一种SOD1基因p.I151V突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型及构建方法

一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型及构建方法
技术领域
1.本发明涉及人类病症模型构建技术领域，特别的为一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型及构建方法。


背景技术：

2.肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，als)是一种神经系统疾病。支配肌肉运动的神经元慢慢变性、死亡,肌肉随之一点点萎缩,患者逐渐出现并加重肌无力、肌萎缩、吞咽困难、喝水呛咳以及说话不清等症状,逐渐失去运动能力和生活自理能力,直至死亡。尽管als的病理生理机制尚不完全清楚,但有关als的遗传因素影响已经得到广泛认可。大约5％～10％的als为fals,超过30种基因和fals有关。其中,最常见和研究最多的基因为als1(sod1)、als10(tardbp)、als6(fus)、ftdals1(c9orf72)等。
3.1993年sod1被发现与als发病密切相关，是该疾病的重要致病基因，这也是第一个发现的als风险基因。sod1突变可导致sod1编码蛋白的功能失常，造成其自身更容易发生类似aβ的聚集从而致病。sod1蛋白有154个氨基酸，分子量16kd。2018年之前已经发现了超过180种包括点突变、无义突变、移码突变等多种突变体存在。经典的突变包括d90a、i151v以及g93a等。
4.因此提供一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型及构建方法模拟人sod1基因p.i151v突变所致的肌萎缩侧索硬化症病理过程具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明提供的发明目的在于提供一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型及构建方法以解决上述问题。
6.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型，利用spg-abemax技术突变sod1基因p.i151v位点构建一对寡聚核苷酸链，在sod1基因靶位点处设计1个sgrna序列，合成一对寡聚核苷酸链制备sgrna表达载体，寡聚核苷酸序列为：
7.sgrna-f：gagtgagcctggagtagtagtt；
8.sgrna-r：tgtacacgcacgggtaattaag。
9.一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型的构建方法，包括以下步骤：
10.1)sgrna表达载体的构建：
11.将权利要求1合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链，使用bbsⅰ限制性核酸内切酶将puc57载体线性化，随后将酶切产物进行纯化回收，并将退火的sgrna连接到puc57载体上，进而完成puc57-sgrna载体的构建；
12.2)cas9mrna的合成：
13.cas9表达质粒经酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中；酶切37℃3h，核酸电泳后，使用普通dna琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；
14.3)受精卵的获取和显微注射：
15.注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混好cas9mrna与sgrna混合物注射到受精卵细胞质中；
16.4)受精卵的培养和发育：
17.将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，待其发育至桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中；
18.5)胚胎移植和模型种群的获得：
19.将胚胎移植到适龄母兔的输卵管内，待其自然生产，获得基因编辑动物模型；利用pcr及测序方法进行遗传鉴定；筛选纯合突变个体，并对其遗传及表型稳定性进行监测鉴定，表型稳定的疾病模型进行集中扩繁，获得可稳定传代的模型种群。
20.本发明提供了一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型及构建方法。具备以下有益效果：
21.利用spg-abema单碱基基因编辑技术构建sod1(p.i151v)点突变兔模型，能够有效模拟人sod1(p.i151v)点突变型als病理过程，有助于探究sod1基因突变对于动物神经发育的具体调控作用及影响因素，增强对sod1生物学功能的了解,为临床上预防和诊疗als疾病奠定相关的理论基础，提供新的思路和方法；能更有效地测试新药和新诊断标记物等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。
附图说明
22.图1是本发明sgrna的设计示意图；
23.图2是本发明获得的f0代sod1基因p.i151v点突变兔照片；
24.图3是本发明方法获得的f0代sod1(p.i151v)点突变兔模型基因突变情况的sanger测序图；
