分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片和方法

分流通道的分区式多重crispr核酸检测芯片和方法
技术领域
1.本发明是属于微生物学和生化分析领域的一种crispr核酸检测芯片和方法，主要涉及到一种利用多重crispr对一个反应体系中的多种核酸扩增产物进行一体化集成检测的芯片和方法。


背景技术：

2.核酸扩增技术可以让dna在几十分钟，甚至短短数分钟内实现指数级的大量复制，具有核酸信号放大功能。除了传统的聚合酶链式扩增(pcr)，兴起的环介导等温扩增(lamp)、重组酶聚合酶扩增(rpa)等等温扩增技术因其更易实现的扩增条件，越来越多地用于核酸检测。生化、食品、环境、医疗等样本中待测核酸的含量一般不高，难于直接检测，通常在检测之前先进行核酸扩增。再利用嵌入式荧光染料或荧光探针的荧光信号检测核酸。但是嵌入式荧光染料是一种非模板依赖的检测方法，特异性不高，容易导致假阳性结果；而荧光探针需要根据靶序列来合成，不同的靶序列需要合成不同的荧光探针，且合成成本较高。
3.crispr新型分子检测技术是基于crispr/cas系统独特的反式切割能力。如cas12a蛋白、cas12b蛋白、cas13a蛋白、cas14蛋白等crispr结合蛋白能够非特异性地切割体系中任意的单链dna。利用该原理，在核酸扩增的基础上，在体系中添加荧光报告分子。当crispr/cas系统识别靶序列时，会切割报告分子，随后对报告分子产生的荧光信号进行测定，即可确定样本中靶基因是否存在。grna可精准定位目标基因位点，cas蛋白在目标位点进行精确剪切。crispr/cas系统的精确识别给检测带来了高特异性，持续的剪切给检测带来了高灵敏度，且温和的反应温度，降低了对检测设备和环境的要求，使得crispr检测技术在核酸检测中显示出巨大的潜力。
4.传统的单重crispr每次只能检测一个靶基因。当需要检测同一样本中的多个基因时，一次次的单重检测需要耗费大量的人力物力，因此出现了多重crispr检测技术。一管式多重crispr检测通常是将多个靶基因对应的引物和grna同时加入扩增和检测体系中，实现多个基因的同时扩增和检测。然而，由于核酸扩增和crispr检测的试剂和反应温度不兼容，并且某个基因或其引物的存在可能会影响其他基因的检测，使得多重crispr检测的发展受到限制。


技术实现要素：

5.为了解决背景技术中存在的问题，本发明提出了一种利用分流通道的分区式一体化多重crispr核酸检测芯片和方法，可快速有效地实现多种核酸在一个反应体系中同时扩增并利用多重crispr对扩增产物中的多个基因进行一体化集成检测。该芯片和方法避免了气溶胶释放到周围环境中，同时解决了扩增与检测过程中试剂、反应温度不兼容的问题。此外，还简化了多种核酸检测的操作和流程并提升了检测结果准确度。
6.本发明的技术方案如下：
7.所述芯片内部沿环形顺时针或者逆时针的流通顺序依次设置一个加样腔、一个核酸扩增腔、一个混合腔、两个或两个以上crispr检测腔，还设置和crispr检测腔相同数量的毛细管阀，以及将这些腔相连的通道，具体介绍如下：
8.包括一个加样腔，用于加入、容纳待测样本溶液，加样腔上端有一个与外界相通的开口作为加样口，待测样本溶液从加样口加入；
9.包括一个核酸扩增腔，位于加样腔下方，用于待测样本溶液进行核酸扩增反应形成核酸扩增产物，核酸扩增腔内预先置有预先包埋或冻干的核酸扩增试剂；
10.包括两个或两个以上并联的crispr检测腔，用于核酸扩增产物中两个或两个以上基因检测，即需要检测几个基因就设置几个crispr检测腔。crispr检测腔预先内置有预先包埋或冻干的目的基因crispr检测试剂；若干个crispr检测腔并行排布，通过各自的液体通道与前面的核酸扩增腔/混合腔汇合连通；
11.具体实施中，crispr检测腔位于混合腔右上方，通过液体通道与混合腔连通，腔内有预先包埋或冻干的crispr检测试剂(包括buffer、rna酶抑制剂、cas蛋白、dna探针、基因特异性的crrna等)。
12.包括与crispr检测腔数量一致的毛细管阀，每个crispr检测腔均经一个毛细管阀和加样腔的加样口连通，位于并连接到每个crispr检测腔面向核酸扩增腔的相反一侧；在核酸扩增产物进入crispr检测腔之前作用是通气，在核酸扩增产物进入crispr检测腔之后作用是截留住腔内的核酸扩增产物，使混匀后的核酸扩增产物的溶液留在crispr检测腔，直至溶液进入各crispr检测腔；
13.加样腔和核酸扩增腔之间、核酸扩增腔和crispr检测腔之间、crispr检测腔和加样腔的加样口之间均通过芯片内部的环形流道连通，构成一个位于芯片内部的近似周向环形循环流通过程，这样的设计使芯片内部气压自动平衡，液体流动可利用重力和旋转动作实现，无需任何外界的泵、阀，待测样本溶液通过旋转芯片在重力的作用下依次流经核酸扩增腔和各个crispr检测腔，完成不同基因一体快捷迅速的crispr核酸检测。
14.芯片内部的流道均连通到核酸扩增腔和crispr检测腔的径向内侧，即核酸扩增腔和crispr检测腔均位于芯片内部的流道的外侧或者靠外侧。
15.所述芯片还可包括一个较大体积的混合腔，处于核酸扩增腔和crispr检测腔之间，使得核酸扩增腔经混合腔和多个crispr检测腔连通，混合腔用于对待测样本溶液经核酸扩增反应后的核酸扩增产物进行混匀，使体系均一，确保进入后续不同crispr检测腔的核酸浓度均一，具体实施中混合腔位于加样腔的另一侧，通过液体通道与核酸扩增腔连通；
16.这样情况下，若干个crispr检测腔并行排布，通过各自的液体通道与前面的混合腔汇合连通。
