高热稳定性的单链甜蛋白的突变体及基因

1.本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及高热稳定性的单链甜蛋白的突变体、基因及工程菌。


背景技术：

2.甜味剂已日益成为人类饮食的重要组成部分，但是过量的糖摄入会导致一些疾病，如糖尿病、肥胖和代谢综合征，人们对上述健康问题的关注增多，对健康食品的需求也日益增加，因此，寻找一种安全高效的甜味剂对食品医药领域具有重要意义。
3.天然的甜味蛋白monellin最初是从一种非洲植物dioscoreophyllum umminsii的浆果中分离而来的小分子植物蛋白，具有安全健康、低热量、高甜度及高营养、可吸收的独特优点，由两条链(a和b，分别由44和50个氨基酸组成)组成，两条链通过共价键链接，但该天然植物甜蛋白monellin产量低、热稳定性差等，限制了其商业化生产和应用。
4.通过蛋白质工程创建的单链甜蛋白(简称mnei，seq id no.1)将两条天然链结合成一条链以提高其热稳定性，其与天然的甜味蛋白具有相似的空间结构，但在高温等极端条件下仍不稳定，限制其进一步应用。
5.蛋白质的稳定性可以通过蛋白质的变性温度作为可视化指标来表征，变性温度tm越高，蛋白质的稳定性就越好。2015年发表在curr protoc protein sci的一项实验技术——thermal shift assay，可用于快速、高效地比较蛋白质的稳定性。蛋白质通常以native状态存在，加热会导致蛋白质转化为denatured状态，暴露出疏水基团。暴露出的疏水基团可以与荧光染料sypro orange相结合，从而提高荧光染料的发射光，于是可以通过检测荧光强度来反映蛋白质的稳定性。
6.甜蛋白目前已成功表达于各种表达系统，在多种表达系统中，大肠杆菌表达系统被认为是最简单和成本最低的生产系统。
7.目前，亟需高温条件下稳定的甜蛋白。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供高热稳定性的单链甜蛋白的突变体。
9.本发明的第二个目的是提供编码上述高热稳定性的单链甜蛋白的突变体的基因。
10.本发明的第三个目的是提供包含上述基因的重组表达载体。
11.本发明的第四个目的是提供包含上述重组表达载体的工程菌。
12.本发明的第五个目的是提供上述高热稳定性的单链甜蛋白的突变体在制备食品甜味剂中的应用。
13.本发明的技术方案概述如下：
14.高热稳定性的单链甜蛋白的突变体，所述突变体是seq id no.1所示氨基酸序列的第5位异亮氨酸(i)突变为谷氨酸(e)，第23位的谷氨酸(e)突变为丙氨酸(a)，第26位的异
亮氨酸(i)突变为精氨酸(r)，第65位的酪氨酸(y)突变为异亮氨酸(i)，第83的甘氨酸(g)突变为精氨酸(r)和第90位的天冬酰胺(n)突变为天冬氨酸(d)。
15.编码上述高热稳定性的单链甜蛋白的突变体的基因。
16.包含上述基因的重组表达载体。
17.包含上述重组表达载体的工程菌。
18.上述高热稳定性的单链甜蛋白的突变体在制备食品甜味剂中的应用。
19.本发明的优点：
20.本发明基于结构分析和蛋白质稳定性计算辅助设计，对单链甜蛋白定点突变，获得了高热稳定性的单链甜蛋白的突变体，与单链甜蛋白相比，本发明的高热稳定性的单链甜蛋白的突变体的tm提高了19.4℃以上，并保持甜味。
附图说明
21.图1为单链甜蛋白(mnei)及高热稳定性的单链甜蛋白的突变体(简称为mut6-4)的sds-page(聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳)图。
22.图2为单链甜蛋白(mnei)及高热稳定性的单链甜蛋白的突变体(简称为mut6-4)的热稳定性测定结果。
23.图3为单链甜蛋白(mnei)及高热稳定性的单链甜蛋白的突变体(简称为mut6-4)进行100℃热处理1h的sds-page(聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳)图。
具体实施方式
24.本发明实施例可选用如下实验材料和试剂：
25.菌株与载体：大肠杆菌dh5α、大肠杆菌bl21(de3)、载体pet28a，均为市售。
26.酶与试剂盒：pcr试剂、dpni酶等购自takara公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自tiangen公司，protein thermal shift
tm
dye kit来自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
27.培养基配方：
28.大肠杆菌培养基(lb培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％nacl，余量为水。
29.lb-kana培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％nacl，50μg/ml硫酸卡那霉素，余量为水。
30.lb-kana平板：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％nacl，1.5％琼脂，50μg/ml硫酸卡那霉素，余量为水。
31.下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
32.实施例1
33.包含重组表达载体的工程菌的构建
34.大肠杆菌重组表达载体的构建
35.在蛋白质数据库(pdb)检索得到目标单链甜蛋白(pdb：1iv7)的三维结构，分析氨基酸序列(seq id no.1)，将该序列的第5位异亮氨酸(i)突变为谷氨酸(e)、第23位的谷氨酸(e)突变为丙氨酸(a)，第26位的异亮氨酸(i)突变为精氨酸(r)，第65位的酪氨酸(y)突变为异亮氨酸(i)，第83的甘氨酸(g)突变为精氨酸(r)和第90位的天冬酰胺(n)突变为天冬氨
