一种与奶牛乳成分性状相关基因KLF6的SNP分子标记及其应用的制作方法

一种与奶牛乳成分性状相关基因klf6的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物技术领域中一种与奶牛乳成分性状相关基因klf6的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.klf6基因位于牛13号染色体上，有2个外显子，基因全长8460bp，是一种广泛表达的锌指转录因子，在细胞分化、增殖和肌肉发育等多个生命进程调控中起着重要作用。该基因有三个转录本，mrna长度分别为5639bp、4310bp和3842bp，分别编码309、280和267个氨基酸(ars-ucd1.2)，参与了脂肪生成、芳基碳氢化合物受体和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,tgf-β)信号通路。有研究表明，klf6基因可促进脂肪细胞分化；在肝脏上，有研究表明其可通过活化pparα信号通路而引起肝脏非酒精性脂肪肝生成。klf6属于特异性蛋白/kr
ü
ppel样因子(sp/klf)转录因子家族，可激活或抑制与调控不同细胞和生物过程有关的各种基因，如血管重塑、细胞分化、增殖和凋亡、组织发育和生长。klf6全敲除或肝细胞特异性缺失的小鼠体内脂肪含量降低，糖耐量和胰岛素耐受性增强，并可免受高脂饮食所导致的脂肪变性的影响。在肝细胞中，klf6的缺失使pparα的调控基因(trb3，pepck)减少，pparα的蛋白表达减少，而pparα的m rna无变化，这是因为klf6抑制mirna-10b的表达水平，进一步调控pparα表达水平。
3.研究表明，klf6蛋白的生长抑制功能通过转录激活细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂与细胞周期控制有关。klf6通过编码一种跨膜蛋白来抑制脂肪的形成，同时也扮演着delta-like 1(dlk1)的转录抑制剂的角色，dlk1是脂肪生成的关键调节因子，编码一种跨膜蛋白，抑制脂肪细胞的分化，它在脂肪细胞发育的分化阶段发挥作用，直接刺激肝脏葡萄糖激酶，调节肝脏胰岛素敏感性。klf6在多种组织中高度表达，它通过招募到pparγ启动子区域进行干扰，在前脂肪细胞向脂肪细胞的分化中发挥关键作用，它通过pparα激活调节基因，pparα是一种异生物和脂质传感器，调节肝脏脂肪变性、脂蛋白合成、肝脏糖元生成和脂肪酸转运蛋白。
4.dna的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链dna在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在dna聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，dna在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制dna的变性和复性，加入设计引物，dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的体外复制。聚合酶链式反应(pcr)技术是一种特异性dna体外扩增技术。目前，该技术已经成为最常用、也最重要的分子生物学技术之一。pcr产物经过琼脂糖凝胶电泳后测序即可进行基因多态的鉴定工作，检测方法简单易行。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定奶牛的乳成分性状或如何进
行奶牛育种。
6.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种应用，所述应用为下述p1或p2：
7.所述p1为检测所述snp1的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状中的应用；
8.所述p2为检测所述snp2的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状中的应用；
9.所述snp1是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第88位核苷酸，其为g或a；所述snp2是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第341位核苷酸，其为g或a。
10.上述snp1和snp2两个单核苷酸多态性位点位于奶牛基因组第13号染色体上的klf6基因中，所述klf6基因位于奶牛第13号染色体第44,597,240-44,605,699位，与奶牛乳成分性状相关，其核苷酸序列为序列表中seq id no.1所示dna分子。
11.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种应用，所述应用为q1或q2：
12.所述q1为检测所述snp1的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状产品中的应用；
13.所述q2为检测所述snp2的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状产品中的应用；
14.所述snp1是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第88位核苷酸，其为g或a；所述snp2是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第341位核苷酸，其为g或a。
15.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种应用，所述应用为e1或e2：
16.所述e1为检测所述snp1的多态性或基因型的物质在奶牛育种或制备奶牛育种产品中的应用；
17.所述e2为检测所述snp2的多态性或基因型的物质在奶牛育种或制备奶牛育种产品中的应用；