17.加样腔和核酸扩增腔之间、核酸扩增腔和混合腔、混合腔和crispr检测腔之间、crispr检测腔和加样腔的加样口之间均通过芯片内部的环形流道连通，构成一个位于芯片内部的近似周向环形循环流通，这样的设计使芯片内部气压自动平衡，液体流动可利用重力和旋转动作实现，无需任何外界的泵、阀，待测样本溶液通过旋转芯片在重力的作用下依次流经核酸扩增腔和各个crispr检测腔，完成不同基因一体快捷迅速的crispr核酸检测。
18.芯片内部的流道均连通到核酸扩增腔、混合腔和crispr检测腔的径向内侧，即核酸扩增腔、混合腔和crispr检测腔均位于芯片内部的流道的外侧或者靠外侧。
19.具体实施中，核酸扩增腔和crispr检测腔位于芯片内的对侧。
20.在核酸扩增腔具有待测样本溶液时，所述的混合腔高于核酸扩增腔中所盛待测样本溶液的液面最高点。
21.当扩增结束后，将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转90
°
，在重力作用下，核酸扩增腔中的扩增液及加样腔中残留的液体进入混合腔，并进行混合。为了增强混合效果，可以在混合腔中预置磁珠，利用外加磁场控制磁珠进行搅拌；也可以利用超声的搅拌方式。当溶液进入到混合腔时，由于相对芯片的最初位置，芯片已经旋转了90
°
，这时若干个crispr检测腔的交汇点高于混合腔中所盛样品液面的最高点。这样在混合时，液体不会进入交汇点及后面的crispr检测腔。
22.设置混合腔的目的如下：当扩增腔体积较小时，后续并行检测时，需要将扩增腔中的扩增溶液均匀分配至各个crispr检测腔，由于扩增液体体积较小，这样分配就比较困难。而设置一个混合腔，就可利用和扩增腔相连的加样腔中加样时残留的多余溶液，对扩增中溶液进行稀释，增大液体体积，方便后续在各个crispr检测腔中的分配。当然，这样设置会对扩增液中各个扩增子的浓度有所影响。但是，由于扩增后，扩增子的浓度很高，稀释对后续crispr检测所带来的影响很小。混匀腔在具体设置时，可以加大其深度，从而避免在微小尺度时，毛细作用等对液体运动的限制，从而使得液体在混合腔中有较好的混合效果。
23.当扩增腔及扩增体系体积较大时，也可以省略混合腔。当扩增产物稀释混匀后，将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转90
°
，液体受重力作用进入crispr检测腔。检测腔底部设有毛细管阀，通过流道设计以及通过控制整个体系中溶液的体积、腔室和通道中液柱的高度，使得液柱高度所带来的压力不会突破毛细管阀。这样毛细管阀将截留住crispr腔内的液体，使混匀后的核酸扩增液留在检测腔，直至溶液充满各检测腔，并避免液体只进入其中一个或数个crispr检测腔，而不能充满所有crispr检测腔的问题。当添加样本、旋转或加热等操作时，这样的腔室位置和毛细管阀的设计也避免了液体流动惯性或加热体积膨胀导致溶液进入到其他腔室的情况。
24.所有crispr检测腔和加样腔的加样口的之间通过气体连通通道连通，这样的设计使芯片内部气压自动平衡，液体流动可利用重力实现，无需任何外界的泵、阀。
25.所述的crispr检测腔数量为至少两个，可以是更多个。
26.所述芯片还包括与crispr检测腔、毛细管阀数量一致的气体通道结构，每个crispr检测腔均经各自的一个毛细管阀、气体通道结构后和加样腔的加样口连通，气体通道结构位于并连接到每个crispr检测腔面向核酸扩增腔的相反一侧。
27.每个毛细管阀一端和crispr检测腔连通，另一端和气体通道结构连通，气体通道结构再和加样腔的加样口连通。
28.所述的毛细管阀替换为以沿l形路径呈u形弯折的毛细通道。除了设置毛细管阀，也可以在crispr检测腔底部设置弯折的毛细通道，当腔内的液体液面与通道内液面一致时，液体停止流动。
29.所述的核酸扩增腔、crispr检测腔外侧即芯片外部设有用于加热的温控装置。
30.所述核酸扩增腔、crispr检测腔的体积及腔内的试剂，可根据加样量进行调整。
31.二、一种分区式多重crispr核酸检测芯片的多重crispr核酸检测方法，方法包括：
32.s1、原始状态下核酸扩增腔位于芯片的底部，在核酸扩增腔中预先添加包埋或冻
干的核酸扩增试剂，在crispr检测腔预先添加包埋或冻干的用于基因检测的crispr检测试剂，且不同crispr检测腔预先添加用于不同基因检测的crrna；
33.所述的crispr检测试剂包括buffer、rna酶抑制剂、cas蛋白、dna探针、目的基因特异性的crrna等。
34.s2、将待测样本溶液从加样腔的加样口加入，进而进入到核酸扩增腔内和核酸扩增腔内的核酸扩增试剂混合进行核酸扩增反应；
35.在所加样本溶液体积较大时，也会有部分待测样本溶液残留在加样腔中，这部分液体可用于后续的扩增液稀释。
36.在添加待测样本溶液后，封闭加样口，使得芯片内部和周围环境隔离，避免扩增子污染到环境中。
37.s3、核酸扩增反应结束后，在核酸扩增腔内获得核酸扩增产物的溶液，以芯片的底面为基准面，将芯片的基准面垂直于地面翻转旋转固定角度，具体是顺时针或者逆时针旋转一定角度，如90
°
，当crispr检测腔在加样口左侧时逆时针旋转；而当crispr检测腔在加样口右侧时顺时针旋转，使得crispr检测腔被旋转到芯片的底部，在重力的作用下，核酸扩增产物溶液在液体通道交汇点分流，从核酸扩增腔进入到若干个crispr检测腔中，且在毛细管阀处停止流动；核酸扩增产物溶液和crispr检测腔内的crrna混合进行特异性结合反应；
38.s4、最后根据特异性结合反应的结果判断待测样本溶液中是否含有某个目的基因。
