一种缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及蛋白肽技术领域，具体涉及一种缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物及其制备方法。


背景技术：

2.酒精性肝损伤(alcoholic liver disease，ald)不仅会损伤饮酒者的身体健康，更甚会危害家庭造成社会问题。数据显示，2016年全球过度饮酒导致约300万人死亡。人体一次性过量饮酒或长期大量摄入酒精会导致肝脏损伤，根据病因不同分为慢性和急性肝损伤。通常认为酒精性肝损伤是由于乙醇及代谢产物介导的氧化应激、机体免疫应答和肝细胞损伤造成。
3.酒精性肝损伤初期表现为脂肪肝，主要由于肝细胞中脂肪的积累(甘油三酯、磷脂和胆固醇酯等)。早期的研究表明，饮酒会增加肝细胞中napdh/nad的比率，破坏线粒体中β-氧化脂肪酸，导致脂肪变性。酒精摄入会增强从小肠到肝脏的脂质供应，增加肝脏对从脂肪组织中代谢的脂肪酸的吸收。长期饮酒还会引起营养吸收不良，使得食物中抗氧化剂的吸收降低，进而造成机体内促氧化物质增多而抗氧化物质降低，促生氧化应激，最终引起肝细胞损伤甚至导致坏死。
4.现今治疗酒精性肝损伤的药物种类很多。化学药品的治疗周期较短，但常伴随不良反应，且不适宜老弱孕期人群服用，存在一定局限性。中药的副作用较小但治疗周期较长，除了部分中成药已经得到验证，其他方剂用药因人而异，不利于临床大规模推广应用。
5.随着生活水平的提高和健康意识的增长，“药食同源”引起了人们的广泛关注。基于这一理论，与化学药物相比，蛋白肽具有方便吸收、来源广泛、安全性好等多种优点，可以参与而并非干预人体代谢，几乎无不良反应，适用于除肾功能不全者的各类人群。因其高营养价值和功能活性，除修复肝脏损伤外，还可一定程度改善由于酗酒导致的营养不良及并发症。当患者的营养状况得到改善，其免疫功能也会明显改善。越来越多的研究开始利用食品中提取的天然活性物质对酒精性肝损伤进行干预。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提出一种缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物及其制备方法，含有丰富的小肽物质，具有能耗低、吸收快、吸收率高、载体不易饱和等多种优点，丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸含量较高，对血清中乙醇浓度的升高产生更好的抑制作用，具有解酒护肝的的明显效果。
7.本发明的技术方案是这样实现的：
8.本发明提供一种缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物的制备方法，提取葛仙米蛋白，与牡蛎肉、鸡蛋蛋清混合，进行二级酶解，得到酶解产物，与水解小麦蛋白粉、水解大豆蛋白粉、碳源、维生素、无机盐加入水中，制得培养基，接种白参菌、酵母菌发酵后，灭菌，接种植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，发酵增殖，冷冻干燥，制得发酵产物，与玉米低聚肽、低聚
果糖、牛磺酸一起包埋于海藻酸钠-羧甲基纤维素钠壳层内，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
9.作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
10.s1.葛仙米蛋白的提取：将葛仙米藻粉加入水中，冻融处理，恢复至室温后加入溶菌酶酶解，灭酶，过滤，滤液加入乙醇沉淀，过滤，制得葛仙米蛋白液；
11.s2.一级酶解：将牡蛎肉绞碎，与鸡蛋蛋清、步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，加入一级复合酶酶解，灭酶，得到一级酶解产物；
12.s3.二级酶解：向步骤s2制得的一级酶解产物中加入二级复合酶酶解，灭酶，过滤，冷冻干燥，制得酶解产物；
13.s4.培养基的制备：将步骤s3制得的酶解产物、水解小麦蛋白粉、水解大豆蛋白粉、碳源、维生素、无机盐加入水中，调节ph值，灭菌，制得培养基；
14.s5.发酵：将活化的白参菌、酵母菌菌种种子液接种至步骤s4制得的培养基中，发酵培养，灭菌，过滤，制得发酵液；
15.s6.益生菌发酵：将活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液接种至步骤s5制得的发酵液中，补加碳源，发酵增殖培养，冷冻干燥，制得发酵产物；
16.s7.包埋：将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠溶于水中，加入步骤s6制得的发酵产物、玉米低聚肽、低聚果糖、牛磺酸，搅拌混合均匀，加入食用油，乳化，滴加氯化钙溶液，常温固化，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
17.作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述葛仙米藻粉和水的固液比为1:5-7g/ml，所述冻融处理的方法为置于-25至-20℃冷冻2-3h，室温解冻；所述溶菌酶的加入量为1-2g/l，所述酶解的温度为35-40℃，时间为2-3h，所述加入乙醇至体系乙醇含量为70-80wt％，沉淀5-7h。
18.作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述牡蛎肉、鸡蛋蛋清、葛仙米蛋白液、一级复合酶的质量比为5-7:3-5:50-70:0.5-1，所述一级复合酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，质量比为5-7:10，所述酶解温度为38-42℃，时间为2-3h。
19.作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述一级酶解产物、二级复合酶的质量比为100:1-1.5，所述二级复合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，质量比为3-5:2，酶解温度为45-55℃，时间为1-2h。
20.作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述酶解产物、水解小麦蛋白粉、水解大豆蛋白粉、碳源、维生素、无机盐和水的质量比为5-10:3-5:2-4:20-30:1-2:2-3:500，所述碳源选自葡萄糖、糖蜜、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、琼脂中的至少一种，所述维生素选自维生素c、维生素b1、维生素b2、维生素a、维生素k、维生素b12、维生素d1、维生素e、叶酸、维生素d3中的至少一种，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的至少一种；所述调节ph值为6.7-7.2。
21.作为本发明的进一步改进，步骤s5中所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的制备方法为分别将白参菌、酵母菌接种至高氏培养基中，37-40℃，50-70r/min，活化培养12-16h，制得含菌量为10
8-109cfu/ml的菌种种子液，所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的接种量分别为2-3％和1-2％，所述发酵培养的条件为37-40℃，50-70r/min，发酵培养36-48h。
22.作为本发明的进一步改进，步骤s6中所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的制备方法为分别将植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌接种至高氏培养基中，37-40℃，50-70r/min，微缺氧条件下，活化培养12-16h，制得含菌量为10
8-109cfu/ml的菌种种子液；所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的接种量分别为1.5-2％和1-2％，所述发酵增殖培养的条件为36-38℃，50-70r/min，微缺氧条件下，发酵培养36-48h，所述微缺氧条件为二氧化碳的含量为3-5v/v％，氧气含量4-6v/v％，余量为氮气；所述补加的碳源的量为20-50g/l，所述碳源选自葡萄糖、糖蜜、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、琼脂中的至少一种。
23.作为本发明的进一步改进，步骤s7中所述海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、水、发酵产物、玉米低聚肽、低聚果糖、牛磺酸的质量比为5-7:7-10:100:12-15:3-5:2-3:1-2，所述食用油选自花生油、玉米油、大豆油、菜籽油、鱼油、葵花籽油、芝麻油、亚麻籽油、橄榄油中的至少一种；所述乳化的条件为12000-15000r/min乳化4-7min，所述氯化钙溶液的浓度为1-2wt％；所述常温固化的时间为30-50min。