酸(d)，其突变体名称、突变位点以及对应氨基酸序列见表1。
36.表1重组表达载体及大肠杆菌工程菌
[0037][0038]
seq id no.2序列由生物商业公司合成，具体是根据大肠杆菌密码子偏好性对单链甜蛋白的基因以及对高热稳定性的单链甜蛋白的突变体的核苷酸序列分别进行密码子优化，再分别插入到载体pet28a的ndei和bamhi酶切位点之间，分别得到重组表达载体pet28a-mnei和包含高热稳定性的单链甜蛋白的突变体的基因的重组表达载体pet28a-mut6-4，对应的重组表达载体见表1。
[0039]
将上述两种重组表达载体分别转入大肠杆菌bl21(de3)中，分别得到bl21(de3)-mut6-4和bl21(de3)-mnei工程菌。
[0040]
实施例2
[0041]
单链甜蛋白(mnei)及高热稳定性的单链甜蛋白的突变体(简称为mut6-4)的诱导和表达
[0042]
分别挑取实施例1获得的两种阳性工程菌单菌落，置于lb-kana培养基中，37℃，220rpm过夜培养，按照1:100的比例再转移至新鲜的lb-kana培养基中，培养至od
600
值在0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为0.5mm，16℃诱导培养16h。使用高速离心机4000rpm转速离心15min即可收集菌体，保存于-80℃冰箱。
[0043]
实施例3
[0044]
单链甜蛋白及高热稳定性的单链甜蛋白的突变体的纯化和保存
[0045]
(1)从-80℃冰箱取出菌体解冻，用20ml缓冲液a(50mm tris-hcl，150mm nacl，ph＝7.4)重悬菌体，加入200μl丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(pmsf)。
[0046]
(2)超声破碎，菌体破碎后4℃ 18000rpm离心30min，取上清加入到ni-nta亲和树脂重力柱中，重复流穿2次。
[0047]
(3)使用8倍柱体积的缓冲液a清洗柱，继续使用8倍柱体积的缓冲液b(50mm tris-hcl，150mm nacl，50mm咪唑，ph＝7.4)洗涤柱，去除未能结合的蛋白杂质。
[0048]
(4)最终用8倍柱体积的缓冲液c(50mm tris-hcl，150mm nacl，300mm咪唑，ph＝7.4)洗脱目的蛋白。
[0049]
(5)将目的蛋白浓缩至1ml，使用akta快速蛋白液相色谱仪和superdex 75 10/300column进行分子筛层析。根据a
280
紫外吸收检测值收取目的蛋白大小对应出峰位置的样
品。
[0050]
(6)用sds-page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定蛋白质的纯度，nanodrop i分光光度计测量蛋白浓度，液氮速冻保存至-80℃冰箱。
[0051]
实施例4
[0052]
单链甜蛋白及高热稳定性的单链甜蛋白的突变体的热稳定性检测
[0053]
为了获得最好的实验结果，整个实验过程在冰上进行。
[0054]
applied biosystems 7500快速实时定量pcr系统上可以快速、有效地比较单链甜蛋白和突变体的热稳定性差异
[0055]
(1)将protein thermal shift
tm
dye(1000x)稀释到8x。
[0056]
反应体系如表2所示：
[0057]
表2mnei和mut6-4的热稳定性检测反应体系
[0058][0059]
(2)将反应组分混合均匀后加入96孔检测板中，以1000rpm的转速离心1分钟。
[0060]
反应程序设置如表3所示：
[0061]
表3蛋白质的热稳定性检测反应程序
[0062][0063]
(3)导出excel数据，根据其曲线，如图2所示，通过一阶求导计算蛋白的熔点温度tm。通过计算mnei和mut6-4的熔点温度，mnei的tm为76.6℃，由于所用荧光定量pcr系统温度最高设置为99.9℃，高于此温度的荧光值无法检测，根据曲线我们可以得出mut6-4的tm提高至96℃以上，热稳定性改善显著。
[0064]
为了进一步表征突变体的热稳定性，将mnei和mut6-4的浓度稀释为0.5mg/ml，在100℃的高温下加热1h，然后将样品以14000rpm的转速离心20min，并取上清进行sds-page检测，结果如图3所示，上清中已经检测不到mnei，而mut6-4条带仍十分明显，表明其可耐受高温，具有良好的热稳定性。
[0065]
实施例5
[0066]
单链甜蛋白及高热稳定性的单链甜蛋白的的感官评价
[0067]
通过味觉测试来评估mnei及mut6-4的甜味活性。为了避免蛋白质的聚集，在测定
蛋白质浓度和稀释之前对蛋白质进行离心。评估人员分别对1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml的样品进行品尝，每次品尝1ml，测试后用蒸馏水冲洗口腔。
[0068]
经实验测定，mnei和mut6-4仍然保留甜味特性，其甜味阈值均可达到2.5μg/ml。
[0069]
seq no.1(mnei)
[0070]
geweiidigpftqnlgkfavdeenkigqygrltfnkvirpcmkktiyenegfreikgyeyqlyvyasdklfradisedyktrgrkllrfngpvppp
[0071]
seq no.2mut6-4(六个突变位点i5e/e23a/i26r/y65i/g83r/n90d)
[0072]
geweeidigpftqnlgkfavdeankrgqygrltfnkvirpcmkktiyenegfreikgyeyqlyviasdklfradisedyktrrrkllrfdgpvppp