39.具体是，若待测样本中含有某个基因，cas蛋白在其特异性crrna的引导下特异性地结合目的基因，同时触发旁路切割活性，荧光标记的ssdna探针被切割后产生荧光；若待测样本中不含目的基因，cas蛋白无法触发旁路切割活性，荧光标记的ssdna探针无法被切割，即无法产生荧光。
40.因此，利用可视化荧光检测仪器观察检测结果，根据crispr反应结束后的荧光信号情况可判断待测样本中是否含有某个基因，利用多个并联的crispr检测腔实现多个基因的同时快速的检测。
41.三、另一种分区式多重crispr核酸检测芯片的多重crispr核酸检测方法，方法包括：
42.s1、原始状态下核酸扩增腔位于芯片的底部，在核酸扩增腔中预先添加包埋或冻干的核酸扩增试剂，在crispr检测腔预先添加包埋或冻干的用于基因检测的crispr检测试剂，且不同crispr检测腔预先添加用于不同基因检测的crrna；
43.所述的crispr检测试剂包括buffer、rna酶抑制剂、cas蛋白、dna探针、目的基因特异性的crrna等。
44.s2、将待测样本溶液从加样腔的加样口加入，进而进入到核酸扩增腔内和核酸扩增腔内的核酸扩增试剂混合进行核酸扩增反应；
45.在所加样本溶液体积较大时，也会有部分待测样本溶液残留在加样腔中，这部分液体可用于后续的扩增液稀释。
46.在添加待测样本溶液后，封闭加样口，使得芯片内部和周围环境隔离，避免扩增子污染到环境中。
47.s3、核酸扩增反应结束后，在核酸扩增腔内获得核酸扩增产物的溶液，以芯片的底面为基准面，将芯片的基准面垂直于地面翻转旋转固定角度，具体是顺时针或者逆时针旋转一定角度，如90
°
，当混合腔在加样口左侧时逆时针旋转；而当混合腔在加样口右侧时顺时针旋转。使得混合腔被旋转到芯片的底部，核酸扩增腔内的核酸扩增产物的溶液在重力的作用下经芯片内部的流道流入到混合腔中，可对芯片进行震荡振动，使得核酸均匀分布于溶液中；
48.具体是在重力作用下，核酸扩增产物的溶液进入到混合腔的底部，且在振动的作用下发生均匀混合。
49.s4、在核酸扩增产物的溶液进入到混合腔被混匀后，
50.将芯片的基准面垂直于地面翻转地继续旋转固定角度，具体是顺时针或者逆时针旋转一定角度，如90
°
，当混合腔在加样口左侧时逆时针旋转；而当混合腔在加样口右侧时顺时针旋转，使得crispr检测腔被旋转到芯片的底部，在重力的作用下，混匀后的核酸扩增产物溶液在液体通道交汇点分流，从混合腔进入到若干个crispr检测腔中，且在毛细管阀处停止流动；核酸扩增产物溶液和crispr检测腔内的crrna混合进行特异性结合反应；
51.s5、最后根据特异性结合反应的结果判断待测样本溶液中是否含有某个目的基因。
52.具体是，若待测样本中含有某个基因，cas蛋白在其特异性crrna的引导下特异性地结合目的基因，同时触发旁路切割活性，荧光标记的ssdna探针被切割后产生荧光；若待测样本中不含目的基因，cas蛋白无法触发旁路切割活性，荧光标记的ssdna探针无法被切割，即无法产生荧光。
53.因此，利用可视化荧光检测仪器观察检测结果，根据crispr反应结束后的荧光信号情况可判断待测样本中是否含有某个基因，利用多个并联的crispr检测腔实现多个基因的同时快速的检测。
54.本发明的芯片能够很好的实现核酸扩增和多重crispr检测。运用此芯片检测多个基因时，只需要进行一次扩增，即多个基因在一个扩增腔中同步扩增。其次，扩增和扩增后的检测步骤在不同的腔室中进行，互不干扰。
55.本发明的芯片各腔室通过多个通道连通，内部气压自动平衡，不与外部相通，扩增产生的气溶胶不会释放到空气中。此外，该芯片和方法集核酸扩增、多个目的基因的检测于一体，简化了多个目的基因的检测流程。旋转和混合池的设计避免了大量的移液和混匀操作，省时省力。
56.本发明的有益效果是：
57.本发明的芯片及方法能够实现核酸扩增及其产物中多个基因的一体化集成检测。为完成检测，操作者只需要进行三步简单的操作。第一是向核酸扩增腔的加样口中加入待测样本；第二是待扩增反应结束后，旋转芯片；第三是等扩增产物混匀后，再次旋转芯片即可。
58.同时，使用本发明的芯片，在加入样本后，只要利用塞子或胶带等将加样口密封，整个过程无需开盖、移液、手动混合；其次，该芯片各腔室通过多个通道连通，内部气压自动平衡，不需要外界提供动力，液体依靠重力运动；且不与外部相通，扩增产生的气溶胶不会释放到空气中。另外，由于crispr/cas的旁路切割是一个酶促反应，具有信号放大作用，因
此具有很高的检测灵敏度。同时，cas蛋白是在crrna的引导下对目标链进行识别，具有很好的特异性。本发明的芯片在这些方面具有明显的优势。
59.运用此芯片检测多个基因时，只需要进行一次扩增，即多个基因在一个扩增腔中同步扩增。其次，扩增和扩增后的检测步骤在不同的腔室中进行，互不干扰，避免了扩增和crispr检测的试剂、反应温度不兼容的问题。此外，该芯片和方法集核酸扩增、多个目的基因的检测于一体，简化了多个目的基因的检测流程。旋转、混合池和毛细管阀的设计使得扩增溶液能够均匀的进入各个crispr检测腔，避免了大量的移液和混匀操作，省时省力。
60.和已有的方法相比，本发明的芯片和方法具有结构简单、操作方便、成本低、准确度高、灵敏度高和特异性高等优势。
附图说明
61.图1是本发明芯片的结构示意图(以三重crispr检测为例)。1、基准面，2、加样腔，3、核酸扩增腔，4、混合腔，51、52、53、crispr检测腔，61、62、63、64、液体通道，71、72、73、74、气体连通通道，81、82、83、毛细管阀。