24.本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
25.本发明具有如下有益效果：氧化造成损伤是酒精的主要危害之一，过度饮酒导致血液和肝脏中酒精和乙醛的聚集，肝脏在分解酒精进行代谢的过程中会形成极多的活性氧和活性氮等，致使抗氧化水平降低，进一步造成过度氧化应激生成氧化产物，使抗氧化系统破坏，造成线粒体损伤，导致肝细胞损伤和肝功能障碍。酒精代谢引起的氧化应激和炎症反应，会导致线粒体依赖性细胞凋亡，加速酒精性肝损伤的进展。长期大量地摄入酒精将对机体的肝脏造成极大的损害，导致酒精性肝病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化等肝脏疾病。
26.一般缓酒精入口后，在途径胃、小肠、大肠、十二指肠的过程中大部分被吸收，只有极小部分(约2％)被排出，而被吸收的酒精绝大部分经血液循环进入肝脏进行代谢。乙醇进入机体后有多种代谢途径，但90％是通过在肝脏内氧化实现的，酒精在肝脏内的代谢主要由乙醇脱氢酶(adh)、乙醛脱氢酶(aldh)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)催化完成，其中adh途径是主要的代谢途径，在其作用过程中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)为辅酶。乙醇氧化时，辅酶i磷酸化生成辅酶ii，胞浆nadh/nad
+
比值明显升高，使三羧酸循环受到限制，从而影响脂肪酸代谢，引起脂质过氧化反应，造成部分脂肪酸堆积。机体摄入蛋白肽后，血液中丙氨酸和亮氨酸浓度增大，nad
+
得到足够的补充，三羧酸循环不再受限，防止血液中乙醇浓度升高。
27.本发明缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物针对酒精在体内的吸收及代谢机制通过以下三个方面实现功效：一、在胃肠道途径中通过减缓吸收速度及增加代谢降低血液中乙醇浓度；二、在肝脏中通过调节代谢酶活性加快酒精代谢；三、通过消除酒精代谢过程中产生的自由基降低机体损伤。
28.本发明缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物具有解酒护肝的的明显效果，可以提高人体内乙醇脱氢酶(adh)的活性以加快酒精的代谢速度，清除在酒精代谢的过程中产生的大量自由基从而降低酒精对肝脏的损伤，含有的谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸有利于合成乙醇代谢酶并减轻醉酒症状。
29.本发明添加的玉米低聚肽能够很好地促进小鼠体内酒精的代谢，降低小鼠血清谷丙转氨酶活性，对酒精性肝损伤具有很好的防护作用，激活乙醇脱氢酶活力，加速乙醇代谢；且通过提高超氧化物歧化酶活性，减少有害自由基在体内的积累，从而抑制脂质过氧化，降低丙二醛的含量，达到减少肝脏损伤的作用。牛磺酸能够显著降低血浆乙醇浓度并提高乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，具有很好的解酒防醉作用，两者具有协同增效的作用。
30.葛仙米藻粉中含有丰富的蛋白质，其氨基酸种类丰富，葛仙米蛋白质含量超过45％，共含有17种氨基酸，其中，谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸的含量较为丰富。牡蛎肉中含有较多牛磺酸，其中，具有解酒防醉效果的成分除牛磺酸外还有牡蛎糖原，二者都能有效延长酒精耐受时间并缩短醉酒时间。其中，牛磺酸将乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶活力均能大幅度提高，使血液中乙醇加速代谢，从而显著降低血醇浓度，起到醒酒的作用。鸡蛋蛋白中富含利于促乙醇代谢的氨基酸，将三者进行二级酶解，制得小分子量、易吸收的植物、动物混合蛋白肽，具备较好的抗氧化能力，能够清除人体内的自由基，对促乙醇代谢有明显的提高，对肝脏损伤有明显的保护作用。
31.水解大豆蛋白可以使肝脏中甘油三酯的含量降低，对肝脏脂质代谢有促进作用。水解小麦蛋白能通过提高血液中的丙氨酸和亮氨酸含量，使nad
+
稳定存在。两者具有协同增效的作用。
32.酶解产物与水解小麦蛋白粉、水解大豆蛋白粉混合，经过白参菌、酵母菌发酵，白参菌及其发酵产物对降低高血压、高胆固醇、保护肝脏损伤、增强机体免疫和抑制肿瘤活性力等方面有很大作用。酵母发酵产物具有抗氧化及保肝作用，能有效抑制羟基自由基和抗磷脂氧化，对乙醇诱导的肝损伤均有辅助保护作用。两种菌种的协同发酵产物具有能够清除自由基、提高免疫力、改善血液循环、维持内环境平衡、保肝、健胃、抑制肿瘤等功效。
33.肠道菌群在酒精性肝损伤的发病机制中起着重要作用。由于肠道细菌或其代谢产物通过门静脉进入肝脏，导致肠道微生物区系的改变进而影响肝脏功能，即通过“肠-肝轴”途径相互影响，慢性酒精暴露会导致肠道丁酸水平下降，丁酸前体药物三丁酸甘油酯(tb)可显著减轻乙醇介导的肠道屏障功能障碍和肝脏脂肪变性和损伤。
34.本发明在经过白参菌、酵母菌发酵制得的发酵液中进一步接种益生菌(包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌)，在丰富的氮源、碳源的条件下，益生菌快速大量增殖，并且产生大量的有益产物包括短链脂肪酸等，进入肠道后明显他提高肠道丁酸水平，提高肠道有益菌丰度，通过“肠-肝轴”起到很好的正向调节，对肝脏损伤起到明显的保护作用。
35.本发明包埋壳层包括海藻酸钠和羧甲基纤维素钠，与金属离子发生配位交联作用形成稳定的结构，将活性组份包裹在微胶囊内部，形成从而形成了缓释结构，进入人体后，不易于在胃部被分解，从而能顺利进入肠道后被降解释放出来，使得大量的益生菌、玉米低聚肽、低聚果糖、牛磺酸等能直接被肠道吸收，低聚果糖是一种有效的益生元，起到高效的提高肠道益生菌菌群的作用。
36.本发明缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物含有丰富的小肽物质，具有能耗低、吸收快、吸收率高、载体不易饱和等多种优点，丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸含量较高，对血清中乙醇浓度的升高产生更好的抑制作用，具有解酒护肝的的明显效果。
具体实施方式
37.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.葛仙米藻粉购于湖南炎帝生物工程有限公司；溶菌酶购于南宁东恒华道生物科技有限责任公司；鸡蛋蛋清取自鸡蛋，鸡蛋和牡蛎肉均购于农贸市场；碱性蛋白酶，fdg-2202，20万u/g，胰蛋白酶，gdg-2016，4万u/g，中性蛋白酶，sdg-2430，5万u/g，木瓜蛋白酶，fdg-2203，10万u/g，购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司；水解小麦蛋白粉，含量》90％，购于深圳晨兴生物科技有限公司；水解大豆蛋白粉，含量》93％，购于山东松茂生物科技有限公司；白参菌购于湖北千宝食用菌有限公司，酵母菌购于安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌，jylp-326，100亿cfu/g，鼠李糖乳杆菌，jylr-005，100亿cfu/g，购于山东中科嘉亿生物工程有限公司。
39.实施例1
40.本实施例提供一种缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物的制备方法，包括以下步骤：
41.s1.葛仙米蛋白的提取：将葛仙米藻粉加入水中，所述葛仙米藻粉和水的固液比为1:5g/ml，置于-25℃冷冻2h，室温解冻，恢复至室温后加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为1g/l，35℃酶解2h，紫外线灭酶，过滤，滤液加入乙醇至体系乙醇含量为70wt％，沉淀5h，过滤，制得葛仙米蛋白液；
42.s2.一级酶解：将5重量份牡蛎肉绞碎，与3重量份鸡蛋蛋清、50重量份步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，搅拌10min，加入0.5重量份一级复合酶，38℃酶解2h，紫外线灭酶，得到一级酶解产物；
43.所述一级复合酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，质量比为5:10；
44.s3.二级酶解：向100重量份步骤s2制得的一级酶解产物中加入1重量份二级复合酶，45℃酶解1h，紫外线灭酶，过滤，冷冻干燥，制得酶解产物；
45.所述二级复合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，质量比为3:2；
46.s4.培养基的制备：将5重量份步骤s3制得的酶解产物、3重量份水解小麦蛋白粉、2重量份水解大豆蛋白粉、10重量份麦芽糖、10重量份葡萄糖、0.5重量份维生素d1、0.5重量份维生素e、1重量份氯化钠、0.3重量份氯化锌、0.3重量份氯化铜、0.4重量份氯化锰加入500重量份水中，调节ph值为6.7，紫外线灭菌，制得培养基；
