓶中震荡悬浮5-15min，从锥形瓶中取悬浮液加入带有无菌生理盐水的灭菌管中稀释，并按照比例梯度稀释成10-2
、10-3
、10-4
三个浓度，稀释后继续震荡悬浮，最终取稀释液分别涂布于分离培养基的平板上，待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，持续划线直至无杂菌落，获得纯化菌株，将纯化菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，放入冰箱中保存备用。
32.本发明中，分离培养基的组分含有葡萄糖、蛋白胨、kh2po4·
7h2o、琼脂、1/3000孟加拉红水溶液和链霉素，具体可以为：葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，kh2po4·
7h2o 0.5g/l，琼脂15-20g/l，1/3000孟加拉红水溶液10％，链霉素30μg/l。牛肉膏蛋白胨培养基为本领域常用的固态培养基，其组分具体可以为：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl 5g/l，琼脂15-25g/l，ph为7.4-7.6。
33.本发明的发明人从筛选出的菌株中选取了一株能够耐受γ射线的纯化菌株nnu-01，进行了形态观察以及dna提取与鉴定，鉴定结果显示，该菌株的18s rdna序列与fusarium fujikuroi ls142菌株18s rdna基因序列的相似性为100％，可以确定该菌株为藤仓赤霉菌(fusarium fujikuroi)，并于2022年11月30日被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20221848。
34.本发明提供的藤仓赤霉菌经过培养能够产生大量的藤仓赤霉菌的活菌体和/或发酵产物。本发明对培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述藤仓赤霉菌大量增殖即可，例如，可以按照不低于1体积％的接种量将藤仓赤霉菌的活菌体接种于培养基中，并且在温度为26-30℃、转速为250-350rpm的条件下培养后得到培养液。其中，所述培养基可以为本领域常规使用的培养基，也可以为适于该藤仓赤霉菌生长的培养基。
35.本发明可以进一步分离上述培养液中的藤仓赤霉菌的菌体，对所述分离的方法没有特别的限制，只要能够从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域的常规条件，此为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
36.本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的藤仓赤霉菌。
37.在本发明中，对所述菌剂中藤仓赤霉菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。
38.根据本发明，优选地，所述菌剂含有所述藤仓赤霉菌的活菌体和/或死菌体；优选
为含有活菌体。
39.根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述菌剂可以为液态菌剂(例如可以为藤仓赤霉菌的菌液)和/或固态菌剂(例如可以为藤仓赤霉菌干燥制成的粉剂或经分离纯化等步骤制备成高纯度制剂)。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为本领域技术人员所熟知，在此不再详细赘述。
40.发明人发现，本发明提供的藤仓赤霉菌经培养能够高效生产赤霉素，且该藤仓赤霉菌对环境的耐受性强，能够在γ射线辐射的条件下存活，可应对高辐射的复杂生长环境，有望在工业发酵中发挥抗逆优势。基于此，本发明第三方面提供上述的藤仓赤霉菌、上述的菌剂在生产赤霉素中的应用。
41.本发明第四方面提供一种生产赤霉菌的方法，该方法包括以下步骤：
42.(1)将上述的藤仓赤霉菌和/或上述的菌剂接种至种子培养基中进行种子培养得到种子液；
43.(2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
44.根据本发明，所述发酵培养基可以是本领域中常见的培养基，优选情况下，步骤(1)中所述种子培养基含有：葡萄糖、黄豆饼粉、花生饼粉、糊精、kh2po4、(nh4)2so4和mgso4·
7h2o；进一步优选地，所述种子培养基含有：葡萄糖20-50g/l，黄豆饼粉10-30g/l，花生饼粉8-15g/l，糊精20-40g/l，kh2po
4 0.8-1.6g/l，(nh4)2so
4 0.1-0.3g/l，mgso4·