62.图2是本发明芯片的第二种结构示意图(以三重crispr检测为例)，是在图1的基础上去除了毛细管阀，利用气体通道的特殊结构实现crispr检测腔内液体流动的控制。其中，通道91，92，93的功能和结构类似于图1中81，82，83的毛细管阀和71，72，73的气体通道两者相合并的功能和结构。1、基准面，2、加样腔，3、核酸扩增腔，4、混合腔，51、52、53、crispr检测腔，61、62、63、64、液体通道，91、92、93、94气体连通通道。
63.图3是图1所示芯片中待测样本溶液受重力作用流动到核酸扩增腔后的状态示意图，深灰色部分是流到核酸扩增腔中的待测样本溶液。
64.图4是图3所示芯片逆时针旋转90
°
后，扩增产物溶液受重力作用沿通道61流动到混合腔后的状态示意图，深灰色部分是流到混合腔中的扩增产物溶液。
65.图5是图4所示芯片逆时针旋转90
°
后，混匀后的扩增产物溶液受重力作用沿通道62、63、64、流动到crispr检测腔后的状态示意图，深灰色部分是流到crispr检测腔中的混匀后的扩增产物溶液。
66.图6是本发明芯片的第三种结构示意图(以三重crispr检测为例)，是在图1的基础上去除了混合腔。适合扩增腔体积较大时使用。因为在大体积的扩增腔内经加热扩增和分子热运动之后，扩增液中核酸浓度均一，可以较为容易地实现扩增液在各个crispr检测腔中的分配。1、基准面，2、加样腔，3、核酸扩增腔，51、52、53、crispr检测腔，61、62、63、64、液体通道，71、72、73、74气体连通通道，81、82、83、毛细管阀。
67.图7是实施例1(双重crispr检测)所用芯片的结构示意图。1、基准面，2、加样腔，3、核酸扩增腔，4、混合腔，51、52、crispr检测腔，61、62、63、液体通道，71、72、74气体连通通道，81、82、毛细管阀。
68.图8是实施例3(四重crispr检测)所用芯片的结构示意图。1、基准面，2、加样腔，3、核酸扩增腔，4、混合腔，51、52、53、54、crispr检测腔，61、62、63、64、65、液体通道，71、72、73、74、75气体连通通道，81、82、83、84、毛细管阀。
具体实施方式
69.下面结合附图和具体实施对本发明作进一步说明。
70.如图1所示(以三重crispr检测为例)，芯片内部包含六个相互独立的腔室，分别为加样腔2、核酸扩增腔3、混合腔4和crispr检测腔51、52、53，以及将这些腔相连的通道61、62、63、64和71、72、73、74，还有毛细管阀81、82、83。加样腔2的上端有一个与外界连通的开口(加样口)，加样腔2下方有一个核酸扩增腔3，混合腔位于核酸扩增腔左上方，且其与扩增腔通过液体通道61连通。为描述方便，可设想将芯片的基准面1垂直于地面逆时针旋转90
°
，此时crispr检测腔位于混合腔左上方，和混合腔上端通过液体通道62、63、64连通。当扩增产物混匀后，将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转90
°
，crispr检测腔通过毛细管阀81、82、83与气体连通通道71、72、73直接相连，还通过气体连通通道71、72、73、74和加样口间接连通。
71.图1所示芯片中腔室位置和毛细管阀的设计，避免了添加样本、旋转或加热等操作时，溶液进入到其余腔室中。具体而言，在反应开始前，就芯片所处的位置而言，混合腔高于核酸扩增腔中所盛样品液面的最高点，这一设计可以避免加样或加热等操作导致溶液进入后面的混合腔，使尽可能多的样品留在核酸扩增腔，减少死体积；当芯片逆时针旋转90
°
后，扩增腔中的溶液以及之前残留在加样腔或通道中样本溶液进入到混合腔中，进行混合；三个crispr检测腔的液体通道62、63、64的交汇点高于混合腔中所盛样品液面的最高点，这一设计可以避免加热或旋转等操作导致溶液进入后面所用的crispr检测腔；再次逆时针旋转90
°
后，液体受重力作用进入crispr检测腔，毛细管阀截留住腔内的液体，使混匀后的核酸扩增液留在检测腔，这样的设计一方面避免了液体进入到核酸扩增腔，更重要的是能够将混合稀释均匀后的扩增液体在各个检测腔室间均匀分配。图1所示芯片中，液体通道61、62、63、64的拐角设计为圆润的弧形是便于液体在通道内流动；毛细管阀81、82、83与气体通道71、72、73的连接处设计为折角是为了增加液体流动的阻碍，避免crisp检测腔中的液体进入气体通道71、72、73。
72.除了设置毛细管阀，也可利用气体通道的特殊结构实现crispr检测腔内液体流动的控制，如图2所示(以三重crispr检测为例)。将图1中的81，82，83的毛细管阀的结构和71，72，73的气体通道结构相合并，这样形成如图2所示91，92，93的结构。在实际加工中，如果工艺条件许可，可以将91，92，93等结构都整体制成毛细管阀。若在实际中制备这样的长毛细管阀较为困难，则可以将91，92，93等的管道直径控制在较小的尺度内，这样即使当溶液填充crispr检测腔时，会有部分溶液进入到91，92，93等管道内，但是由于该部分溶液体积很小，也不对整体检测产生影响。
73.如图2所示，芯片内部包含六个相互独立的腔室，分别为加样腔2、核酸扩增腔3、混合腔4和crispr检测腔51、52、53，以及将这些腔相连的通道61、62、63、64、91、92、93、94。其中，通道91，92，93的功能和结构类似于图1中81，82，83的毛细管阀和71，72，73的气体通道两者相合并的功能和结构。加样腔2的上端有一个与外界连通的开口(加样口)，加样腔2下方有一个核酸扩增腔3，混合腔位于核酸扩增腔左上方，且其与扩增腔通过液体通道61连通。为描述方便，可设想将芯片的基准面1垂直于地面逆时针旋转90