47.s5.发酵：将活化的白参菌、酵母菌菌种种子液接种至步骤s4制得的培养基中，所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的接种量分别为2％和1％，37℃，50r/min，发酵培养36h，紫外线灭菌，过滤，制得发酵液；
48.所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的制备方法为分别将白参菌、酵母菌接种至高氏培养基中，37℃，50r/min，活化培养12h，制得含菌量为108cfu/ml的菌种种子液；
49.s6.益生菌发酵：将活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液接种至步骤s5制得的发酵液中，所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的接种量分别为1.5％和1％，补加葡萄糖，所述补加的葡萄糖的量为20g/l，36℃，50r/min，微缺氧条件下，发酵培养
36h，冷冻干燥，制得发酵产物；
50.所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的制备方法为分别将植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌接种至高氏培养基中，37℃，50r/min，微缺氧条件下，活化培养12h，制得含菌量为108cfu/ml的菌种种子液；
51.所述微缺氧条件为二氧化碳的含量为3v/v％，氧气含量4v/v％，余量为氮气；
52.s7.包埋：将5重量份海藻酸钠、7重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入12重量份步骤s6制得的发酵产物、3重量份玉米低聚肽、2重量份低聚果糖、1重量份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份花生油，12000r/min乳化4min，滴加5重量份1wt％氯化钙溶液，常温固化30min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
53.实施例2
54.本实施例提供一种缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物的制备方法，包括以下步骤：
55.s1.葛仙米蛋白的提取：将葛仙米藻粉加入水中，所述葛仙米藻粉和水的固液比为1:7g/ml，置于-20℃冷冻3h，室温解冻，恢复至室温后加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为2g/l，40℃酶解3h，紫外线灭酶，过滤，滤液加入乙醇至体系乙醇含量为80wt％，沉淀7h，过滤，制得葛仙米蛋白液；
56.s2.一级酶解：将7重量份牡蛎肉绞碎，与5重量份鸡蛋蛋清、70重量份步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，搅拌10min，加入1重量份一级复合酶，42℃酶解3h，紫外线灭酶，得到一级酶解产物；
57.所述一级复合酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，质量比为7:10；
58.s3.二级酶解：向100重量份步骤s2制得的一级酶解产物中加入1.5重量份二级复合酶，55℃酶解2h，紫外线灭酶，过滤，冷冻干燥，制得酶解产物；
59.所述二级复合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，质量比为5:2；
60.s4.培养基的制备：将10重量份步骤s3制得的酶解产物、5重量份水解小麦蛋白粉、4重量份水解大豆蛋白粉、10重量份麦芽糖、10重量份乳糖、10重量份蔗糖、1重量份维生素c、0.3重量份维生素b1、0.3重量份维生素b2、0.4重量份维生素a、1重量份氯化钾、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁、0.5重量份硫酸锌加入500重量份水中，调节ph值为7.2，紫外线灭菌，制得培养基；
61.s5.发酵：将活化的白参菌、酵母菌菌种种子液接种至步骤s4制得的培养基中，所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的接种量分别为3％和2％，40℃，70r/min，发酵培养48h，紫外线灭菌，过滤，制得发酵液；
62.所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的制备方法为分别将白参菌、酵母菌接种至高氏培养基中，40℃，70r/min，活化培养16h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
63.s6.益生菌发酵：将活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液接种至步骤s5制得的发酵液中，所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的接种量分别为2％和2％，补加葡萄糖，所述补加的葡萄糖的量为50g/l，38℃，70r/min，微缺氧条件下，发酵培养48h，冷冻干燥，制得发酵产物；
64.所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的制备方法为分别将植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌接种至高氏培养基中，40℃，70r/min，微缺氧条件下，活化培养16h，制得
含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
65.所述微缺氧条件为二氧化碳的含量为5v/v％，氧气含量6v/v％，余量为氮气；
66.s7.包埋：将7重量份海藻酸钠、10重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入15重量份步骤s6制得的发酵产物、5重量份玉米低聚肽、3重量份低聚果糖、2重量份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份菜籽油，15000r/min乳化7min，滴加5重量份2wt％氯化钙溶液，常温固化50min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
67.实施例3
68.本实施例提供一种缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物的制备方法，包括以下步骤：
69.s1.葛仙米蛋白的提取：将葛仙米藻粉加入水中，所述葛仙米藻粉和水的固液比为1:6g/ml，置于-22℃冷冻2.5h，室温解冻，恢复至室温后加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为1.5g/l，37℃酶解2.5h，紫外线灭酶，过滤，滤液加入乙醇至体系乙醇含量为75wt％，沉淀6h，过滤，制得葛仙米蛋白液；
70.s2.一级酶解：将6重量份牡蛎肉绞碎，与4重量份鸡蛋蛋清、60重量份步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，搅拌10min，加入0.7重量份一级复合酶，40℃酶解2.5h，紫外线灭酶，得到一级酶解产物；
71.所述一级复合酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，质量比为6:10；
72.s3.二级酶解：向100重量份步骤s2制得的一级酶解产物中加入1.2重量份二级复合酶，50℃酶解1.5h，紫外线灭酶，过滤，冷冻干燥，制得酶解产物；
73.所述二级复合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，质量比为4:2；
74.s4.培养基的制备：将7重量份步骤s3制得的酶解产物、4重量份水解小麦蛋白粉、3重量份水解大豆蛋白粉、15重量份葡萄糖、10重量份果糖、1重量份维生素c、0.5重量份维生素b1、1.5重量份氯化钠、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰加入500重量份水中，调节ph值为7，紫外线灭菌，制得培养基；
75.s5.发酵：将活化的白参菌、酵母菌菌种种子液接种至步骤s4制得的培养基中，所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的接种量分别为2.5％和1.5％，38℃，60r/min，发酵培养42h，紫外线灭菌，过滤，制得发酵液；
76.所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的制备方法为分别将白参菌、酵母菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
