一株蜡状芽孢杆菌及其应用的制作方法

no:m 20221153的蜡状芽孢杆菌。
9.较佳地，采样于云南泸沽湖水，经16s rdna鉴定为蜡状芽孢杆菌，命名为profmic-221；
10.蜡状芽孢杆菌的菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在bhi平板上生长，可形成表面粗糙不透明的圆形菌落，乳白色或淡黄色，边缘不整齐；在bhi液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
11.本发明的另一目的是提供了上述蜡状芽孢杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用；其中，所述改善皮肤状况包括修护皮肤屏障、抗衰老、提升细胞抗菌能力、调节皮肤菌群中的至少一种。
12.一些实施方案中，所述修复皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因的表达；所述屏障修护相关基因包括flg和/或ovol1中的至少一种。
13.其中，体外细胞实验表明，本发明的蜡状芽孢杆菌profmic-221具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白(filaggrin)flg、ovo样转录因子1(ovo like transcriptional repressor 1)ovol1表达的作用，基因表达量上调1.16～1.64倍。
14.一些实施方案中，所述抗衰老包括下列所示表达中的至少一种：
15.a).所述抗衰老包括上调抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达；
16.b).所述抗衰老包括上调细胞免疫调节因子相关基因mor的表达；
17.c).所述抗衰老包括上调细胞外基质相关基因mkx和/或col13a1的表达；
18.d).所述抗衰老包括上调细胞抗氧化相关基因的表达；所述细胞抗氧化相关基因包括nrf2、sirt-1、sirt-3中的至少一种；
19.e).所述抗衰老包括下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括p38mapk、mmp7、mmp11中的至少一种。
20.f).所述抗衰老包括下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括caspase-3、caspase-8的至少一种。
21.需要说明的是，为了探究蜡状芽孢杆菌的抗衰老效果，本发明对细胞衰老相关的指标进行了测定，所述的指标包括抑制细胞凋亡、免疫调节因子、细胞外基质、细胞抗氧化、降解细胞外基质及细胞凋亡中的至少一个。
22.其中，体外细胞实验表明，本发明的蜡状芽孢杆菌profmic-221具有抑制细胞凋亡相关的b淋巴细胞瘤-2基因bcl-2表达，上调细胞免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因mor，上调hff细胞外基质合成相关的xiii型胶原α1链基因col13a1和莫霍克蛋白基因mkx，以及抗氧化相关的nrf2基因及sirtuins蛋白家族基因sirt-1和sirt-3的作用，基因相对表达倍数1.18～4.72倍。
23.其中，体外细胞实验表明，本发明的蜡状芽孢杆菌profmic-221具有下调降解细胞外基质相关的p38mapk及基质金属蛋白酶家族基因mmp7、mmp11，细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶家族基因caspase-3、caspase-8表达的作用，基因相对表达倍数0.52～0.87。
24.一些实施方案中，所述抗衰老包括清除dpph自由基。
25.其中，体外细胞实验表明，本发明的蜡状芽孢杆菌profmic-221具有抗dpph自由基的功能，清除率91.07％～91.81％。
26.一些实施方案中，所述提升皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因s100a7的表
达。
27.其中，体外细胞实验表明，本发明的蜡状芽孢杆菌profmic-221具有上调抗菌肽相关基因银屑病素s100a7表达的作用，基因相对表达倍数1.54～1.67。
28.一些实施方案中，所述调节皮肤菌群包括下调限制马拉色菌或表皮葡萄球菌的菌群比例。
29.其中，体外细胞实验表明，本发明的蜡状芽孢杆菌profmic-221具有下调限制马拉色菌或表皮葡萄球菌的菌群比例的功能。
30.本发明的再一目的是提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述蜡状芽孢杆菌原料制成。
31.进一步地，所述产品为食品、药品或化妆品。
32.更进一步的，所述产品还包括含有蜡状芽孢杆菌的菌群。
33.更进一步的，所述产品包括含有蜡状芽孢杆菌及其溶胞物、外泌体、裂解物、提取物制成的菌剂，或者含有蜡状芽孢杆菌的菌群制成的菌剂。
34.更进一步的，所述产品的剂型包括膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种。
35.本发明的再一目的是提供了一种改善肌肤状态的方法，其包括使用本发明所述从产品。所述使用的方法包括涂抹、外敷、熏蒸或注射。
36.本发明公开的蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)profmic-221，其保藏编号为cctcc no:m 20221153的蜡状芽孢杆菌。实验表明，本发明提供的蜡状芽孢杆菌具有修护皮肤屏障、抗衰老、提升细胞抗菌能力、调节皮肤菌群的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。
37.生物保藏说明
38.蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)profmic-221，于2022年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为cctcc no:m 20221153。