°
，此时crispr检测腔位于混合腔左上方，和混合腔上端通过液体通道62、63、64连通。当扩增产物混匀后，将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转90
°
，crispr检测腔底部通过弯折的气体连通通道91、92、93、
94和加样口连通，此时，液体受重力作用进入crispr检测腔，当腔内的液体液面与通道91、92、93内液面一致时，液体停止流动。
74.在实际使用中，待测样本添加完之后，可以利用塞子或胶带等将加样口密封，从而使芯片成为一个密闭的系统。同时，通道61、62、63、64和91、92、93、94将加样腔、核酸扩增腔、混合腔和crispr检测腔连接成一个连通的系统，从而确保各个腔室的气压自动平衡，不会干扰芯片内液体的流动。
75.图3、图4和图5分别显示了液体受重力作用沿加样腔和通道61、62、63、64中流动后的状态。从加样腔上端的加样口加入待测样本溶液后，溶液受到重力的作用，顺着加样腔流动，直至核酸扩增腔3两侧的液面持平，停止流动(如图3所示)。当核酸扩增反应结束后，将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转90
°
，此时核酸扩增腔中的液面高于混合腔。扩增产物溶液受到重力的作用，顺着通道61向混合腔中流动，直至混合腔两侧的液面持平，停止流动(如图4所示)。当扩增产物在混合腔混匀后，将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转90
°
，此时混合腔的位置高于crispr检测腔。这时混合腔中的液体受到重力的作用，顺着通道62、63、64向各个crispr检测腔中流动，而由于毛细管阀的作用，液体不再往下流动，各crispr检测腔被溶液填满，直至通道62、63、64的液面持平，液体停止流动(如图5所示)。
76.下面介绍本发明的具体检测实施过程：
77.1、扩增试剂、检测试剂及样本的添加
78.在核酸扩增腔中预先添加包埋或冻干的核酸扩增试剂。在crispr检测腔中预先添加包埋或冻干的crispr检测试剂(包括buffer、rna酶抑制剂、cas蛋白、dna探针、基因特异性的crrna等)。从加样腔上端的加样口加入待测样本溶液。所加样样本溶液体积的可大于扩增腔体积，从而为后续利用样本液体对扩增产物稀释提供条件。加样后封闭加样口。
79.2、核酸扩增
80.待测样本溶液在重力的作用下流到核酸扩增腔。利用外置的温控装置实现核酸扩增的温度控制。在核酸扩增腔内进行核酸扩增反应，获得扩增产物溶液。
81.3、混匀
82.扩增反应结束后，在核酸扩增腔内获得扩增产物溶液，将芯片的基准面垂直旋转一定角度，如90
°
，具体是当混合腔在加样口左侧时逆时针旋转；而当混合腔在加样口右侧时顺时针旋转。旋转后，在重力的作用下，核酸扩增腔中的溶液及加样腔中残留的液体通过液体通道进入到大体积的混合腔中，进行混合从而保证核酸均匀分布于溶液中。为了保证液体在混匀腔中有较好的混合效果，避免毛细作用对液体运动的影响，混合腔的深度可设置大于3mm。
83.当扩增腔的体积较大时，可以较为容易地实现后续溶液在各个crispr检测腔中的分配，此时可以省略混匀腔及混匀步骤，如图6所示。
84.4、扩增产物中多个基因的多重crispr检测
85.混匀后，将芯片的基准面垂直旋转一定角度，如90
°
，具体是当混合腔在加样口左侧时逆时针旋转；而当混合腔在加样口右侧时顺时针旋转。这时，在重力的作用下，混合腔中的溶液通过液体通道进入到各个crispr检测腔内，与crispr反应试剂混合。若待测样本中含有某个目的基因，cas蛋白在特异性的crrna的引导下结合目的基因，同时触发旁路切割活性，荧光标记的ssdna探针被切割后产生荧光；若待测样本中不含这个目的基因，cas蛋
白无法触发旁路切割活性，荧光标记的ssdna探针无法被切割，即无法产生荧光。因此，利用可视化荧光检测仪器观察检测结果，根据crispr反应结束后的荧光信号情况可判断待测样本中是否含有某个基因，实现多个基因的同时快速的检测。
86.本发明的实施实例：
87.1、虾急性肝胰腺坏死综合症毒性基因pira、pirb的lamp扩增及双重crispr/cas12a检测
88.该实施例所用芯片的结构如图7所示。芯片所使用的材料为聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)板材，板材的厚度为6毫米，利用机械加工等方式在板材的一面加工成图7所示的结构(尺寸以下面的文字说明为准)。
89.芯片内部包含一个加样腔2(上端有一个加样口)、一个核酸扩增腔3、一个混合腔4、两个crispr检测腔51、52以及将这些腔相连的通道61、62、63和71、72、74，还有毛细管阀81、82。加样腔2下方有一个核酸扩增腔3，混合腔位于扩增腔左上方，且其与扩增腔通过液体通道61连通。将芯片的基准面1垂直于地面逆时针旋转90
°
，此时crispr检测腔位于混合腔左上方，和混合腔上端通过液体通道62、63连通。当扩增产物混匀后，再次将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转90
°
。这时，混合腔位于crispr检测腔的右上方，在重力的作用下，混合腔中的液体进入各个crispr检测腔。crispr检测腔通过毛细管阀81、82与气体连通通道71、72直接相连，还通过气体连通通道71、72、74和加样口间接连通。