77.s6.益生菌发酵：将活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液接种至步骤s5制得的发酵液中，所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的接种量分别为1.7％和1.5％，补加葡萄糖，所述补加的葡萄糖的量为35g/l，37℃，60r/min，微缺氧条件下，发酵培养42h，冷冻干燥，制得发酵产物；
78.所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的制备方法为分别将植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，微缺氧条件下，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
79.所述微缺氧条件为二氧化碳的含量为4v/v％，氧气含量5v/v％，余量为氮气；
80.s7.包埋：将6重量份海藻酸钠、8.5重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入13.5重量份步骤s6制得的发酵产物、4重量份玉米低聚肽、2.5重量份低聚果糖、1.5重量
份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份玉米油，13500r/min乳化5min，滴加5重量份1.5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
81.实施例4
82.与实施例3相比，不同之处在于，一级复合酶为单一的碱性蛋白酶。
83.实施例5
84.与实施例3相比，不同之处在于，一级复合酶为单一的胰蛋白酶。
85.实施例6
86.与实施例3相比，不同之处在于，二级复合酶为单一的中性蛋白酶。
87.实施例7
88.与实施例3相比，不同之处在于，二级复合酶为单一的木瓜蛋白酶。
89.对比例1
90.与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤s1。
91.具体如下：
92.包括以下步骤：
93.s1.一级酶解：将6重量份牡蛎肉绞碎，与4重量份鸡蛋蛋清、60重量份水混合，搅拌10min，加入0.7重量份一级复合酶，40℃酶解2.5h，紫外线灭酶，得到一级酶解产物；
94.所述一级复合酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，质量比为6:10；
95.s2.二级酶解：向100重量份步骤s1制得的一级酶解产物中加入1.2重量份二级复合酶，50℃酶解1.5h，紫外线灭酶，过滤，冷冻干燥，制得酶解产物；
96.所述二级复合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，质量比为4:2；
97.s3.培养基的制备：将7重量份步骤s2制得的酶解产物、4重量份水解小麦蛋白粉、3重量份水解大豆蛋白粉、15重量份葡萄糖、10重量份果糖、1重量份维生素c、0.5重量份维生素b1、1.5重量份氯化钠、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰加入500重量份水中，调节ph值为7，紫外线灭菌，制得培养基；
98.s4.发酵：将活化的白参菌、酵母菌菌种种子液接种至步骤s3制得的培养基中，所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的接种量分别为2.5％和1.5％，38℃，60r/min，发酵培养42h，紫外线灭菌，过滤，制得发酵液；
99.所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的制备方法为分别将白参菌、酵母菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
100.s5.益生菌发酵：将活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液接种至步骤s4制得的发酵液中，所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的接种量分别为1.7％和1.5％，补加葡萄糖，所述补加的葡萄糖的量为35g/l，37℃，60r/min，微缺氧条件下，发酵培养42h，冷冻干燥，制得发酵产物；
101.所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的制备方法为分别将植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，微缺氧条件下，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
102.所述微缺氧条件为二氧化碳的含量为4v/v％，氧气含量5v/v％，余量为氮气；
103.s6.包埋：将6重量份海藻酸钠、8.5重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加
入13.5重量份步骤s5制得的发酵产物、4重量份玉米低聚肽、2.5重量份低聚果糖、1.5重量份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份玉米油，13500r/min乳化5min，滴加5重量份1.5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
104.对比例2
105.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s2中未添加牡蛎肉。
106.具体如下：
107.s2.一级酶解：将10重量份鸡蛋蛋清、60重量份步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，搅拌10min，加入0.7重量份一级复合酶，40℃酶解2.5h，紫外线灭酶，得到一级酶解产物。
108.对比例3
109.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s2中未添加鸡蛋蛋清。
110.具体如下：
111.s2.一级酶解：将10重量份牡蛎肉绞碎，与60重量份步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，搅拌10min，加入0.7重量份一级复合酶，40℃酶解2.5h，紫外线灭酶，得到一级酶解产物。
112.对比例4
113.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s2中未进行一级复合酶酶解。
114.具体如下：
115.s2.一级酶解：将6重量份牡蛎肉绞碎，与4重量份鸡蛋蛋清、60重量份水混合，搅拌10min，得到混合物。
116.对比例5
117.与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤s3。
118.具体如下：
119.包括以下步骤：
120.s1.葛仙米蛋白的提取：将葛仙米藻粉加入水中，所述葛仙米藻粉和水的固液比为1:6g/ml，置于-22℃冷冻2.5h，室温解冻，恢复至室温后加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为1.5g/l，37℃酶解2.5h，紫外线灭酶，过滤，滤液加入乙醇至体系乙醇含量为75wt％，沉淀6h，过滤，制得葛仙米蛋白液；
121.s2.一级酶解：将6重量份牡蛎肉绞碎，与4重量份鸡蛋蛋清、60重量份步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，搅拌10min，加入0.7重量份一级复合酶，40℃酶解2.5h，紫外线灭酶，得到一级酶解产物；
122.所述一级复合酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，质量比为6:10；
123.s3.培养基的制备：将7重量份步骤s2制得的一级酶解产物、4重量份水解小麦蛋白粉、3重量份水解大豆蛋白粉、15重量份葡萄糖、10重量份果糖、1重量份维生素c、0.5重量份维生素b1、1.5重量份氯化钠、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰加入500重量份水中，调节ph值为7，紫外线灭菌，制得培养基；
124.s4.发酵：将活化的白参菌、酵母菌菌种种子液接种至步骤s3制得的培养基中，所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的接种量分别为2.5％和1.5％，38℃，60r/min，发酵培
养42h，紫外线灭菌，过滤，制得发酵液；
125.所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的制备方法为分别将白参菌、酵母菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