18.所述snp1是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第88位核苷酸，其为g或a；所述snp2是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第341位核苷酸，其为g或a。
19.所述奶牛乳成分可为产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率中的任一和/或多种的组合。
20.所述snp1的基因型(即等位基因)可为基因型aa、基因型gg或基因型ag，基因型aa是snp1为a的纯合型，基因型gg是snp1为g的纯合型，基因型ag是snp1为a和g的杂合型；所述snp2的基因型(即等位基因)可为基因型aa、基因型gg或基因型ag，基因型aa是snp1为a的纯合型，基因型gg是snp1为g的纯合型，基因型ag是snp1为a和g的杂合型。
21.为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品，所述产品含有上述检测奶牛基因组snp1多态性或基因型的物质或含有上述检测奶牛基因组snp2多态性或基因型的物质，且可为下述g1)-g3)中的任一种：
22.g1)检测奶牛乳成分性状相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
23.g2)鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状的产品；
24.g3)用于奶牛育种的产品。
25.为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状的方法，包括检测待测奶牛上述snp1的基因型，根据所述待测奶牛的所述snp1的基因型鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状：所述snp1的基因型为aa或ag的奶牛的乳成分性状高于或候选高于基因型为gg的奶牛；所述aa是snp1为a的纯合型；所述gg是snp1为g的纯合型；所述ag是snp1为a和g的杂合型。
26.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状的方法，包括检测待测奶牛上述snp2的基因型，根据所述待测奶牛的所述snp2的基因型鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状：所述snp2的基因型为gg或ag的奶牛的乳成分性状高于或候选高于基因型为aa的奶牛；所述aa是snp1为a的纯合型；所述gg是snp1为g的纯合型；所述ag是snp1为a和g的杂合型。
27.本发明还提供了一种奶牛育种的方法，包括选择snp1的基因型为aa的奶牛作为亲本进行育种；所述snp1是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第88位核苷酸，其为g或a；所述aa为所述snp1为a的纯合型。
28.本发明还提供了一种奶牛育种的方法，包括选择snp2的基因型为gg的奶牛作为亲本进行育种；所述snp2是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第341位核苷酸，其为g或a；所述gg为所述snp1为g的纯合型
29.上文所述奶牛育种为培育高乳成分的奶牛品种。
30.上文所述乳成分具体可为乳成分量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和/或乳蛋白率。
31.上述应用、方法中，所述检测snp1多态性或基因型性的物质，或所述检测snp2多态性或基因型性的物质，可为通过下述至少一种方法确定上述奶牛基因组中snp1和/或snp2位点的核苷酸种类：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片，及基于荧光分子dna结合反应的芯片。
32.上述应用或方法中，所述检测snp1多态性或基因型性的物质，或所述检测snp2多态性或基因型性的物质，可为如下d1)、d2)或d3):
33.d1)含有扩增包括所述snp1和/或snp2位点在内的奶牛基因组dna片段的pcr引物；
34.d2)含有d1)所述pcr引物的pcr试剂；
35.d3)含有d1)所述pcr引物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。
36.上述pcr引物为由序列表中seq id no.1的第32-50位所示的单链dna和与seq id no.1的第689-708位反向互补的单链dna组成的引物组。
37.上述应用和方法中，所述pcr引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如
32
p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负
电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
38.上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由pcr引物、parms master mix试剂、酶标仪和在线软件snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由pcr引物、parms master mix试剂、在线软件snp decoder和荧光定量pcr仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测奶牛基因组中snp1和/或snp2位点的多态性或基因型的物质。
39.本发明的实施例中，通过对奶牛关联群体中klf6基因的遗传变异分析，发现2个snp，snp1和snp2位于奶牛基因组中与乳成分性状相关的基因klf6基因中，即序列表seq id no.1的第88位和第341位。在本发明的实施例中snp1位点的优势等位基因为a，snp2位点的优势等位基因为g，说明snp1位点和/或snp2位点可用于奶牛分子标记辅助选择育种和高乳成分性状奶牛品种的选育。
附图说明
40.图1为图1为g.44595327a》g和g.44595580g》a的突变位置。
具体实施方式