90.加样腔是高56毫米，宽3毫米的矩形，深1毫米；核酸扩增腔是半径为4.5毫米的半圆，深度为2毫米；混合腔是半径为5.4毫米的半圆，深度为4毫米；两个crispr检测腔是深度为3毫米的水滴形空腔，容积约为30微升。
91.液体通道61、62、63的截面尺寸为0.5x0.5毫米，长度及形状根据实际需要设置。液体通道的拐角设计为圆润的弧形是便于液体在通道内流动。
92.气体连通通道71、72是高16毫米，宽4毫米的矩形，深3毫米。气体连通通道74的截面尺寸为0.5x0.5毫米，长度和形状根据实际需要确定，以确保连接两个crispr检测腔和加样腔。
93.毛细管阀81、82的截面尺寸为0.1x0.1毫米，毛细管阀81、82与气体通道71、72的连接处设计为折角是为了增加液体流动的阻碍，避免检测腔中的液体进入气体通道。
94.上述结构加工完毕后，可利用键合、粘结等技术和另一块pmma板材粘结以构建完整腔室。
95.本实施例以虾急性肝胰腺坏死综合症毒性基因pira、pirb的检测为例，进行lamp扩增及pira、pirb基因的双重crispr/cas12a检测。
96.取虾肉进行匀浆，匀浆后经核酸提取试剂盒提取得到的核酸溶液稀释至10拷贝/ul作为检测样本。在加样口中添加100微升待测样本。添加样本后，用胶带或塞子封闭加样口，防止气溶胶污染。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在65度左右，反应30分钟。
97.lamp反应体系如下：
98.反应组分浓度10x thermopol buffer(含2mm mg
2+
)1xbst 2.0dna polymerase0.64u/μl
硫酸镁2mmdntp0.35mm each甜菜碱0.8mpira/pirb的fip/bip引物1.6μm/1.6μmpira/pirb的f3/b3引物0.2μm/0.2μmpira/pirb的lf/lb引物0.4μm/0.4μm
99.扩增结束之后，将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转一定角度，如90
°
，以通过重力，实现核酸扩增腔中核酸扩增液的流动，进入到大体积的混合腔进行混匀。再将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转一定角度，如90
°
，以通过重力，使混匀后的扩增液进入两个crispr检测腔。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在37度左右，反应30分钟。
100.crispr/cas12a检测体系如下：
101.反应组分浓度10x neb buffer1xrna酶抑制剂4u/μlcas12a蛋白1μmdna probe10μmpira/pirb基因特异性的crrna各1μm
102.利用可视化荧光检测仪器观察检测荧光。若在含pira基因特异性crrna的crispr检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有pira基因；若未观察到荧光，则表明无pira基因。若在含pirb基因特异性crrna的crispr检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有pirb基因；若未观察到荧光，则表明无pirb基因。
103.上述lamp扩增反应试剂和单重crispr/cas12a检测试剂可以通过冻干或包埋的方法，预先放置于反应腔中。其中pira和pirb基因特异性的crrna分别放置于两个crispr检测腔中。
104.2、甲型、乙型、丙型猪流感病毒的pcr扩增及三重crispr/cas12a检测
105.该实施例的结构如图1所示，比实施例1所用芯片多了一个crispr检测腔53，一个毛细管阀83和通道64、73。各腔室、通道的布局、尺寸及芯片加工方式同实施例1。该实施例亦可用图2所示芯片进行检测，图2所示芯片是在图1芯片的基础上去除了毛细管阀，利用气体通道的弯折结构实现crispr检测腔内液体流动的控制。具体表现为液体受重力作用进入crispr检测腔，当腔内的液体液面与通道91、92、93内液面一致时，液体停止流动。
106.本实施例以猪血的检测为例，以甲型、乙型、丙型猪流感病毒为靶标，进行pcr扩增反应及三重crispr/cas12a检测。
107.用核酸提取试剂盒提取猪血，得到的核酸溶液稀释至10拷贝/ul作为检测样本。在加样口中添加100微升待测样本。添加样本后，用胶带或塞子封闭加样口，防止气溶胶污染。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，所配置的温控装置需要能够在50度到95度间进行温度循环。
108.由于流感病毒是rna，而cas12a所检测的是双链dna，所以在检测之前需要进行逆转录(rt)。此实施例中使用一步法rt-pcr进行逆转录和pcr扩增，rt-pcr反应体系如下：
109.反应组分浓度one step rt-pcr bufferⅲ1xtakara ex taq hs1.5u/μl甜菜碱0.8m甲型/乙型/丙型流感病毒primer f/r1μm/1μmprimescript rt enzyme mixⅱ0.4μl
110.扩增结束之后，将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转一定角度，如90
°