126.s5.益生菌发酵：将活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液接种至步骤s4制得的发酵液中，所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的接种量分别为1.7％和1.5％，补加葡萄糖，所述补加的葡萄糖的量为35g/l，37℃，60r/min，微缺氧条件下，发酵培养42h，冷冻干燥，制得发酵产物；
127.所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的制备方法为分别将植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，微缺氧条件下，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
128.所述微缺氧条件为二氧化碳的含量为4v/v％，氧气含量5v/v％，余量为氮气；
129.s6.包埋：将6重量份海藻酸钠、8.5重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入13.5重量份步骤s5制得的发酵产物、4重量份玉米低聚肽、2.5重量份低聚果糖、1.5重量份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份玉米油，13500r/min乳化5min，滴加5重量份1.5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
130.对比例6
131.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s4中未添加水解小麦蛋白粉。
132.具体如下：
133.s4.培养基的制备：将7重量份步骤s3制得的酶解产物、7重量份水解大豆蛋白粉、15重量份葡萄糖、10重量份果糖、1重量份维生素c、0.5重量份维生素b1、1.5重量份氯化钠、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰加入500重量份水中，调节ph值为7，紫外线灭菌，制得培养基。
134.对比例7
135.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s4中未添加水解大豆蛋白粉。
136.具体如下：
137.s4.培养基的制备：将7重量份步骤s3制得的酶解产物、7重量份水解小麦蛋白粉、15重量份葡萄糖、10重量份果糖、1重量份维生素c、0.5重量份维生素b1、1.5重量份氯化钠、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰加入500重量份水中，调节ph值为7，紫外线灭菌，制得培养基。
138.对比例8
139.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s4中未添加水解小麦蛋白粉和水解大豆蛋白粉。
140.具体如下：
141.s4.培养基的制备：将14重量份步骤s3制得的酶解产物、15重量份葡萄糖、10重量份果糖、1重量份维生素c、0.5重量份维生素b1、1.5重量份氯化钠、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰加入500重量份水中，调节ph值为7，紫外线灭菌，制得培养基。
142.对比例9
143.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s5中未接种白参菌。
144.具体如下：
145.s5.发酵：将活化的酵母菌菌种种子液接种至步骤s4制得的培养基中，所述活化的酵母菌菌种种子液的接种量为4％，38℃，60r/min，发酵培养42h，紫外线灭菌，过滤，制得发酵液；
146.所述活化的酵母菌菌种种子液的制备方法为将酵母菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液。
147.对比例10
148.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s5中未接种酵母菌。
149.具体如下：
150.s5.发酵：将活化的白参菌菌种种子液接种至步骤s4制得的培养基中，所述活化的白参菌菌种种子液的接种量为4％，38℃，60r/min，发酵培养42h，紫外线灭菌，过滤，制得发酵液；
151.所述活化的白参菌菌种种子液的制备方法为将白参菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液。
152.对比例11
153.与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤s5。
154.具体如下：
155.包括以下步骤：
156.s1.葛仙米蛋白的提取：将葛仙米藻粉加入水中，所述葛仙米藻粉和水的固液比为1:6g/ml，置于-22℃冷冻2.5h，室温解冻，恢复至室温后加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为1.5g/l，37℃酶解2.5h，紫外线灭酶，过滤，滤液加入乙醇至体系乙醇含量为75wt％，沉淀6h，过滤，制得葛仙米蛋白液；
157.s2.一级酶解：将6重量份牡蛎肉绞碎，与4重量份鸡蛋蛋清、60重量份步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，搅拌10min，加入0.7重量份一级复合酶，40℃酶解2.5h，紫外线灭酶，得到一级酶解产物；
158.所述一级复合酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，质量比为6:10；
159.s3.二级酶解：向100重量份步骤s2制得的一级酶解产物中加入1.2重量份二级复合酶，50℃酶解1.5h，紫外线灭酶，过滤，冷冻干燥，制得酶解产物；
160.所述二级复合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，质量比为4:2；
161.s4.培养基的制备：将7重量份步骤s3制得的酶解产物、4重量份水解小麦蛋白粉、3重量份水解大豆蛋白粉、15重量份葡萄糖、10重量份果糖、1重量份维生素c、0.5重量份维生素b1、1.5重量份氯化钠、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰加入500重量份水中，调节ph值为7，紫外线灭菌，制得培养基；
162.s5.益生菌发酵：将活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液接种至步骤s4制得的培养基中，所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的接种量分别为1.7％和1.5％，补加葡萄糖，所述补加的葡萄糖的量为35g/l，37℃，60r/min，微缺氧条件下，发酵培养42h，冷冻干燥，制得发酵产物；
163.所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的制备方法为分别将植物乳杆
菌、鼠李糖乳杆菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，微缺氧条件下，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
164.所述微缺氧条件为二氧化碳的含量为4v/v％，氧气含量5v/v％，余量为氮气；
165.s6.包埋：将6重量份海藻酸钠、8.5重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入13.5重量份步骤s5制得的发酵产物、4重量份玉米低聚肽、2.5重量份低聚果糖、1.5重量份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份玉米油，13500r/min乳化5min，滴加5重量份1.5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
166.对比例12
167.与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤s6。
168.具体如下：
169.包括以下步骤：
170.s1.葛仙米蛋白的提取：将葛仙米藻粉加入水中，所述葛仙米藻粉和水的固液比为1:6g/ml，置于-22℃冷冻2.5h，室温解冻，恢复至室温后加入溶菌酶，溶菌酶的加入量为1.5g/l，37℃酶解2.5h，紫外线灭酶，过滤，滤液加入乙醇至体系乙醇含量为75wt％，沉淀6h，过滤，制得葛仙米蛋白液；
171.s2.一级酶解：将6重量份牡蛎肉绞碎，与4重量份鸡蛋蛋清、60重量份步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，搅拌10min，加入0.7重量份一级复合酶，40℃酶解2.5h，紫外线灭酶，得到一级酶解产物；