41.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
42.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
43.下述实施例中的中国荷斯坦母牛来自河北省畜牧良种工作总站。
44.实施例中的产奶量为个体305天产奶量，指自母牛产犊第一天开始到第305天为止的产奶总量。当实际挤奶天数不足305天时，以实际产奶量作为305天产奶量；当实际挤奶天数超出305天，306天以后的产奶量不计在内。产奶量由每月dhi(dhi，dairy herd improvement)测定所得，通过同一泌乳期内3次以上dhi数据绘制产奶量泌乳曲线计算可得该泌乳期305天产奶量。
45.实施例中的乳脂量指的是305天乳脂量，305天乳脂量＝乳脂率
×
305天产奶量。乳脂率由每月dhi(dhi，dairy herd improvement)测定所得，通过同一泌乳期内3次以上dhi数据绘制乳脂率泌乳曲线计算可得该泌乳期平均乳脂率。
46.实施例中的乳蛋白量指的是305天乳蛋白量，305天乳蛋白量＝乳蛋白率
×
305天产奶量。乳蛋白率由每月dhi(dhi，dairy herd improvement)测定所得，通过同一泌乳期内3次以上dhi数据绘制乳蛋白率泌乳曲线计算可得该泌乳期平均乳蛋白率。
47.泌乳期1指的是第一次分娩后的泌乳期。泌乳期2指的是第二次分娩后的泌乳期。
48.如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
49.实施例1、分子标记的发现
50.一、相关基础研究
51.发明人所在课题组以3头中国荷斯坦牛不同泌乳阶段(干奶期、泌乳初期、泌乳高峰期)的肝脏组织为试验材料，利用二代测序技术进行转录组测序(rna-sequencing，rna-seq)和小rna测序(small rna sequencing，small rna-seq)。发现与干奶期相比，klf6基因在泌乳初期和泌乳高峰期显著差异表达(p《0.01)。
52.二、基因多态性检测
53.1、选择河北地区共111头中国荷斯坦牛母牛作为基因多态性检测的试验群体。将111头中国荷斯坦母牛随机分为5组(一组23头，其余4组为22头)，提取血液样品的基因组dna，利用核酸质量检测仪准确测定dna的浓度，并将这些dna均稀释成浓度为50ng/μl，等量混合成5个池dna，作为模板进行pcr扩增。
54.2、根据牛klf6基因序列如seq id no.1所示(ensembl id为ensbtag00000015188，转录本id为ensbtat00000087087.1)，设计如表1的18对引物。
55.表1klf6基因pcr扩增引物序列信息
[0056][0057][0058]
3、以步骤1得到的池dna为模板，分别采用各引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产
物。pcr反应体系见表2，pcr反应条件见表3。
[0059]
表2 pcr反应体系
[0060][0061]
表3 pcr反应条件
[0062][0063]
4、将pcr扩增产物进行测序。结果发现，母牛群体klf6基因在上游2000bp的侧翼序列中存在2个snp标记(分别称为snp1和snp2)。2个snp标记见表4，突变位置如图1所示。
[0064]
表4 klf6基因发现的2个snps
[0065]
基因位置名称snps物理位置多态形式5'调控区snp1g.44595327a》gchr13:44595327bpa/g5'调控区snp2g.44595580g》achr13:44595580bpg/a
[0066]
其中，snp1对应于g.44595327a》g，是采用1f和1r组成的引物对进行pcr扩增得到的产物进行测序分析获得的(该pcr扩增产物如seq id no.1的第32-708位所示)，其核苷酸为a或g，对应序列表中seq id no.1自5’末端起第88位。snp2对应于g.44595580g》a，是采用1f和1r组成的引物对进行pcr扩增得到的产物进行测序分析获得的(该pcr扩增产物如seq id no.1的第32-708位所示)，其核苷酸为g或a，对应序列表中seq id no.1自5’末端起第341位。序列表中seq id no.1的r表示a或g。
[0067]
三、关联分析
[0068]
(一)、获得供试群体
[0069]
供试群体由1123头中国荷斯坦牛母牛组成。
[0070]
(二)、进行基因型分型
[0071]
供试群体中的每个个体，分别进行基因型分型。
[0072]
i、基于g.44595327a》g的基因型分型。
[0073]
1、取供试个体的血液，提取基因组dna。
[0074]
2、以基因组dna为模板，采用1f(如seq id no.1的第32-50位所示)和1r(与seq id no.1的第689-708位反向互补)组成的引物对进行pcr扩增，然后回收pcr扩增产物并进行测序。
[0075]
pcr扩增的反应体系见表5。pcr扩增的反应条件见表6。
[0076]
各个供试个体的pcr扩增产物均为677bp，其中第57位为g.44595327a》g，即snp1(对应序列表中seq id no.1自5’末端起第88位)。
[0077]
表5
[0078][0079]
表6
[0080][0081]
ii、基于g.44595580g》a的基因型分型。
[0082]
1、取供试个体的血液，提取基因组dna。
[0083]
2、以基因组dna为模板，采用1f(如seq id no.1的第32-50位所示)和1r(与seq id no.1的第689-708位反向互补)组成的引物对进行pcr扩增，然后回收pcr扩增产物并进行测序。
[0084]
pcr扩增的反应体系见表7。pcr扩增的反应条件见表8。
[0085]
各个供试个体的pcr扩增产物均为677bp，其中第310位为g.44595580g》a，即snp2(对应序列表中seq id no.1自5’末端起第341位)。
[0086]
表7
[0087][0088]
表8
[0089][0090]
(三)、检测产奶性状
[0091]
供试群体中的每头牛，分别进行产奶性状性状检测。