，以通过重力，实现核酸扩增腔中扩增液的流动，进入到大体积的混合腔进行混匀。再将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转一定角度，如90
°
，以通过重力，使混匀后的扩增液进入三个crispr检测腔。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在37度左右，反应30分钟。
111.crispr/cas12a检测体系如下：
112.反应组分浓度10x neb buffer1xrna酶抑制剂4u/μlcas12a蛋白1μmdna probe10μm甲型、乙型、丙型流感病毒特异性的crrna各1μm
113.利用可视化荧光检测仪器观察检测荧光。若在含甲型猪流感病毒(iav)特异性的crrna的crispr检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有甲型猪流感病毒；若在含乙型猪流感病毒(ibv)特异性的crrna的crispr检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有乙型猪流感病毒；若在含丙型猪流感病毒(icv)特异性的crrna的crispr检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有丙型猪流感病毒。
114.上述pcr扩增反应试剂和三重crispr/cas12a检测试剂可以通过冻干或包埋的方法，预先放置于反应腔中。其中甲型、乙型、丙型猪流感病毒特异性的crrna分别放置于三个crispr检测腔中。
115.3、大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌的pcr扩增及四重crispr/cas12b检测
116.该实施例的结构如图8所示，比实施例1所用芯片多了两个crispr检测腔53、54，两个毛细管阀83、84和通道64、65、73、75。各腔室、通道的布局、尺寸及芯片加工方式同实施例1。
117.本实施例以饮用水中的致病菌检测为例，以大肠杆菌o157:h7的hlyehec、沙门氏菌的sefa、副溶血性弧菌的tdh、霍乱弧菌的ompw毒力基因为靶标，进行pcr扩增反应及四重crispr/cas12b检测。
118.1l饮用水中的细菌进行过滤富集，将富集得到的细菌用核酸提取试剂盒提取得到核酸溶液，稀释成10ng/ul作为检测样本。在加样口中添加100微升待测样本。添加样本后，用胶带或塞子封闭加样口，防止气溶胶污染。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，所配置的温控装置需要能够在50度到95度间进行温度循环。
119.pcr扩增反应的体系如下：
120.反应组分浓度10x taq buffer1xtakara taq
tm hs dna聚合酶0.5u/μldntp1mm each甜菜碱0.8mhlyehec/sefa/tdh/ompw primer f/r1μm/1μm
121.扩增反应结束之后，将芯片的基准面1垂直于地面逆时针旋转一定角度，如90
°
，以通过重力，实现核酸扩增腔中核酸扩增液的流动，进入混合腔进行混匀。将芯片的基准面1垂直于地面逆时针旋转一定角度，如90
°
，通过重力混匀后的扩增液进入四个crispr检测腔。利用外加的温控装置对核酸扩增腔外侧进行加热，温度控制在37度左右，反应30分钟。
122.crispr/cas12b检测体系如下：
123.反应组分浓度10x neb buffer1xrna酶抑制剂4u/μlcas12b蛋白1μmdna probe10μmhlyehec/sefa/tdh/ompw基因特异性的grna各1μm
124.利用可视化荧光检测仪器观察检测荧光。若在含hlyehec特异性的grna的crispr检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有大肠杆菌o157:h7；若在含sefa特异性的grna的crispr检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有沙门氏菌；若在含tdh特异性的grna的crispr检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有副溶血性弧菌；若在含ompw特异性的grna的crispr检测腔中观察到荧光，则表示样本中含有霍乱弧菌。
125.上述pcr扩增反应试剂和四重crispr/cas12b检测试剂可以通过冻干或包埋的方法，预先放置于反应腔中。其中hlyehec/sefa/tdh/ompw基因特异性的grna分别放置于四个crispr检测腔中。

技术特征：
1.一种分流通道的分区式多重crispr核酸检测芯片，其特征在于：所述芯片内部沿顺时针或者逆时针的流通顺序依次设置一个加样腔(2)、一个核酸扩增腔(3)、两个或两个以上crispr检测腔(51/52/53)具体如下：包括一个加样腔(2)，用于加入、容纳待测样本溶液，加样腔(2)上端有一个与外界相通的开口作为加样口，待测样本溶液从加样口加入；包括一个核酸扩增腔(3)，位于加样腔(2)下方，用于待测样本溶液进行核酸扩增反应形成核酸扩增产物，核酸扩增腔(3)内预先置有核酸扩增试剂；包括两个或两个以上并联的crispr检测腔(51/52/53)，用于核酸扩增产物中两个或两个以上基因检测，crispr检测腔预先内置有目的基因crispr检测试剂；若干个crispr检测腔并行排布，通过各自的液体通道与前面的核酸扩增腔(3)汇合连通；包括与crispr检测腔数量一致的毛细管阀(81/82/83)，每个crispr检测腔均经一个毛细管阀和加样腔(2)的加样口连通，位于每个crispr检测腔面向核酸扩增腔(3)的相反一侧；在核酸扩增产物进入crispr检测腔之前作用是通气，在核酸扩增产物进入crispr检测腔之后作用是截留住腔内的核酸扩增产物；加样腔(2)和核酸扩增腔(3)之间、核酸扩增腔(3)和crispr检测腔之间、crispr检测腔和加样腔(2)的加样口之间均通过芯片内部的环形流道连通。