172.所述一级复合酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，质量比为6:10；
173.s3.二级酶解：向100重量份步骤s2制得的一级酶解产物中加入1.2重量份二级复合酶，50℃酶解1.5h，紫外线灭酶，过滤，冷冻干燥，制得酶解产物；
174.所述二级复合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，质量比为4:2；
175.s4.培养基的制备：将7重量份步骤s3制得的酶解产物、4重量份水解小麦蛋白粉、3重量份水解大豆蛋白粉、15重量份葡萄糖、10重量份果糖、1重量份维生素c、0.5重量份维生素b1、1.5重量份氯化钠、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜、0.2重量份硫酸锰加入500重量份水中，调节ph值为7，紫外线灭菌，制得培养基；
176.s5.发酵：将活化的白参菌、酵母菌菌种种子液接种至步骤s4制得的培养基中，所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的接种量分别为2.5％和1.5％，38℃，60r/min，发酵培养42h，紫外线灭菌，过滤，冷冻干燥，制得发酵物；
177.所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的制备方法为分别将白参菌、酵母菌接种至高氏培养基中，38℃，60r/min，活化培养14h，制得含菌量为109cfu/ml的菌种种子液；
178.s6.包埋：将6重量份海藻酸钠、8.5重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入13.5重量份步骤s5制得的发酵物、4重量份玉米低聚肽、2.5重量份低聚果糖、1.5重量份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份玉米油，13500r/min乳化5min，滴加5重量份1.5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
179.对比例13
180.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s7中未添加玉米低聚肽。
181.具体如下；
182.s7.包埋：将6重量份海藻酸钠、8.5重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入13.5重量份步骤s6制得的发酵产物、2.5重量份低聚果糖、5.5重量份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份玉米油，13500r/min乳化5min，滴加5重量份1.5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
183.对比例14
184.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s7中未添加牛磺酸。
185.具体如下；
186.s7.包埋：将6重量份海藻酸钠、8.5重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入13.5重量份步骤s6制得的发酵产物、2.5重量份低聚果糖、5.5重量份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份玉米油，13500r/min乳化5min，滴加5重量份1.5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
187.对比例15
188.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s7中未添加玉米低聚肽和牛磺酸。
189.具体如下；
190.s7.包埋：将6重量份海藻酸钠、8.5重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入19重量份步骤s6制得的发酵产物、2.5重量份低聚果糖，搅拌混合20min，加入150重量份玉米油，13500r/min乳化5min，滴加5重量份1.5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
191.对比例16
192.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s7中未添加发酵产物。
193.具体如下；
194.s7.包埋：将6重量份海藻酸钠、8.5重量份羧甲基纤维素钠溶于100重量份水中，加入17.5重量份玉米低聚肽、2.5重量份低聚果糖、1.5重量份牛磺酸，搅拌混合20min，加入150重量份玉米油，13500r/min乳化5min，滴加5重量份1.5wt％氯化钙溶液，常温固化40min，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
195.对比例17
196.与实施例3相比，不同之处在于，步骤s7中未进行包埋。
197.具体如下：
198.s7.将13.5重量份步骤s6制得的发酵产物、4重量份玉米低聚肽、2.5重量份低聚果糖、1.5重量份牛磺酸，搅拌混合20min，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。
199.测试例1成分测定
200.将实施例1-7和对比例1-17制得的缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物进行成分测定。
201.蛋白质含量测定：按照gb 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，采用凯氏定氮法测定。
202.游离氨基酸含量测定：按照gb 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》，采用全自动氨基酸分析仪测定，色氨酸的测定采用碱水解法进行。
203.小分子肽含量测定：按照gb/t 22492-2008和gb/t 22729-2008进行，pbh经过tca
溶液溶解处理后，离心分离出沉淀物，收集离心上清液；按照gb 5009.5-2016方法测定离心清液中tca可溶性蛋白含量，离心清液中tca可溶性蛋白含量减去游离氨基酸含量可得到样品中小分子肽的含量，即小分子肽含量/(g/100g)＝tca可溶性蛋白质含量/(g/100g)-游离氨基酸含量/(g/100g)。结果见表1。
204.表1
[0205][0206]
由上表可知，本发明实施例1-3制得的缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物含有丰富的蛋白质，其中，氨基酸含量以及小分子肽含量较高。
[0207]
测试例2缓控释试验
[0208]
将1g本发明实施例1-3和对比例7制得的缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物加入到10ml人工模拟胃液和10ml人工模拟肠液中，在37℃、50r/min条件下分别反应2h和3h，另外，取等量的缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物加入到10ml人工模拟胃液中，先置于摇床中，在37℃、50r/min条件下反应2h后，离心，再加入10ml人工模拟肠液继续反应3h。反应结束后进行益生菌群细胞计数。按照以下公式计算存活率：
[0209]
存活率(％)＝n
t
/n0×
100％
[0210]
式中，n
t
为在体外孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g)，n0为添加的益生菌原始浓度(cfu/g)。
[0211]
按照以下公式计算释放率：
[0212]
释放率(％)＝(w
t-w0)/w0×
100％
[0213]
式中，w
t
为样品起始重量(g)；w0为在体外孵育一定时间后重量(g)。
[0214]
结果见表2。
[0215]
表2
[0216][0217]
由上表可知，本发明实施例1-3制得的缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物在人工模拟胃液中保持较好的完整性，转移至人工模拟肠液中后，大量释放活性物质，说明该缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物的包埋结构具有ph响应性和抵抗模拟胃液的特性，在胃酸存在时释放量极少，而进入肠道后，在高ph条件下，大量释放包埋有活性物质的脂化物，具有肠道中靶向输送和控制释放活性组分的效果。
[0218]
测试例3乙醇脱氢酶(adh)激活率的测定
[0219]
将实施例1-7和对比例1-11步骤s6制得的发酵产物，或者对比例12步骤s5制得的发酵物配制成0.5g/ml的水溶液，作为样品溶液。
[0220]
在试管中加入1.5ml的焦磷酸钠缓冲液(ph＝8.8)，1.0ml 0.027mol/l的氧化型辅酶ⅰ(nad