7h2o 0.5-1.5g/l。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够促进藤仓赤霉菌的生长，提高赤霉素的生产效率。
45.根据本发明，优选地，步骤(1)中所述种子培养的条件至少包括：温度为26-30℃，转速为250-350rpm，时间为40-60h。
46.根据本发明，优选地，步骤(2)中所述发酵培养基含有：碳源、氮源、豆油、mgso4·
7h2o、(nh4)2so4、kh2po4、znso4、mnso4；其中，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的至少一种，所述氮源选自酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米粉和黄豆饼粉中的至少一种。进一步优选地，碳源采用淀粉，其中淀粉以淀粉液化液的形式添加到发酵培养基中。所述淀粉液化液是利用木薯淀粉、小麦淀粉或玉米淀粉糊化后经过α-淀粉酶液化制得；其可以采用市售品，也可以采用现有技术公开的方法自行制备。例如，淀粉液化液的制备工艺可以为：淀粉与水按质量体积比1：5配制后，用盐酸调节ph至5.5，加热并不断搅拌至糊状；待温度降至60℃，按照酶与淀粉的质量比1：400加入市售α-淀粉酶(≥3700活力单位/克)，于60℃搅拌酶解60min，即得淀粉液化液。
47.根据本发明，优选地，所述发酵培养基含有：碳源40-120g/l，氮源25-40g/l，豆油0.8-1.6g/l，mgso4·
7h2o 0.8-1.6g/l，(nh4)2so
4 0.2-0.5g/l，kh2po
4 1.5-4g/l，znso
4 0.05-0.1g/l，mnso
4 0.05-0.1g/l。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够提高藤仓赤霉菌的生长速率以及对γ射线的耐受能力，进而提高赤霉素的生产效率，更加适于工业化生产。
48.根据本发明，优选地，步骤(2)中所述发酵培养的条件至少包括：接种量为3-8体积％，温度为26-30℃，转速为250-350rpm，时间为8-12天。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，能够提高藤仓赤霉菌的生长速率以及对γ射线的耐受能力，进而提高赤霉素的
生产效率，更加适于工业化生产。
49.本发明中，基于生产赤霉素的方法，还可以进一步采用常规的分离、纯化方法从发酵培养得到的发酵培养液中分离出赤霉素。
50.根据本发明一种特别优选的实施方式，生产赤霉素的方法包括以下步骤：
51.(1)将上述的藤仓赤霉菌和/或上述的菌剂接种至种子培养基中，在温度为26-30℃，转速为250-350rpm的条件下进行种子培养40-60h得到种子液，其中，种子培养基含有：葡萄糖20-50g/l，黄豆饼粉10-30g/l，花生饼粉8-15g/l，糊精20-40g/l，kh2po
4 0.8-1.6g/l，(nh4)2so
4 0.1-0.3g/l，mgso4·
7h2o 0.5-1.5g/l；
52.(2)将所述种子液以3-8体积％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为26-30℃，转速为250-350rpm的条件下进行发酵培养8-12天得到发酵培养液，其中，所述发酵培养基含有：淀粉液化液40-120g/l，氮源25-40g/l，豆油0.8-1.6g/l，mgso4·
7h2o 0.8-1.6g/l，(nh4)2so
4 0.2-0.5g/l，kh2po41.5-4g/l，znso
4 0.05-0.1g/l，mnso
4 0.05-0.1g/l。
53.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
54.以下实施例中，如无特殊说明，所用的实验材料和原料均为常规生化试剂商店购买得到。
55.以下实施例中，高效液相色谱仪的型号为戴安dionex u3000，显微镜为mshot明美生物显微镜、型号为ml-31；利用高效液相色谱检测赤霉素时，采用venusil mpc18柱(ageia technologies，填料粒径为5μm)，选择的流动相组分为：甲醇+水+磷酸(体积比为68:32:0.05)，使用前超声波脱气，流速：0.8ml/min，检测波长：210nm，进样量：10μl。
56.以下实施例中，淀粉液化液的制备过程为：淀粉与水按质量体积比1：5配制后，用盐酸调节ph至5.5，加热并不断搅拌至糊状；待温度降至60℃，按照酶与淀粉的质量比1：400加入市售α-淀粉酶(≥3700活力单位/克)，于60℃搅拌酶解60min；
57.分离培养基的组分为：葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，kh2po4·
