一种基于碳量子点基因传递平台的植物花色调控方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于碳量子点基因传递平台的植物花色调控方法。


背景技术：

2.花色是观赏植物育种中最为重要的特征之一。虽然生物技术为植物育种者提供了额外的工具来改善园艺作物的种植者和消费者所需的各种特性，但是传统的遗传转化方法(比如农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法)却存在着转化效率低、基因稳定性差、操作复杂、成本高等缺点。此外，病毒介导的基因沉默(vigs)需要通过构建病毒载体才能实现，不仅存在一定的风险，而且操作难度大，稍有不慎便会对植物生长和发育造成负面影响。因此，我们需要一种更为高效、安全、简便、低成本的方法来实现花色调控。
3.查尔酮异构酶(chi)是催化查尔酮转化为柚皮素所必需的，而柚皮素是花青素生物合成所必需的。因此，chi酶是花色素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达量的改变可能影响花的颜色。目前，rnai已成为一种针对特定基因序列实现表达水平催化抑制的广泛研究技术。在rnai技术中，外源小干扰rna(sirna)可被输送至植物细胞质中，以发挥其作用。然而，相较于哺乳动物细胞，植物细胞具有支撑结构的纤维素细胞壁。该细胞壁在围绕细胞膜的同时，还能够提供保护作用，并限制非生物分子递送方法(如电穿孔、热休克、阳离子脂质和带正电荷的聚合物)对植物进行转化的限制因素，从而保障细胞的稳定性与安全性。细胞壁的存在，严重阻碍了rnai在植物上的应用。
4.因此，开发出在植物中准确高效的传送sirna，使其发挥应有的作用是目前正待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.为解决上述花色改变困难的问题,本发明提供了一种碳量子点cqds介导沉默植物花色调控关键酶基因(查尔酮异构酶：chi)体系的建立方法和应用。
6.一种基于碳量子点基因传递平台的植物花色调控方法，
7.将根据植物花色合成调控基因序列设计合成的sirna与碳量子点充分结合后，直接涂抹在植物体表面，优选涂抹在花瓣表面，实现花色改变。
8.进一步地，将sirna与碳量子点充分结合后，加入表面活性剂混匀，涂抹在植物体表面。
9.进一步优选，采用0.05％ silwet l-77作为表面活性剂。
10.进一步地，合成的碳量子点粒径小于10nm，能够穿越细胞壁进入细胞。
11.上述的方法，合成sirna-cqds复合物的具体过程：
12.将90-110μm的sirna与25-35mg/ml的cqds溶液按体积比例1:1.2-1.8混合，最后加入0.08-0.12m盐溶液中定容到100μl；接着对混合物水浴超声震荡，分散团聚的cqds，便于cqds和sirna的结合；将超声处理的溶液在室温下温育至少30min，离心以除去未结合的
cqds，得到sirna-cqds复合物。
13.进一步地，
14.对混合物水浴超声震荡，采用3mm的探针尖端，以50％振幅(～40w)进行超声处理后再温育。
15.所述的盐溶液包括：氯化钠溶液。
16.进一步地，
17.cqds的合成具体过程：
18.将0.76g的双氰胺和0.294g的柠檬酸钠，溶解于40ml蒸馏水中，超声助溶，定容至60ml后转入100ml水热反应釜中，在200℃中反应4h；反应釜自然冷却到室温后，3000r/min下离心30min，去除粒径较大的沉淀物(图1最左侧为烘干后的沉淀物)。取出含有纳米级碳量子点的上清液进行55℃烘干直到沉淀物出现(60ml反应液大约需要24h)，得到2种颜色的粉末，其中的灰白色粉末(图1最右侧)，即为粒径小于10nm且具有保护核酸作用的碳量子点。
19.进一步地，
20.sirna-cqds复合物使用的具体过程：
21.加入表面活性剂于sirna-cqds复合物中混匀，然后洒在植物体表面。
22.优选加入0.05％ silwet l-77表面活性剂于sirna-cqds复合物中混匀，然后洒在花瓣表面。
23.本发明的花色调控技术具备多种独特的特点，包括合成的碳量子点带有正电荷、花色变化明显、操作简单易行、适用范围广泛等等。因此，该技术为植物花色改变提供了全新的途径，并且具有广阔的应用前景。
24.本发明借助搭建的核酸递送平台对植物进行花色的改变，不同于传统的质粒运载方法，碳量子点的制作方法简便，碳量子点介导的沉默速度更快，植物花色改变效率更高。
25.本发明合成的碳量子点具备正电荷，在结合sirna的过程中不需要额外修饰。
26.本发明先合成具有携带正电荷的碳量子点，然后利用超声波尖端将sirna和碳量子点充分混匀结合，利用silwet l-77表面活性剂提高sirna-cqds的渗透作用，最后涂抹在花瓣上实现花色改变。
27.本发明cqds是利用双氰胺和柠檬酸钠作为碳源，通过水热法合成的带正电颗粒。它可以快速与负电性的sirna结合形成复合物sirna-cqds。sirna-cqds能够通过细胞壁进入植物细胞，介导rnai沉默花色调控基因，从而实现植物花色改变。
28.本发明还提供了一种碳量子点基因传递平台，包含根据植物花色合成调控基因序列设计合成的sirna与碳量子点。
29.进一步地，还包括表面活性剂；优选0.05％ silwet l-77作为表面活性剂。
30.相比现有技术，本发明具有的优点和有益效果在于：
31.1、本发明提到的碳量子点水热法合成方法，合成后即携带正电荷，不需要额外的实验修饰。
32.2、本发明借助核酸递送平台，使其花色改变的时间大大缩短至1h内。
33.3、本发明适宜于改变效果好具有广谱性使用。
34.现有技术难点：
cqds复合物与核糖核酸酶37℃共反应用3min，并与不加核糖核酸酶的复合物阴性对照，用1％琼脂糖凝胶电泳对其进行检测(图3)，结果表明1:1.5的比例保护和结合效果最好，质量约达10ng/μl，说明碳量子点适合作为核酸递送平台。
49.碳量子点结合sirna前后。sirna：cqds＝1:1.5时做的材料表征。
50.比例范围在1:1.2-1.8都是可以的。
[0051][0052]
实施例3核酸递送平台检测，具体步骤如下
[0053]
以2周龄的烟草为材料，选择健康、发育良好的叶片作为试验材料。用gfp基因的sirna与碳量子点按照实施例2中的最优比例混合后，加入0.05％ silwet l-77表面活性剂混匀，然后涂抹在烟草叶片，内化6h后，倒置荧光显微镜下观测现象(图4)。和对照相比，绿色荧光显著减弱，说明碳量子点具备将sirna完整导入至细胞质中，并达到良好的rna沉默效果。
[0054]
实施例4矮牵牛花花色改变，具体步骤如下
[0055]
以完全绽放的花瓣为实验材料。将chi基因的sirna与碳量子点按照实施例2中的最优比例混合，加入0.05％ silwet l-77表面活性剂混匀，然后用移液枪吸取到混合物涂抹及分散点样于花瓣周边(图5)。花色在1h内迅速改变，形成独特的花姿，为矮牵牛花的观赏增添新品种。
[0056]
上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明相关细节进行非实质性各种修改和替换，均应落入本发明的保护范围之内。
[0057]
chi基因的cds区：
[0058]
atgtctcctccagtgtccgttactaaaatgcaggttgagaattacgctttcgcaccgaccgtgaaccctgctggttccaccaataccttgttccttgctggtgctgggcatagaggtctggagatagaagggaagtttgttaagtttacggcgataggtgtgtatctagaagagagtgctattccttttctggccgaaaaatggaaaggcaaaaccccccaggagttgactgactcggtcgagttctttagggatgttgttacaggtccatttgagaaatttactcgagttactatgatcttgcccttgacgggcaagcagtactcggagaaggtggcggagaattgtgttgcgcattggaaggggataggaacgtatactgatgatgagggtcgtgccattgagaagtttctagatgttttccggagtgaaacttttccacctggtgcttccatcatgtttactcaatcacccctagggttgttgacgattagcttcgctaaagatgattcagtaactggcactgcgaatgctgttatagagaacaagcagttgtctgaagcagtgctggaatcaataattgggaagcatggagtttctcctgcggcaaagtgtagtgtcgctgaaagagtagcggaactgctcaaaaagagctatgctgaagaggcatctgtttttggaaaaccggagaccgagaaatctactattccagtgattggagtctag,见seq id no.1。
[0059]
所述的sirna序列如seq id no.2-3。
[0060]
sirna-333
[0061]
sense(5'-3')gguggcggagaauuguguutt
[0062]
antisense(5'-3')aacacaauucuccgccacctt。