+
)，0.1ml样品溶液和0.5ml体积分数11.5％的乙醇溶液，混匀，25℃保温7min，立即加入0.1ml 0.25u/ml的乙醇脱氢酶(adh)，混匀，测定340nm处的吸光度，双蒸水调零。5min后观察340nm处吸光度的变化以确定生成的还原型辅酶ⅰ(nadh)量。以蒸馏水代替卵白蛋白肽溶液进行空白对照。计算乙醇脱氢酶激活率：
[0221]wadh
＝(a
1-a0)/a0×
100％
[0222]wadh
：adh激活率，％；a1：样品在450nm处的吸光度；a0：对照溶液在450nm处的吸光度。
[0223]
结果见表3。
[0224]
表3
[0225][0226][0227]
由上表可知，本发明实施例1-3制得的发酵产物对乙醇脱氢酶的激活率较高。
[0228]
测试例3抗氧化性能测试
[0229]
将实施例1-7和对比例1-11步骤s6制得的发酵产物，或者对比例12步骤s5制得的发酵物配制成50mg/ml的水溶液，作为样品溶液。
[0230]
1、dpph自由基清除能力的测定：
[0231]
将抗坏血酸配制成50mg/ml的溶液，作为阳性对照。100μl 0.5mmol/l dpph溶液和100μl样品溶液混匀后，37℃避光孵育30min。在517nm处测吸光度，记为a1。超纯水作为空白对照，测吸光度记为a0；用超纯水代替dpph溶液，测吸光度记为a2，按照下式计算：
[0232]
dpph清除率/％＝1-(a
1-a2)/a0×
100％
[0233]
2、abts阳离子自由基清除能力的测定：
[0234]
用0.1mmol/l pbs缓冲溶液配制7mmol/l的abts阳离子自由基溶液和4.9mmol/l的过硫酸钾溶液。将abts阳离子自由基溶液与过硫酸钾溶液等比例混合避光反应14h后，得abts阳离子自由基溶液母液。将抗坏血酸配制成50mg/ml的溶液，作为阳性对照。用0.1mmol/l pbs缓冲液稀释abts阳离子自由基母液20倍，得abts阳离子自由基工作液。20μl的样品溶液与200μl abts阳离子自由基工作液混匀后，在734nm波长处测吸光度，记为a1。用20μl超纯水代替样品测吸光度，记为a0。用0.1mmol/lpbs缓冲溶液代替abts阳离子自由基工作液测吸光度值，记为a2，按照下式计算：
[0235]
abts阳离子自由基清除率/％＝1-(a
1-a2)/a0×
100％
[0236]
结果见表4。
[0237]
表4
[0238]
组别dpph清除率(％)abts阳离子自由基清除率(％)实施例176.761.2实施例277.160.8实施例377.962.4实施例472.458.2实施例573.157.9实施例670.255.9实施例769.856.2对比例171.758.5对比例265.852.2对比例366.752.4对比例467.554.8对比例566.252.3对比例667.153.8对比例766.853.1对比例864.951.8对比例966.752.8对比例1067.053.4对比例1164.851.6对比例1265.252.3
[0239]
由上表可知，本发明实施例1-3制得的发酵产物具有较好的抗氧化性能。
[0240]
测试例4缓解酒精性肝损伤实验
[0241]
取昆明种小鼠，雄性，体重18-22g适应性饲养1周后随机将小鼠分为正常组、模型组、阳性组(联苯双酯150mg/kg)、实施例1-7和对比例1-17组(0.5g/kg相应制得的缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物)，每组6只。正常组和模型组小鼠灌胃等体积蒸馏水，各给药组按相应剂量给药，30min后，除空白组灌胃蒸馏水外，其余各组按11.0ml/kg剂量灌胃56％白酒，每日一次，连续7d。在实验期间若观察到模型组小鼠的毛发变黄、萎靡不振、食欲下降、体重明显减轻，则表明造模成功。禁食不禁水24h，摘眼球取血，放置2h后以，离心，取上层血清于-80℃低温冰箱保存。
[0242]
采用elisa试剂盒检测肝组织中小鼠肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的含量，取200μl血清用全自动生化仪测血清中谷丙转氨酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)活力。按照试剂盒说明书的方法测定肝组织总超氧化物歧化酶(sod)的活力和丙二醛(mda)含量。
[0243]
结果见表5。
[0244]
表5
[0245]
[0246][0247][0248]
注释：*为与正常组相比，p《0.05；#为与模型组相比，p《0.05。
[0249]
由上表可知，本发明实施例1-3制得的缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物能明显降低tnf-α含量，降低alt和ast活力，提高sod活力，降低mda含量，具有较好的缓解酒精
性肝损伤的效果。
[0250]
实施例4、5与实施例3相比，一级复合酶为单一的碱性蛋白酶或胰蛋白酶。对比例4与实施例3相比，步骤s2中未进行一级复合酶酶解。游离氨基酸含量、小分子肽含量下降，乙醇脱氢酶激活率下降，抗氧化性能下降，缓解酒精性肝损伤的效果下降。在碱性蛋白酶和胰蛋白酶的作用下进行一级酶解，初步将大分子的蛋白质酶解成较小的多肽链，对后续酶解有促进作用，两者的添加具有协同增效的作用。
[0251]
实施例6、7与实施例3相比，二级复合酶为单一的中性蛋白酶或木瓜蛋白酶。对比例5与实施例3相比，未进行步骤s3。游离氨基酸含量、小分子肽含量下降，乙醇脱氢酶激活率下降，抗氧化性能下降，缓解酒精性肝损伤的效果下降。在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的协同作用下进行二级酶解，制得小分子量、易吸收的植物、动物混合蛋白肽，具备较好的抗氧化能力，能够清除人体内的自由基，对促乙醇代谢有明显的提高，对肝脏损伤有明显的保护作用，两者具有协同增效的作用。
[0252]
对比例1与实施例3相比，未进行步骤s1。蛋白质含量、游离氨基酸含量、小分子肽含量下降，乙醇脱氢酶激活率下降，缓解酒精性肝损伤的效果下降。葛仙米藻粉中含有丰富的蛋白质，其氨基酸种类丰富，葛仙米蛋白质含量超过45％，共含有17种氨基酸，其中，谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸的含量较为丰富，在冻融处理和溶菌酶的作用下，葛仙米细胞壁破裂，大部分蛋白质溶出，大大提高了葛仙米蛋白质的提取效率。
[0253]
对比例2与实施例3相比，步骤s2中未添加牡蛎肉。对比例3与实施例3相比，步骤s2中未添加鸡蛋蛋清。蛋白质含量、游离氨基酸含量、小分子肽含量下降，乙醇脱氢酶激活率下降，抗氧化性能下降，缓解酒精性肝损伤的效果下降。牡蛎肉中含有较多牛磺酸，其中，具有解酒防醉效果的成分除牛磺酸外还有牡蛎糖原，二者都能有效延长酒精耐受时间并缩短醉酒时间。其中，牛磺酸将乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶活力均能大幅度提高，使血液中乙醇加速代谢，从而显著降低血醇浓度，起到醒酒的作用。鸡蛋蛋白中富含利于促乙醇代谢的氨基酸，对肝脏损伤有明显的保护作用。
[0254]
对比例6、7与实施例3相比，步骤s4中未添加水解小麦蛋白粉或水解大豆蛋白粉。对比例8与实施例3相比，步骤s4中未添加水解小麦蛋白粉和水解大豆蛋白粉。蛋白质含量、游离氨基酸含量、小分子肽含量下降，乙醇脱氢酶激活率下降，抗氧化性能下降，缓解酒精性肝损伤的效果下降。水解大豆蛋白可以使肝脏中甘油三酯的含量降低，对肝脏脂质代谢有促进作用。水解小麦蛋白能通过提高血液中的丙氨酸和亮氨酸含量，使nad
+
稳定存在。两者具有协同增效的作用。
[0255]
对比例9、10与实施例3相比，步骤s5中未接种白参菌或酵母菌。对比例11与实施例3相比，未进行步骤s5，缓解酒精性肝损伤的效果下降。游离氨基酸含量、小分子肽含量下降，乙醇脱氢酶激活率下降，抗氧化性能明显下降。酶解产物与水解小麦蛋白粉、水解大豆蛋白粉混合，经过白参菌、酵母菌发酵，白参菌及其发酵产物对降低高血压、高胆固醇、保护肝脏损伤、增强机体免疫和抑制肿瘤活性力等方面有很大作用。酵母发酵产物具有抗氧化及保肝作用，能有效抑制羟基自由基和抗磷脂氧化，对乙醇诱导的肝损伤均有辅助保护作用。两种菌种的协同发酵产物具有能够清除自由基、提高免疫力、改善血液循环、维持内环境平衡、保肝、健胃、抑制肿瘤等功效。
[0256]
对比例12与实施例3相比，未进行步骤s6。游离氨基酸含量、小分子肽含量下降，乙
醇脱氢酶激活率下降，抗氧化性能下降，缓解酒精性肝损伤的效果下降。本发明在经过白参菌、酵母菌发酵制得的发酵液中进一步接种益生菌(包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌)，在丰富的氮源、碳源的条件下，益生菌快速大量增殖，并且产生大量的有益产物包括短链脂肪酸等，进入肠道后明显他提高肠道丁酸水平，提高肠道有益菌丰度，通过“肠-肝轴”起到很好的正向调节，对肝脏损伤起到明显的保护作用。
[0257]