2.根据权利要求1所述的一种分流通道的分区式多重crispr核酸检测芯片，其特征在于：所述芯片还包括一个混合腔(4)，处于核酸扩增腔(3)和crispr检测腔之间，使得核酸扩增腔(3)经混合腔(4)和多个crispr检测腔连通，混合腔(4)用于对核酸扩增产物进行混匀，确保进入后续不同crispr检测腔的核酸浓度均一。3.根据权利要求1所述的一种分流通道的分区式多重crispr核酸检测芯片，其特征在于：加样腔(2)和核酸扩增腔(3)之间、核酸扩增腔(3)和混合腔(4)、混合腔(4)和crispr检测腔之间、crispr检测腔和加样腔(2)的加样口之间均通过芯片内部的环形流道连通，构成一个环形循环流通。4.根据权利要求2所述的一种分流通道的分区式多重crispr核酸检测芯片，其特征在于：在核酸扩增腔(3)具有待测样本溶液时，所述的混合腔(4)高于核酸扩增腔(3)中所盛待测样本溶液的液面最高点。5.根据权利要求3所述的一种分流通道的分区式多重crispr核酸检测芯片，其特征在于：所述芯片还包括与crispr检测腔、毛细管阀(81/82/83)数量一致的气体通道结构(71/72/73)，每个crispr检测腔均经各自的一个毛细管阀(81/82/83)、气体通道结构(71/72/73)后和加样腔(2)的加样口连通，气体通道结构(71/72/73)位于每个crispr检测腔面向核酸扩增腔(3)的相反一侧。6.根据权利要求1或2所述的一种分流通道的分区式多重crispr核酸检测芯片，其特征在于：所述的毛细管阀替换为以沿l形路径呈u形弯折的毛细通道。7.根据权利要求1所述的一种分流通道的分区式多重crispr核酸检测芯片，其特征在于：所述的核酸扩增腔(3)、crispr检测腔(51/52/53)外侧设有用于加热的温控装置。8.应用于权利要求1-7任一所述分区式多重crispr核酸检测芯片的多重crispr核酸检
测方法，其特征在于：方法包括：s1、在核酸扩增腔(3)中预先添加包埋或冻干的核酸扩增试剂，在crispr检测腔预先添加包埋或冻干的crispr检测试剂，且不同crispr检测腔预先添加用于不同基因检测的crrna；s2、将待测样本溶液从加样腔(2)的加样口加入，进而进入到核酸扩增腔(3)内和核酸扩增腔(3)内的核酸扩增试剂混合进行核酸扩增反应；s3、核酸扩增反应结束后，在核酸扩增腔(3)内获得核酸扩增产物的溶液，将芯片的基准面(1)旋转固定角度，使得crispr检测腔被旋转到芯片的底部，在重力的作用下，核酸扩增产物溶液在液体通道(62、63、64)交汇点分流，从核酸扩增腔(3)进入到若干个crispr检测腔中，且在毛细管阀处停止流动；核酸扩增产物溶液和crispr检测腔内的crrna混合进行特异性结合反应；s4、最后根据特异性结合反应的结果判断待测样本溶液中是否含有基因。9.应用于权利要求1-8任一所述crispr核酸检测芯片的crispr核酸检测方法，其特征在于：方法包括：s1、在核酸扩增腔(3)中预先添加包埋或冻干的核酸扩增试剂，在crispr检测腔预先添加包埋或冻干的crispr检测试剂，且不同crispr检测腔预先添加用于不同基因检测的crrna；s2、将待测样本溶液从加样腔(2)的加样口加入，进而进入到核酸扩增腔(3)内和核酸扩增腔(3)内的核酸扩增试剂混合进行核酸扩增反应；s3、核酸扩增反应结束后，在核酸扩增腔(3)内获得核酸扩增产物的溶液，将芯片的基准面(1)旋转固定角度，使得混合腔(4)被旋转到芯片的底部，核酸扩增腔(3)内的核酸扩增产物的溶液在重力的作用下经芯片内部的流道(61)流入到混合腔(4)中，使得核酸均匀分布于溶液中；s4、在核酸扩增产物的溶液进入到混合腔(4)被混匀后，将芯片继续旋转固定角度，使得crispr检测腔被旋转到芯片的底部，在重力的作用下，混匀后的核酸扩增产物溶液在液体通道(62、63、64)交汇点分流，从混合腔(4)进入到若干个crispr检测腔中，且在毛细管阀处停止流动；核酸扩增产物溶液和crispr检测腔内的crrna混合进行特异性结合反应；s5、最后根据特异性结合反应的结果判断待测样本溶液中是否含有基因。

技术总结
本发明公开了一种分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片和方法。加样腔加入容纳待测样本溶液，上端有通外界的加样口；核酸扩增腔在加样腔下方且内有核酸扩增试剂；多个CRISPR检测腔并联用于多个基因检测，经液体通道与核酸扩增腔汇合连通；CRISPR检测腔经毛细管阀和加样口连通，加样腔、核酸扩增腔、CRISPR检测腔之间、加样腔间通过环形流道连通。本发明可快速有效地实现多种核酸在一个反应体系中同时扩增，仅一次扩增实现多个基因在一扩增腔中同步扩增，并利用多重多个基因一体化集成检测，互不干扰，简化了多种核酸检测的操作和流程并提升了检测结果准确度，避免了大量的移液和混匀操作，省时省力。省时省力。省时省力。


技术研发人员：吴坚 朱媛媛
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/7/28