具体实施方式
39.本发明提供了蜡状芽孢杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本

技术实现要素：
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
40.本发明的蜡状芽孢杆菌菌株profmic-221，来源于云南泸沽湖水，经16srdna鉴定为蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在bhi平板上生长，可形成表面粗糙不透明的圆形菌落，乳白色或淡黄色，边缘不整齐；在bhi液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。
41.蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)profmic-221，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年7月25日，保藏编号为cctcc no:m 20221153。
42.本发明提供的蜡状芽孢杆菌profmic-221在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：上清液。
43.本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
44.实施例1profmic-221的分离
45.用灭菌采样瓶于云南泸沽湖水中采样，在距水面10cm～15cm的水层打开瓶塞取样，盖上盖子后再从水中取出，水样采集后立即放在冰水浴中，置于暗箱保存。随同冰包保持较低温度运回实验室后取适当量水样以6000r/min转速离心3min去除杂质，取上清划线于bhi固体平板，37℃恒温培养16h后，挑取菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为profmic-221。
46.革兰氏染色镜检：菌株profmic-221为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状，芽孢中生；在bhi平板上生长，可形成圆形菌落，菌落表面干燥不平整，边缘锯齿状，不透明，呈乳白色或浅黄色似蜡烛样颜色；在bhi液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈乳白色小块状沉淀。
47.实施例2profmic-221的核酸鉴定
48.1、16s rdna基因序列分析：
49.挑取单菌落置bhi液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，12000r/min转速离心1min收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27f、1492r、pcr扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；94℃、15s，57℃、15s，72℃、40s，35个循环；72℃延伸10min。
50.2、结果
51.pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得出profmic-221菌株为蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)。
52.实施例3profmic-221促进sds诱导的人永生化角质形成细胞hacat损伤修复实验
53.1、profmic-221上清液制备
54.挑取蜡状芽孢杆菌profmic-221单菌落于bhi液体培养基，37℃摇床培养箱静置培养16h～18h，酶标仪检测并以bhi稀释调整od
600
＝0.2，121℃、30min、0.28mpa灭活，12000r/min转速离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。
55.2、促进hacat屏障修护相关基因表达实验
56.接种人永生化角质形成细胞hacat(2ml/孔，内含5
×
105细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入上清液5％(v/v)，对照组以等体积bhi替代上清液，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测flg和ovol1基因的表达。以添加等体积bhi处理组为对照(基因相对表达倍数f＝1)，利用2-δδct
法计算各样品f值。
57.公式：f＝2-δδct
，其中：
58.△
ct
实验
＝ct
实验-ct
内参(实验)
；
59.△
ct
对照
＝ct
对照-ct
内参(对照)
；
60.△△
ct＝
△
ct
实验
‑△
ct
对照
。
61.结果见下表：
[0062][0063]
结果显示蜡状芽孢杆菌profmic-221具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白(filaggrin)flg、ovo样转录因子1(ovo like transcriptional repressor 1)ovol1表达的作用，基因表达量上调倍数为1.16～1.64。可以得知，蜡状芽孢杆菌profmic-221具有促进皮肤屏障修护的作用。
[0064]
实施例4profmic-221调节光老化hacat细胞外基质/抗氧化相关基因表达实验
[0065]
1、profmic-221上清液制备
[0066]
制备方法参照实施例3。
[0067]
2、hacat细胞制备及紫外线损伤
[0068]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2j/cm2的紫外线uvb光老化。
[0069]
3、profmic-221添加
[0070]
将上清液5％(v/v)加入刺激过的hacat细胞(对照组以等体积bhi替代上清液)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0071]