对比例13、14与实施例3相比，步骤s7中未添加玉米低聚肽或牛磺酸。对比例15与实施例3相比，步骤s7中未添加玉米低聚肽和牛磺酸。游离氨基酸含量、小分子肽含量下降，缓解酒精性肝损伤的效果下降。本发明添加的玉米低聚肽能够很好地促进小鼠体内酒精的代谢，降低小鼠血清谷丙转氨酶活性，对酒精性肝损伤具有很好的防护作用，激活乙醇脱氢酶活力，加速乙醇代谢；且通过提高超氧化物歧化酶活性，减少有害自由基在体内的积累，从而抑制脂质过氧化，降低丙二醛的含量，达到减少肝脏损伤的作用。牛磺酸能够显著降低血浆乙醇浓度并提高乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，具有很好的解酒防醉作用，两者具有协同增效的作用。
[0258]
对比例16与实施例3相比，步骤s7中未添加发酵产物。蛋白质含量、游离氨基酸含量、小分子肽含量明显下降，明显提高了tnf-α含量，明显提高了alt和ast活力，降低sod活力，提高了mda含量。
[0259]
对比例17与实施例3相比，步骤s7中未进行包埋，明显提高了tnf-α含量，明显提高了alt和ast活力，降低sod活力，提高了mda含量。本发明包埋壳层包括海藻酸钠和羧甲基纤维素钠，与金属离子发生配位交联作用形成稳定的结构，将活性组份包裹在微胶囊内部，形成从而形成了缓释结构，进入人体后，不易于在胃部被分解，从而能顺利进入肠道后被降解释放出来，使得大量的益生菌、玉米低聚肽、低聚果糖、牛磺酸等能直接被肠道吸收，低聚果糖是一种有效的益生元，起到高效的提高肠道益生菌菌群的作用
[0260]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物的制备方法，其特征在于，提取葛仙米蛋白，与牡蛎肉、鸡蛋蛋清混合，进行二级酶解，得到酶解产物，与水解小麦蛋白粉、水解大豆蛋白粉、碳源、维生素、无机盐加入水中，制得培养基，接种白参菌、酵母菌发酵后，灭菌，接种植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，发酵增殖，冷冻干燥，制得发酵产物，与玉米低聚肽、低聚果糖、牛磺酸一起包埋于海藻酸钠-羧甲基纤维素钠壳层内，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.葛仙米蛋白的提取：将葛仙米藻粉加入水中，冻融处理，恢复至室温后加入溶菌酶酶解，灭酶，过滤，滤液加入乙醇沉淀，过滤，制得葛仙米蛋白液；s2.一级酶解：将牡蛎肉绞碎，与鸡蛋蛋清、步骤s1制得的葛仙米蛋白液混合，加入一级复合酶酶解，灭酶，得到一级酶解产物；s3.二级酶解：向步骤s2制得的一级酶解产物中加入二级复合酶酶解，灭酶，过滤，冷冻干燥，制得酶解产物；s4.培养基的制备：将步骤s3制得的酶解产物、水解小麦蛋白粉、水解大豆蛋白粉、碳源、维生素、无机盐加入水中，调节ph值，灭菌，制得培养基；s5.发酵：将活化的白参菌、酵母菌菌种种子液接种至步骤s4制得的培养基中，发酵培养，灭菌，过滤，制得发酵液；s6.益生菌发酵：将活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液接种至步骤s5制得的发酵液中，补加碳源，发酵增殖培养，冷冻干燥，制得发酵产物；s7.包埋：将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠溶于水中，加入步骤s6制得的发酵产物、玉米低聚肽、低聚果糖、牛磺酸，搅拌混合均匀，加入食用油，乳化，滴加氯化钙溶液，常温固化，冷冻干燥，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述葛仙米藻粉和水的固液比为1:5-7g/ml，所述冻融处理的方法为置于-25至-20℃冷冻2-3h，室温解冻；所述溶菌酶的加入量为1-2g/l，所述酶解的温度为35-40℃，时间为2-3h，所述加入乙醇至体系乙醇含量为70-80wt％，沉淀5-7h。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述牡蛎肉、鸡蛋蛋清、葛仙米蛋白液、一级复合酶的质量比为5-7:3-5:50-70:0.5-1，所述一级复合酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，质量比为5-7:10，所述酶解温度为38-42℃，时间为2-3h。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述一级酶解产物、二级复合酶的质量比为100:1-1.5，所述二级复合酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，质量比为3-5:2，酶解温度为45-55℃，时间为1-2h。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s4中所述酶解产物、水解小麦蛋白粉、水解大豆蛋白粉、碳源、维生素、无机盐和水的质量比为5-10:3-5:2-4:20-30:1-2:2-3:500，所述碳源选自葡萄糖、糖蜜、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、琼脂中的至少一种，所述维生素选自维生素c、维生素b1、维生素b2、维生素a、维生素k、维生素b12、维生素d1、维生素e、叶酸、维生素d3中的至少一种，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的至少一种；所述调节ph值为6.7-7.2。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s5中所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的制备方法为分别将白参菌、酵母菌接种至高氏培养基中，37-40℃，50-70r/min，微缺氧条件下，活化培养12-16h，制得含菌量为10
8-109cfu/ml的菌种种子液，所述活化的白参菌、酵母菌菌种种子液的接种量分别为2-3％和1-2％，所述发酵培养的条件为37-40℃，50-70r/min，发酵培养36-48h。8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s6中所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的制备方法为分别将植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌接种至高氏培养基中，37-40℃，50-70r/min，活化培养12-16h，制得含菌量为10
8-109cfu/ml的菌种种子液；所述活化的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌种种子液的接种量分别为1.5-2％和1-2％，所述发酵增殖培养的条件为36-38℃，50-70r/min，微缺氧条件下，发酵培养36-48h，所述微缺氧条件为二氧化碳的含量为3-5v/v％，氧气含量4-6v/v％，余量为氮气；所述补加的碳源的量为20-50g/l，所述碳源选自葡萄糖、糖蜜、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、琼脂中的至少一种。9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s7中所述海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、水、发酵产物、玉米低聚肽、低聚果糖、牛磺酸的质量比为5-7:7-10:100:12-15:3-5:2-3:1-2，所述食用油选自花生油、玉米油、大豆油、菜籽油、鱼油、葵花籽油、芝麻油、亚麻籽油、橄榄油中的至少一种；所述乳化的条件为12000-15000r/min乳化4-7min，所述氯化钙溶液的浓度为1-2wt％；所述常温固化的时间为30-50min。10.一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。

技术总结
本发明提出了一种缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物及其制备方法，属于蛋白肽技术领域，包括：提取葛仙米蛋白，与牡蛎肉、鸡蛋蛋清混合，进行二级酶解，得到酶解产物，与水解小麦蛋白粉、水解大豆蛋白粉、碳源、维生素、无机盐加入水中，制得培养基，接种白参菌、酵母菌发酵后，灭菌，接种植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，发酵增殖，冷冻干燥，制得发酵产物，与玉米低聚肽、低聚果糖、牛磺酸一起包埋于海藻酸钠-羧甲基纤维素钠壳层内，制得缓解急性酒精性肝损伤的蛋白肽组合物。本发明组合物含有丰富的小肽物质，能耗低、吸收快、吸收率高、载体不易饱和，对血清中乙醇浓度的升高产生更好的抑制作用，具有解酒护肝的的明显效果。具有解酒护肝的的明显效果。


技术研发人员：李昱锟 周友浪
受保护的技术使用者：江苏恰瑞生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.17
技术公布日：2023/7/28