[0092]
产奶性状包括如下五个指标：产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率。
[0093]
每个个体的记录依次包括牛只个体号、父号、母号、祖父号、祖母号、外祖父号、外祖母号、出生日期、泌乳期、产犊日期、产奶量、乳脂量和乳蛋白量。
[0094]
(四)、单个snp位点与性状的关联分析模型
[0095]
snp1位点(即klf6基因g.44595327a》g)和snp2位点(即klf6基因g.44595580g》a)的基因型与产奶性状表型如表9、表10和表11所示。
[0096]
表9 1123头中国荷斯坦牛母牛(部分)的产奶性状表型和2个snp位点的基因型
[0097]
[0098]
[0099][0100]
表10 1123头中国荷斯坦牛母牛群体的5个产奶性状表型值描述性统计
[0101]
性状平均值标准差最小值最大值变异系数产奶量(kg)8140.13081467.724112536.43753721.48010.1803乳脂量(kg)304.084772.2922562.432298.56940.2377乳脂率(％)3.76790.76156.97002.00000.2021乳蛋白量(kg)257.060346.0290398.1886114.16250.1791乳蛋白率(％)3.16910.25914.01002.34000.0817
[0102]
表11 klf6基因2个snp位点的等位基因频率、基因型频率
[0103]
[0104][0105]
snp1位点有3种基因型(简称snp2基因型)，即gg、aa或ga，基因型gg是snp1为g的纯合型，基因型aa是snp1为a的纯合型，基因型ga是snp1为g和a的杂合型；snp2位点有3种基因型(简称snp2基因型)，即gg、aa或ga，基因型gg是snp1为g的纯合型，基因型aa是snp1为a的纯合型，基因型ga是snp1为g和a的杂合型。
[0106]
采用sas 9.2软件中的mixed过程对产奶性状的五个指标和基因型进行关联分析。关联分析采用动物模型，具体模型如下：
[0107]
y＝μ+hys+b
×
m+g+a+e
[0108]
其中，y：产奶性状(产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)观察值；μ：总体均值；hys：场年季效应；b：协变量m的回归系数；m：产犊月龄效应；g：基因型效应；a：个体随机加性遗传效应；e：随机残差效应。
[0109]
snp1位点(即klf6基因g.44595327a》g)与产奶性状关联分析结果见表12。泌乳期1产奶的奶牛头数是1117头，泌乳期2产奶的奶牛头数是614头。
[0110]
表12 klf6基因g.44595327a》g与产奶性状关联分析(最小二乘均值
±
标准误)
[0111][0112]
注：
*
p《0.05，表示差异显著；
**
p《0.01，表示差异极显著。
a,b
同一列数据有不同上标表示差异显著；
a,b
同一列数据有不同上标表示差异极显著。
[0113]
snp2位点(即klf6基因g.44595580g》a)与产奶性状关联分析结果见表13。泌乳期1产奶的奶牛头数是1117头，泌乳期2产奶的奶牛头数是614头。
[0114]
表13 klf6基因g.44595580g》a与产奶性状关联分析(最小二乘均值
±
标准误)
[0115][0116]
注：
*
p《0.05，表示差异显著；
**
p《0.01，表示差异极显著。
a,b
同一列数据有不同上标表示差异显著；
a,b
同一列数据有不同上标表示差异极显著。
[0117]
由表12-13所得，在第一泌乳期时，两个snp与乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率达到极显著关联水平(p＝0.0155～p＝0.0001)。
[0118]
在第二泌乳期时，这2个snp位点均与乳脂量和乳脂率达到极显著关联水平(p＝0.0002至p＝0.0001)。
[0119]
对于snp1，即klf6基因g.44595327a》g，aa基因型母牛的乳脂量高于gg基因型母牛，ag基因型母牛的乳脂量高于gg基因型母牛，aa基因型母牛的乳脂量与ag基因型母牛无显著差异。所述乳脂量为泌乳期1的乳脂量。
[0120]
对于snp1，即klf6基因g.44595327a》g，aa基因型母牛的乳脂率高于ag基因型母牛并且aa基因型母牛的乳脂率显著高于gg基因型母牛。所述乳脂率为泌乳期1的乳脂率。
[0121]
对于snp1，即klf6基因g.44595327a》g，aa基因型母牛的乳蛋白量高于ag基因型母牛并且aa基因型母牛的乳蛋白量极显著高于gg基因型母牛。所述乳蛋白量为泌乳期1的乳蛋白量。
[0122]
对于snp1，即klf6基因g.44595327a》g，aa基因型母牛的乳蛋白率极显著高于ag基因型母牛并且aa基因型母牛的乳蛋白率极显著高于gg基因型母牛。所述乳蛋白率为泌乳期1的乳蛋白率。
[0123]
对于snp1，即klf6基因g.44595327a》g，aa基因型母牛的产奶量高于gg基因型母牛，aa基因型母牛的产奶量高于ag基因型母牛。所述产奶量为泌乳期2的产奶量。
[0124]
对于snp1，即klf6基因g.44595327a》g，aa基因型母牛的乳脂量高于ag基因型母牛，aa基因型母牛的乳脂量高于gg基因型母牛，ag基因型母牛的乳脂量与gg基因型母牛无显著差异。所述乳脂量为泌乳期2的乳脂量。
[0125]
对于snp1，即klf6基因g.44595327a》g，aa基因型母牛的乳脂率高于ag基因型母牛并且aa基因型母牛的乳脂率高于gg基因型母牛，ag基因型母牛的乳脂率高于gg基因型母牛。所述乳脂率为泌乳期2的乳脂率。
[0126]
对于snp1，即klf6基因g.44595327a》g，aa基因型母牛的乳蛋白量高于gg基因型母牛，aa基因型母牛的乳蛋白量高于ag基因型母牛,gg基因型母牛的乳蛋白量与ag基因型母牛无显著差异。所述乳蛋白量为泌乳期2的乳蛋白量。
[0127]
对于snp2，即klf6基因g.44595580g》a，gg基因型母牛的乳脂量高于aa基因型母
牛，ag基因型母牛的乳脂量高于aa基因型母牛，gg基因型母牛的乳脂量与ag基因型母牛无显著差异。所述乳脂量为泌乳期1的乳脂量。