技术特征：
1.高热稳定性的单链甜蛋白的突变体，其特征在于所述突变体是seq id no.1所示氨基酸序列的第5位异亮氨酸(i)突变为谷氨酸(e)、第23位的谷氨酸(e)突变为丙氨酸(a)，第26位的异亮氨酸(i)突变为精氨酸(r)，第65位的酪氨酸(y)突变为异亮氨酸(i)，第83的甘氨酸(g)突变为精氨酸(r)和第90位的天冬酰胺(n)突变为天冬氨酸(d)。2.编码权利要求1高热稳定性的单链甜蛋白的突变体的基因。3.包含权利要求2所述基因的重组表达载体。4.包含权利要求3所述重组表达载体的工程菌。5.权利要求1高热稳定性的单链甜蛋白的突变体在制备食品甜味剂中的应用。

技术总结
本发明公开了高热稳定性的单链甜蛋白的突变体及基因，所述突变体是SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第5位异亮氨酸(I)突变为谷氨酸(E)、第23位的谷氨酸(E)突变为丙氨酸(A)，第26位的异亮氨酸(I)突变为精氨酸(R)，第65位的酪氨酸(Y)突变为异亮氨酸(I)，第83的甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)和第90位的天冬酰胺(N)突变为天冬氨酸(D)，本发明基于结构分析和蛋白质稳定性计算辅助设计，对单链甜蛋白定点突变，获得了一种高热稳定性的单链甜蛋白的突变体，与单链甜蛋白相比，本发明的高热稳定性的单链甜蛋白的突变体的T


技术研发人员：刘斯 刘艳梅 叶升 关凤慧 许家钰
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/12