4、qpcr法检测细胞外基质/抗氧化相关基因相对表达倍数
[0072]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测抗氧化相关基因nrf2，以及降解细胞外基质相关基因mmp1、p38mapk的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0073]
上清液上调抗氧化相关基因nrf2，下调降解细胞外基质相关基因mmp1、p38mapk。结果见下表：
[0074][0075]
结果显示蜡状芽孢杆菌profmic-221具有上调抗氧化核因子e2相关因子2基因nrf2基因表达的作用，基因相对表达倍数未1.28～1.34；以及具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp1、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因p38mapk表达的作用，基因相对表达倍数为0.31～0.79。可以得知，蜡状芽孢杆菌profmic-221具有促进hacat抗氧
化、减少细胞外基质降解的抗衰老作用。
[0076]
实施例5profmic-221调节氧化损伤hff细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子相关基因表达实验
[0077]
1、profmic-221上清液制备
[0078]
制备方法参照实施例3。
[0079]
2、hff细胞制备及h2o2诱导氧化损伤
[0080]
将dmem培养的hff细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μm的h2o2进行刺激，37℃静置1h。
[0081]
3、profmic-221添加
[0082]
将上清液5％(v/v)加入刺激过的hff细胞(对照组以等体积bhi替代上清液)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0083]
4、qpcr法检测细胞外基质/细胞凋亡/抗氧化/免疫调节因子相关基因相对表达倍数
[0084]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因col13a1、mkx，抑制细胞凋亡相关基因bcl-2，抗氧化相关基因sirt-1、sirt-3；免疫调节因子mor，以及降解细胞外基质相关基因mmp7、mmp11，细胞凋亡相关基因caspase-3、caspase-8的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0085]
上清液上调细胞外基质相关基因col13a1和mkx，抗氧化相关基因sirt-1和sirt-3，免疫调节因子相关基因mor，抑制细胞凋亡基因bcl-2；下调降解细胞外基质相关基因mmp7、mmp11，细胞凋亡相关基因caspase-3、caspase-8，结果见下表：
[0086][0087]
结果显示蜡状芽孢杆菌profmic-221具有上调hff细胞外基质相关的xiii型胶原α1链基因col13a1和莫霍克蛋白基因mkx，细胞抗氧化相关的sirtuins蛋白家族基因sirt-1和sirt-3，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因mor，以及抑制细胞凋亡相关的b淋巴细胞瘤-2基因bcl-2表达的作用，基因相对表达倍数为1.18～4.72；以及具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp7、mmp11，细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶家族基
因caspase-3、caspase-8表达的作用，基因相对表达倍数0.52～0.87。可以得知，蜡状芽孢杆菌profmic-221具有促进hff细胞外基质合成、强化细胞抗氧化能力、增加细胞免疫调节因子、减少细胞外基质降解、减少细胞凋亡的抗衰老作用。
[0088]
实施例6profmic-221dpph自由基清除能力实验
[0089]
1、profmic-221上清液制备
[0090]
制备方法参照实施例3。
[0091]
2、dpph自由基清除能力检测
[0092]
试剂配制和检测方法按照索莱宝dpph自由基清除能力检测试剂盒说明书进行。测定各样品515nm吸亮度，求平均值并计算各样品自由基清除率。
[0093]
计算公式及结果如下表：
[0094][0095]
结果显示蜡状芽孢杆菌profmic-221上清液具有非常显着的dpph自由基清除率，清除率91.07％～91.81％。
[0096]
实施例7profmic-221上调hacat抗菌肽相关基因表达实验
[0097]
1、profmic-221上清液制备
[0098]
制备方法参照实施例3。
[0099]
2、hacat细胞制备
[0100]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
[0101]
3、profmic-221添加及lps刺激
[0102]
将上清液5％(v/v)加入培养过夜的hacat细胞中(对照组以等体积bhi替代上清液)，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。
[0103]
4、qpcr法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数
[0104]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测银屑病素s100a7基因的表达。以等体积bhi处理组为对照(基因相对表达倍数f＝1)，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0105]
结果见下表：
[0106]
[0107]
结果显示蜡状芽孢杆菌profmic-221上清液具有上调抗菌肽相关基因银屑病素s100a7表达的作用，基因相对表达倍数1.54～1.67。可以得知蜡状芽孢杆菌profmic-221上清液具有促进抗菌肽基因表达的作用。