[0128]
对于snp2，即klf6基因g.44595580g》a，gg基因型母牛的乳脂率高于aa基因型母牛。所述乳脂率为泌乳期1的乳脂率。
[0129]
对于snp2，即klf6基因g.44595580g》a，gg基因型母牛的乳蛋白量高于aa基因型母牛并且ag基因型母牛的乳蛋白量高于aa基因型母牛。所述乳蛋白量为泌乳期1的乳蛋白量。
[0130]
对于snp2，即klf6基因g.44595580g》a，gg基因型母牛的乳蛋白率高于aa基因型母牛并且gg基因型母牛的乳蛋白率高于ag基因型母牛。所述乳蛋白率为泌乳期1的乳蛋白率。
[0131]
对于snp2，即klf6基因g.44595580g》a，gg基因型母牛的产奶量高于aa基因型母牛并且gg基因型母牛的产奶量高于ag基因型母牛。所述产奶量为泌乳期2的产奶量。
[0132]
对于snp2，即klf6基因g.44595580g》a，gg基因型母牛的乳脂量高于ag基因型母牛，gg基因型母牛的乳脂量高于aa基因型母牛，ag基因型母牛的乳脂量与aa基因型母牛无显著差异。所述乳脂量为泌乳期2的乳脂量。
[0133]
对于snp2，即klf6基因g.44595580g》a，gg基因型母牛的乳脂率高于aa基因型母牛，gg基因型母牛的乳脂率高于ag基因型母牛。所述乳脂率为泌乳期2的乳脂率。
[0134]
对于snp2，即klf6基因g.44595580g》a，gg基因型母牛的乳蛋白量高于ag基因型母牛并且gg基因型母牛的乳蛋白量高于aa基因型母牛。所述乳蛋白量为泌乳期2的乳蛋白量。
[0135]
(五)、遗传效应分析
[0136]
利用sas 9.2软件进行snp加性效应、显性效应及替代效应显著性检验。
[0137]
基本计算公式如下：
[0138]
a＝(aa-bb)/2，d＝ab-(aa+bb)/2，α＝a+d(q-p)；a为加性效应，d为显性效应，α为等位基因替代效应；aa、ab、bb为相应基因型产奶性状最小二乘均值；p为等位基因a的频率，q为等位基因b的频率。
[0139]
加性效应、显性效应和等位基因替代效应检验结果如表14所示。
[0140]
表14klf6基因等位基因加性效应、显性效应和替代效应检验结果
[0141][0142]
注：
*
p《0.05，表示差异显著；
**
p《0.01，表示差异极显著。
[0143]
对于第一泌乳期数据：2个snp位点的加性效应、等位基因显性效应和等位基因替代效应主要体现在乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率性状上，以snp1(g.44595327a》g)
位点为例，对乳脂量的等位基因加性效应和等位基因替代效应、乳脂率的等位基因加性效应和等位基因替代效应，乳蛋白量的加性效应和等位基因替代效应和乳蛋白率的加性效应和等位基因替代效应达到显著或极显著，即每个g等位基因替代a等位基因会导致乳脂量增加4.685kg(p＜0.01)、乳脂率增加0.044％(p＜0.01)、乳蛋白量增加3.934kg(p＜0.01)和乳蛋白率增加0.022％(p＜0.01)。
[0144]
对于第二泌乳期数据：2个snp位点的加性效应、等位基因显性效应和等位基因替代效应主要体现在乳脂量、乳脂率和乳蛋白量性状上，以snp2(g.44595580g》a)位点为例，对乳脂量的等位基因加性效应和等位基因替代效应、乳脂率的等位基因加性效应和等位基因替代效应和乳蛋白量的等位基因加性效应和等位基因替代效应达到显著或极显著，即每个a等位基因替代g等位基因会导致乳脂量减少13.041kg(p＜0.01)、乳脂率减少0.069％(p＜0.01)、乳蛋白量减少5.104kg(p＜0.01)。
[0145]
本发明公开的分子标记可以应用于辅助鉴定具有优良乳成分性状(乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率)的奶牛群体，具有如下优点：简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，适合实验室大群体规模检测的需要。
[0146]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
[0147]
序列表
[0148]
seq id no.1
[0149]
ggtgggcacaacctgaagctggttcaaggcaagccagtcccaatccatgtcttctctctggagggccagtcatgacactgtttccagratagaggaccactgaacacaagccagtgatcattgtaatcagctcaccatgaatcatctttatagactttttaatacaatagatacaataagataatatccttccctaacttttgattgacaaaggtccctgcctagaatcttacagggtcataggcaaactcaagtctgctaaaatctaacatacaaaatcctctcaaaagtcttttacatacttcattaaaaaatttttatttaaaagatgtctcattaarctctattttgaaataaaaatggaggtagtagctataattcagttttccatttcgaattttaaaaggcatattcttcttggtcttggcattttgctagaaaatgaacattatggtgtatttcaggagataattcatatagcaaaacacacacacacacattaaatgtcagctcaacgtaacttgaattgttttcacattcactagggacaagtctagttgttaatcttcgtgagggtctccaaatgggtcttggaatgagggctgctctgtggtaggcaacaagtacaatgacaattgtctatatggtaggcaacaagtacaaggacagtgtctagaacccccatttcccagacttcagtggcaacagattcatctggagagcttggttaaacaacggctgggactctgtaggtttgggatcagaccctgggtttgtaaaatatacacagctggtgtggatggggaaccctaccaagataggttataggctccctctatttataaccccacctgccccaacaagatgtcctcttttcaaaaataaaagtgtgtttgatagaatcaagagtgtacataagcctctcaagagccaggagattgaacttgggtcttccaggccactctgctcttgcaggttacgaaggcagaggggtgaggatgtggcacagacgtggtccccgagttaagtgccctgtccttgtgaaggaggctgaagggggaaactcagattcatatacaacacagcccgtcgactagggccctcctgtccctcagcacacctctggggctggtcagccccctaccccggggtcacaggtgccacctggggacagagggggatggaacagggagggaaggggacacagcgcgcggggcgggggggggggggggtgcaaatggaaacagggcaggtacagagggataacggagcgaaaaggagggg
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[0150]
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[0151]
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[0152]
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[0153]
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[0154]
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[0155]
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[0156]
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[0157]
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[0158]
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[0159]
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[0160]
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[0161]
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[0162]
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[0163]
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[0164]
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[0165]
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[0166]
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[0167]
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[0168]
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[0169]
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[0170]
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[0171]
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[0172]
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[0173]
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[0174]
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[0175]
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[0176]
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[0177]
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[0178]
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[0179]
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[0180]
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[0181]
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[0182]
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[0183]
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[0184]
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[0186]
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[0187]
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[0188]
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[0189]
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[0190]
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[0191]
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[0192]
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[0193]
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[0194]
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[0195]
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[0196]
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[0197]
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[0198]
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[0199]
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[0200]
gtaaaagctcatataactggtttttttttttttttttttttaaatctgggctgatggatacacttacgtaaagaaattattttgctgagggggaaaatgcacttttttcttttggcagt
[0201]
tccaaatccagacacttgatttgctggattttgggggaaaaaaactccttttttggccctgctgtgtgcttagccataacagttccattaagcaagaaggtaaacaaaaga
[0202]
caaaaaataaaaaacttgcactggcttgtctcacttatgaaacaccgtggagtggtttgattgggtggggctgggtgccatgtatgtcaatgcctgtaattttcataataa
[0203]
gcaagtacataaagaattacaattctgttcaggtgataactgagcctcaatcaagcagaaactttttgcttgacattaaaagaaaatttctattagtgaaatttctttctttttat
[0204]
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[0205]
ggaataacataaaagaattcttatcagcatcttgagtctggctgtttttgtgggggggtggggggtggaggtggagggagggagtgttgaaataaattcctgccagat
[0206]
taatcactgggctcctccttgggaaatcttccttatgcaaccccagcagccacttgcctgtctccctcccactcaccgtcctggcagcaaaggtggaaataggagcct
[0207]
ggggttggtcccctgatgcgcactgggttctcctccagggcctggccactaggctttggggcccaggaggaaactggctgtgctttcgctgtcactccagcctggga
[0208]
ataaactgcagaggcatccgaggaacgtggaacaagcacctcctgttcacttccgatgttcctggggacctgttcaaggtcacatgctcctgggcacctgttaccaaggccgtcagagctgggggccacctccaacctggcctgaacacctggctgggttgtcacccaagagggcggacacagtggggacagcaggccccagaaccatccctctggccttcaggacaccctcccttacctctcctcccccaccaccaccttctctggtcagaccagcaaaatagggcaggaggtgaaagattagttacctgatcgcccaatttttttttttccccttaaggcagatgggattcattcaatgtaaattttttttttgaaaatagggtagcttttggttttctagaaacgtttcccagcgtgagatcatagtcctgctgtgtgatgagtggcaaacgagtttgtgttcagatcatattaagctccttagtgggaacagggtagaactggtatgtgcctgctggagggggcagtgggatggtggaaatttctgagagactgagcttcttaagctcgttcttaatttaaggaagttctctagatgttgctggaagggctccctgtgtctgtagcggttctggttctacattttgcctcgtgagcagggtttacacgagctgccttttaatttgataattgaggaggagaagctgaagtgcgtccccagattaggaatgttaagtaattttctttctagaactgcggtaaaaatatcagccattcgaaaggagtgtggtgtgggagggtgaaggaagcagatgcagtttttgccaggactcttgggtgtgttgtgttcaaagcacatgtcaggatgactaatagttggattgccccgactgtagcgctaaataaaggcttgataatgcattctcggctactagtgagacttgaccactttgtcatgcgaggactatgccgaacagcccagttatgttcaaataaggctgctaggagaactgccatgcaaggaatcagctgtaaacccaggatatttatagaaggacaaaaattttcactctacttaacagaagtgttgaaacctagctaaaagaaaagatctgttctgtgtgcttttggacaatttgctgagccacactggacctcagctttcttattgctgaaatattttgggcttggtcacatgtatctagcattttgtagagcactgcaattctgtggtctgtgagtatagggtggacttcaaattacatgtccaccctcctcggaatgctccgctcagatctagaaagttctctcatgccacagtagacggtattgttgagaaaattgctctgacttagaa