7h2o 0.5g/l，琼脂18g/l，1/3000孟加拉红水溶液10％，链霉素30μg/l；
58.牛肉膏蛋白胨培养基的组分为：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl 5g/l，琼脂20g/l，ph为7.4-7.6；
59.生长培养基的组分为：葡萄糖35g/l，黄豆饼粉20g/l，花生饼粉12g/l，糊精30g/l，kh2po
4 1g/l，(nh4)2so
4 0.2g/l，mgso4·
7h2o 1g/l；
60.pda培养基的组分为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂18g/l。
61.实施例1
62.(1)菌株的分离与筛选
63.收集新疆地区辐射污染区土壤10g，在灭完菌的研钵中碾碎后放入装有90ml无菌生理盐水的锥形瓶中震荡悬浮10min，从锥形瓶中取1ml悬浮液加入带有9ml无菌生理盐水的灭菌管中稀释，并按照此比例梯度稀释成10-2
、10-3
、10-4
三个浓度，稀释后继续震荡悬浮5min，最终取0.1ml稀释液分别涂布于分离培养基的平板上，待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的分离培养基平板，持续划线直至无杂菌落，获得纯化菌株，将纯化的菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面，放入4℃冰箱中保存备用。
64.(2)菌株鉴定
65.将筛选得到的纯化菌株nnu-01接种至生长培养基中，于温度为28℃、转速为
200rpm、通气量为1vvm的条件下培养10天，得到生长培养液，利用拍照和显微镜观察菌株的形态，如图1所示。图1中a、b显示菌株nnu-01的初生菌丝呈白色，菌苔细绒毛状，无孢子，图1中c显示在显微镜下观察有丝状体。参照《真菌鉴定手册》，依据菌体的个体、群体形态和生理、生化试验测定菌株的种属。
66.采用真菌基因组dna提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司生产，产品编号为d2300-50t)提取纯化菌株nnu-01的dna，并将所提dna送至南京擎科生物公司完成18s rdna基因序列的测定，其核苷酸序列如seq id no.1所示：
67.cccaacccctgtgacataccaattgttgcctcggcggatcagcccgctcccggtaaaacgggacggcccgccagaggacccctaaactctgtttctatatgtaacttctgagtaaaaccataaataaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcaaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcccccgggtttggtgttggggatcggcgagcccttgcggcaagccggccccgaaatctagtggcggtctcgctgcagcttccattgcgtagtagtaaaaccctcgcaactggtacgcggcgcggccaagccgttaaacccccaacttctgaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa(seq id no.1)。
68.将纯化菌株nnu-01的18s rdna基因序列在genbank中进行blast序列比对分析，结果表明，其序列与fusarium fujikuroi ls142菌株的18s rdna基因序列的相似性为100％，鉴定为藤仓赤霉菌(fusarium fujikuroi)，并于2022年11月30日被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20221848。
69.实施例2耐辐射性能检测
70.当γ射线辐射受体生物后导致dna结构发生改变，进而导致受体生物发生突变，被选择为验证耐辐射菌性能的辐射源。
71.具体过程为：将实施例1得到的纯化菌株nnu-01接入pda培养基中培养3天进行菌种活化，保证一个培养皿中一个单菌，采用辐射剂量分别为10、20、30、40kgry的γ射线进行照射，辐射剂量率为50gy
·
min-1
，每个辐射强度设计5个平行组，并以不进行辐射的纯化菌株nnu-01作为对照组。为了防止光修复，辐射后的菌丝需要在黑暗中静置大约36h后取菌丝的3个位置在新的pda平板中进行转接，并每天观察记录菌丝的萌发时间、生长状态及菌丝直径；为了保证菌龄一致，对照组也要同诱变组一同进行转接，共同培养。γ射线的辐射剂量与菌株致死率的关系如图2所示，发现纯化菌株nnu-01能够耐受的γ射线辐射强度最强为30kgry，在γ射线高于30kgry时纯化菌株nnu-01将无法存活。