技术特征：
1.一种基于碳量子点基因传递平台的植物花色调控方法，其特征在于，将根据植物花色合成调控基因序列设计合成的sirna与碳量子点充分结合后，直接涂抹在植物体表面，优选涂抹在花瓣表面，实现花色改变。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将sirna与碳量子点充分结合后，加入表面活性剂混匀，涂抹在植物体表面。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用0.05％silwet l-77作为表面活性剂。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据植物花色合成调控基因序列chi的cds区设计并合成sirna；以双氰胺和柠檬酸钠为碳源，利用水热法合成带正电的cqds。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，合成的碳量子点粒径小于10nm，能够穿越细胞壁进入细胞。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，合成sirna-cqds复合物的具体过程：将90-110μm的sirna与25-35mg/ml的cqds溶液按体积比例1:1.2-1.8混合，最后加入0.08-0.12m盐溶液中定容到100μl；接着对混合物水浴超声震荡，分散团聚的cqds，便于cqds和sirna的结合；将超声处理的溶液在室温下温育至少30min，离心以除去未结合的cqds，得到sirna-cqds复合物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对混合物水浴超声震荡，采用3mm的探针尖端，以50％振幅(～40w)进行超声处理后再温育。8.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，sirna-cqds复合物使用的具体过程：加入表面活性剂于sirna-cqds复合物中混匀，然后洒在植物体表面。9.一种碳量子点基因传递平台，其特征在于，包含根据植物花色合成调控基因序列设计合成的sirna与碳量子点。10.根据权利要求9所述的碳量子点基因传递平台，其特征在于，还包括表面活性剂；优选0.05％silwet l-77作为表面活性剂。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了一种基于碳量子点基因传递平台的植物花色调控方法。CQDs是利用双氰胺和柠檬酸钠作为碳源，通过水热法合成的带正电颗粒。它可以快速与负电性的siRNA结合形成复合物siRNA-CQDs。siRNA-CQDs能够通过细胞壁进入植物细胞，介导RNAi沉默花色调控基因，从而实现植物花色改变。与传统的遗传转化方法以及病毒介导的基因沉默相比，本发明的基于碳量子点基因传递平台的花色调控技术具备多种独特的特点，包括合成的碳量子带有正电荷、花色变化明显、操作简单易行、适用范围广泛等等。因此，该技术为植物花色改变提供了全新的途径，并且具有广阔的应用前景。并且具有广阔的应用前景。并且具有广阔的应用前景。


技术研发人员：李永 谭前龙 李自迁 袁奕清 吴海媚 闫文德
受保护的技术使用者：中南林业科技大学
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/28