技术特征：
1.应用，其特征在于：所述应用为下述p1或p2：所述p1为检测所述snp1的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状中的应用；所述p2为检测所述snp2的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状中的应用；所述snp1是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第88位核苷酸，其为g或a；所述snp2是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第341位核苷酸，其为g或a。2.应用，其特征在于：所述应用为q1或q2：所述q1为检测所述snp1的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状产品中的应用；所述q2为检测所述snp2的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状产品中的应用；所述snp1是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第88位核苷酸，其为g或a；所述snp2是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第341位核苷酸，其为g或a。3.应用，其特征在于：所述应用为e1或e2：所述e1为检测所述snp1的多态性或基因型的物质在奶牛育种或制备奶牛育种产品中的应用；所述e2为检测所述snp2的多态性或基因型的物质在奶牛育种或制备奶牛育种产品中的应用；所述snp1是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第88位核苷酸，其为g或a；所述snp2是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第341位核苷酸，其为g或a。4.产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1中所述检测奶牛基因组snp1多态性或基因型的物质或含有权利要求1中所述检测奶牛基因组snp2多态性或基因型的物质，且可为下述g1)-g3)中的任一种：g1)检测奶牛乳成分性状相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；g2)鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状的产品；g3)用于奶牛育种的产品。5.奶牛育种的方法，其特征在于：所述方法包括选择snp1的基因型为aa的奶牛作为亲本进行育种；所述snp1是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第88位核苷酸，其为g或a；所述aa为所述snp1为a的纯合型。6.奶牛育种的方法，其特征在于：所述方法包括选择snp2的基因型为gg的奶牛作为亲本进行育种；所述snp2是奶牛基因组的一个snp，为序列表中seq id no.1的第341位核苷酸，其为g或a；所述gg为所述snp1为g的纯合型。7.根据权利要求1-3任一权利要求所述的应用、权利要求4所述的产品、或权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述奶牛育种为培育高乳成分性状奶牛或选育乳成分性状高的奶牛品种。
8.根据权利要求1-3任一权利要求所述的应用、权利要求4所述的产品、或权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述检测snp1和snp2这两个snp的多态性或基因型的物质，或所述检测单倍型的物质，或检测snp1多态性或基因型性的物质，或检测snp2多态性或基因型性的物质，为如下d1)、d2)或d3)：d1)含有扩增包括所述snp1和/或snp2位点在内的奶牛基因组dna片段的pcr引物；d2)含有d1)所述pcr引物的pcr试剂；d3)含有d1)所述pcr引物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。9.根据权利要求8所述的应用或产品或方法，其特征在于：所述pcr引物为由序列表中seq id no.1的第32-50位所示的单链dna和与seq id no.1的第689-708位反向互补的单链dna组成的引物组。10.根据权利要求8或9所述的应用或产品或方法，其特征在于：所述奶牛为中国荷斯坦牛。

技术总结
本发明公开了一种与奶牛乳成分性状相关基因KLF6的SNP分子标记的应用。本发明所要保护的一个技术方案是检测SNP1和SNP2这两个SNP的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛乳成分性状中的应用。实验证明SNP1和/或SNP2的相关分子标记，及相应单倍型和基因型可用于奶牛乳成分性状的早期预测和筛选，有助于进行高乳成分性状奶牛品种的选育。进行高乳成分性状奶牛品种的选育。进行高乳成分性状奶牛品种的选育。


技术研发人员：孙东晓 倪俊卿 刘亚楠 韩博 宋雨 杨晨东 蒋桂娥 李建明 马亚宾
受保护的技术使用者：河北省畜牧良种工作总站（河北省种畜禽质量监测站）
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/7/28