[0108]
实施例8profmic-221调节皮肤相关菌群
[0109]
1、profmic-221上清液制备
[0110]
挑取蜡状芽孢杆菌profmic-221单菌落于bhi液体培养基，37℃摇床培养箱静置培养16h～18h，酶标仪检测并以bhi液体培养基稀释调整od
600
＝2，121℃，30min、0.28mpa灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。
[0111]
2、皮肤相关菌群菌液制备
[0112]
将限制马拉色菌cicc 33081，挑取单菌落于麦芽汁液体培养基，30℃培养箱静置培养过夜，检测并以麦芽汁液体培养基稀释调整od
600
＝0.1。将表皮葡萄球菌cgmcc 1.4260，挑取单菌落于bhi液体培养基，37℃培养箱静置培养过夜，检测并以bhi液体培养基稀释调整od
600
＝0.1。
[0113]
3、添加上清液影响皮肤相关菌群生长实验
[0114]
将上清液以添加量10％分别加入两种皮肤菌群菌液中，以添加等体积bhi液体培养基为对照，限制马拉色菌30℃培养24h，表皮葡萄球菌37℃培养4h，以两种菌液相对浓度(od
600
)比值评价对皮肤相关菌群生长影响。
[0115]
计算公式及结果如下表：
[0116][0117][0118]
结果显示蜡状芽孢杆菌profmic-221对皮肤主要病原菌限制马拉色菌有抑制作用，而不影响表皮葡萄球菌增殖。可以得知蜡状芽孢杆菌profmic-221能够改变皮肤菌群比例，从而有效改善脂溢性皮炎相关菌群。
[0119]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一株蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)，该菌株被命名为profmic-221，已于2022年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno:m 20221153的蜡状芽孢杆菌。2.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌，其特征在于，采样于云南泸沽湖水，经16s rdna鉴定为蜡状芽孢杆菌，命名为profmic-221；蜡状芽孢杆菌的菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在bhi平板上生长，可形成表面粗糙不透明的圆形菌落，乳白色或淡黄色，边缘不整齐；在bhi液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。3.权利要求1或2所述的蜡状芽孢杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用，其中，所述改善皮肤状况包括修护皮肤屏障、抗衰老、提升细胞抗菌能力、调节皮肤菌群的至少一种。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修复皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因的表达；所述屏障修护相关基因包括flg和/或ovol1中的至少一种。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括下列所示表达中的至少一种：a).所述抗衰老包括上调抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达；b).所述抗衰老包括上调细胞免疫调节因子相关基因mor的表达；c).所述抗衰老包括上调细胞外基质合成相关基因mkx和/或col13a1的表达；d).所述抗衰老包括上调细胞抗氧化相关基因的表达；所述细胞抗氧化相关基因包括nrf2、sirt-1、sirt-3中的至少一种；e).所述抗衰老包括下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因包括p38mapk、mmp7、mmp11中的至少一种。f).所述抗衰老包括下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因包括caspase-3、caspase-8的至少一种。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括清除dpph自由基。7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提升皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因s100a7的表达。8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调节皮肤菌群包括下调限制马拉色菌或表皮葡萄球菌的菌群比例。9.一种改善皮肤状况的产品，其特征在于，所述产品包括食品、药品、化妆品中的其中一种，由包括权利要求1或2所述的蜡状芽孢杆菌原料制成。10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品中的蜡状芽孢杆菌包括如下所示的至少一种：(1)蜡状芽孢杆菌的菌群和/或菌剂；(2)蜡状芽孢杆菌的培养物、外泌体、裂解物和/或提取物。

技术总结
本发明公开了一株蜡状芽孢杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，该菌株被命名为ProfMIC-221，已于2022年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M20221153的蜡状芽孢杆菌。实验表明，ProfMIC-221具有修护皮肤屏障、抗衰老、提升细胞抗菌能力、调节皮肤菌群能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。化妆品等。


技术研发人员：廖梅香
受保护的技术使用者：廖梅香
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/28