72.实施例3
73.种子培养基的组分为：葡萄糖35g/l，黄豆饼粉20g/l，花生饼粉12g/l，糊精30g/l，kh2po
4 1.2g/l，(nh4)2so
4 0.2g/l，mgso4·
7h2o 1g/l；
74.发酵培养基的组分为：淀粉液化液80g/l，酵母粉30g/l，豆油1.2g/l，mgso4·
7h2o 1.2g/l，(nh4)2so
4 0.3g/l，kh2po
4 2.5g/l，znso
4 0.1g/l，mnso
4 0.1g/l；
75.将实施例1得到的纯化菌株nnu-01接种到种子培养基中，在温度为28℃、转速为300rpm的条件下培养48h得到种子液；将种子液以5体积％的接种量接种到发酵培养基中，在温度为28℃、转速为300rpm的条件下培养10天得到最终发酵液；
76.实验设置三组平行试验，每隔24h取样检测发酵液中的赤霉素产量，将发酵液经过
12000rpm离心5min取得上清液，上清液通过0.22μm水系膜过滤后，装入液相进样瓶中，进行hplc分析，发酵液中赤霉素(ga)的含量与时间的生产曲线如图3所示。纯化菌株nnu-01发酵至第3天开始生产赤霉素，8天后赤霉素ga3产量达到1250mg/l，可以看出，实施例1得到的赤霉菌具有良好的赤霉素生产潜力。
77.实施例4
78.种子培养基的组分为：葡萄糖50g/l，黄豆饼粉30g/l，花生饼粉8g/l，糊精20g/l，kh2po
4 1.6g/l，(nh4)2so
4 0.1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l；
79.发酵培养基的组分为：淀粉液化液120g/l，蛋白胨25g/l，豆油0.8g/l，mgso4·
7h2o 0.8g/l，(nh4)2so
4 0.2g/l，kh2po
4 4g/l，znso
4 0.05g/l，mnso
4 0.05g/l；
80.将实施例1得到的纯化菌株nnu-01接种到种子培养基中，在温度为26℃、转速为350rpm的条件下培养60h得到种子液；将种子液以8体积％的接种量接种到发酵培养基中，在温度为26℃、转速为350rpm的条件下培养12天得到最终发酵液。
81.实施例5
82.种子培养基的组分为：葡萄糖20g/l，黄豆饼粉10g/l，花生饼粉15g/l，糊精40g/l，kh2po
4 0.8g/l，(nh4)2so
4 0.3g/l，mgso4·
7h2o 1.5g/l；
83.发酵培养基的组分为：淀粉液化液40g/l，玉米粉20g/l，黄豆饼粉20g/l，豆油1.6g/l，mgso4·
7h2o 1.6g/l，(nh4)2so
4 0.5g/l，kh2po
4 1.5g/l，znso40.1g/l，mnso
4 0.1g/l；
84.将实施例1得到的纯化菌株nnu-01接种到种子培养基中，在温度为30℃、转速为250rpm的条件下培养40h得到种子液；将种子液以3体积％的接种量接种到发酵培养基中，在温度为30℃、转速为250rpm的条件下培养8天得到最终发酵液。
85.实施例6
86.按照实施例5的方法获得纯化菌株nnu-01的最终发酵液，不同的是，将种子培养基的组分替换为：玉米淀粉20g/l、蔗糖20g/l、花生粉20g/l、大豆粉20g/l、kh2po
4 1g/l、mgso4·
7h2o 1g/l。
87.实施例7
88.按照实施例5的方法获得纯化菌株nnu-01的最终发酵液，不同的是，将发酵培养基的组分替换为：麦芽糖40g/l，玉米粉20g/l，黄豆饼粉20g/l，豆油1.6g/l，mgso4·
7h2o 1.6g/l，(nh4)2so
4 0.5g/l，kh2po
4 1.5g/l，znso
4 0.1g/l，mnso
4 0.1g/l。
89.实施例8
90.按照实施例5的方法获得纯化菌株nnu-01的最终发酵液，不同的是，将发酵培养基的组分替换为：玉米淀粉80g/l，米粉80g/l，大豆粉20g/l，花生粉20g/l，k2so
4 1g/l，kh2po
4 1g/l。
91.测试例1
92.取实施例3-实施例8和对比例1中的最终发酵液，按照实施例3中的hplc分析方法，检测最终发酵液中的赤霉素产量，结果见表1。
93.表1
94.编号最终发酵液中的赤霉素ga3产量mg/l实施例31250mg/l
实施例41216mg/l实施例51044mg/l实施例6975mg/l实施例71098mg/l实施例8899mg/l
95.通过表1的结果可以看出，本发明提供的藤仓赤霉菌能够高效生产赤霉素，发酵水平可达1250mg/l，且该藤仓赤霉菌对环境的耐受性强，能够在30kgry剂量的γ射线条件下存活，可应对高辐射的复杂生长环境，有望在工业发酵中发挥抗逆优势。
96.对比例1
97.以藤仓赤霉菌fujikuroi njtech 01(cctcc m2015614，来源自南京工业大学，已记载于公开号为cn105441340a的专利申请中)作为对比例1，将藤仓赤霉菌fujikuroi njtech 01接入pda培养基中培养3天进行菌种活化，保证一个培养皿中一个单菌，采用辐射剂量为10kgry的γ射线进行照射，辐射剂量率为50gy
·
min-1
，辐射后的菌丝需要在黑暗中静置大约36h后取菌丝的3个位置在新的pda平板中进行转接，并每天观察记录菌丝的萌发时间、生长状态及菌丝直径；发现藤仓赤霉菌fujikuroi njtech 01无法存活、不能耐受γ射线辐射。
98.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种藤仓赤霉菌，其特征在于，所述藤仓赤霉菌(fusarium fujikuroi)的保藏编号为cctcc no:m 20221848。2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的藤仓赤霉菌。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂含有所述藤仓赤霉菌的活菌体和/或死菌体；优选为含有活菌体。4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂。5.权利要求1所述的藤仓赤霉菌、权利要求2至4中任意一项所述的菌剂在生产赤霉素中的应用。6.一种生产赤霉菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将权利要求1所述的藤仓赤霉菌和/或权利要求2至4中任意一项所述的菌剂接种至种子培养基中进行种子培养得到种子液；(2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述种子培养基含有：葡萄糖、黄豆饼粉、花生饼粉、糊精、kh2po4、(nh4)2so4和mgso4·
7h2o；优选地，所述种子培养基含有：葡萄糖20-50g/l，黄豆饼粉10-30g/l，花生饼粉8-15g/l，糊精20-40g/l，kh2po
4 0.8-1.6g/l，(nh4)2so
4 0.1-0.3g/l，mgso4·
7h2o 0.5-1.5g/l。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述种子培养的条件至少包括：温度为26-30℃，转速为250-350rpm，时间为40-60h。9.根据权利要求6至8中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵培养基含有：碳源、氮源、豆油、mgso4·
7h2o、(nh4)2so4、kh2po4、znso4、mnso4；其中，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的至少一种，所述氮源选自酵母粉、酵母膏、蛋白胨、玉米粉和黄豆饼粉中的至少一种；优选地，所述发酵培养基含有：碳源40-120g/l，氮源25-40g/l，豆油0.8-1.6g/l，mgso4·
7h2o 0.8-1.6g/l，(nh4)2so
4 0.2-0.5g/l，kh2po
4 1.5-4g/l，znso
4 0.05-0.1g/l，mnso
4 0.05-0.1g/l。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵培养的条件至少包括：接种量为3-8体积％，温度为26-30℃，转速为250-350rpm，时间为8-12天。

技术总结
本发明涉及微生物领域，公开了一种藤仓赤霉菌、含有该菌的菌剂及它们的应用以及生产赤霉素的方法。所述藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)的保藏编号为CCTCC NO:M 20221848。本发明还提供所述藤仓赤霉菌在生产赤霉素中的应用。生产赤霉菌的方法包括以下步骤：将所述藤仓赤霉菌和/或所述菌剂接种至种子培养基中进行种子培养得到种子液；将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。本发明提供的藤仓赤霉菌能够耐受γ射线辐照，具有良好的环境适应性和赤霉素生产潜力，适合工业化生产。生产。生产。


技术研发人员：黄和 施天穹 李雅文 张志东
受保护的技术使用者：新疆农业科学院微生物应用研究所（中国新疆—亚美尼亚生物工程研究开发中心）
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/7/28