25.图4是f0代sod1(p.i151v)点突变兔模型第一肌电检测图；
26.图5是f0代sod1(p.i151v)点突变兔模型第二肌电检测图；
27.图6是f0代sod1(p.i151v)点突变兔模型病理分析第一组织图；
28.图7是f0代sod1(p.i151v)点突变兔模型病理分析第二组织图；
29.图8是本发明构建的基因序列表。
具体实施方式
30.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做出进一步的描述：
31.构建一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型。
32.1)spg-abemax单碱基编辑系统sgrna设计和表达载体的构建：
33.在sod1基因靶位点处设计1个sgrna序列，如图1、seqno.1所示，合成一对寡聚核苷酸链用于制备sgrna：
34.sgrna-f：taggggcgatcccaatgacaccac；
35.sgrna-r：aaacgtggtgtcattgggatcgcc；
36.该sgrna的寡聚核苷酸链选取原则：选取突变碱基位置在5或6位的一条寡聚核苷酸链。合成的寡聚核苷酸经退火(95℃5min后置于室温冷却)，连入经bbsⅰ酶切后回收的puc57-sgrna表达载体，完成sgrna载体构建，如seqno.1所示，通过测序验证片段连接正确，进行克隆，扩大培养后提取质粒备用，以作为体外转录模板。
[0037][0038]
酶切37℃3h，核酸电泳后，使用普通dna琼脂糖胶回收试剂盒(购于天根公司，北京，中国)进行回收。
[0039]
cas9表达质粒(addgene，实验室购买)，经酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板，用于体外转录。cas9mrna的合成由试剂盒rneasy mini kit(qiagen,no.74104)在体外作用t7rna聚合酶来完成，sgrna的体外合成由试剂盒mirneasy mini kit(qiasgen,no.217004)在体外利用t7rna聚合酶完成；
[0040][0041]
酶切37℃3h，核酸电泳后，使用普通dna琼脂糖胶回收试剂盒(购于天根公司，北京，中国)进行回收；
[0042]
2)受精卵的获取和显微注射
[0043]
注射卵泡刺激素(fsh)，之后注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)(购于宁波第二激素厂)，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混好cas9mrna与sgrna混合物注射到受精卵细胞质中(cas9mrna终浓度为150ng/μl，sgrna终浓度为30ng/μl)；
[0044]
3)受精卵的体外培养和发育
[0045]
将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，待其发育至桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；
[0046]
4)胚胎sod1基因突变情况鉴定
[0047]
(1)胚胎裂解
[0048]
胚胎裂解试剂为np40，裂解条件为：56℃1h；95℃10min；
[0049]
(2)dna测序鉴定胚胎基因型突变情况
[0050]
提取dna，提取方法按照组织基因组提取试剂盒说明书进行操作(购于天根公司，
北京，中国)，进行pcr，电泳鉴定，并进行dna测序，得到基因型鉴定结果；
[0051]
①
胚胎裂解：胚胎裂解试剂为np40，裂解条件为：56℃，1h；95℃，10min；
[0052]
②
dna测序鉴定胚胎基因型突变情况：提取dna，进行pcr，核酸电泳鉴定，并进行dna测序，得到基因型鉴定结果；
[0053]
a、设计pcr引物如下：
[0054]
上游引物：gagtgagcctggagtagtagtt；
[0055]
下游引物：tgtacacgcacgggtaattaag；
[0056]
b、pcr反应体系如下：
[0057][0058][0059]
c、pcr反应条件：
[0060]
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸5min；
[0061]
③
pcr产物进行测序，测序结果在sod1基因引物设计的打靶位点出现完全突变或者不完全突变的情况，样本则为基因突变。测序结果在sod1基因引物设计的打靶位点附近出现双峰的情况，选择双峰的样品再次pcr，产物胶回收后连接至pgm-t载体，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，测序结果中在sod1基因靶位点附近发生碱基插入或碱基缺失，导致阅读框移码突变，样本则为基因敲除；
[0062]
5)胚胎移植
[0063]
将注射的受精卵移植到同期发情的适龄母兔两侧输卵管内，每侧约20枚，对代孕母兔进行规范化饲养，提供合理充足的饮食与稳定清洁的饲养环境，待其妊娠结束自然生产，获得f0代基因编辑动物模型。
[0064]
验证例1
[0065]
sod1基因人源化点突变兔脑瘫疾病模型基因型分析与表型鉴定：
[0066]
1)dna测序鉴定兔脑瘫疾病模型的基因型
[0067]
提取组织dna，提取方法按照组织基因组提取试剂盒说明书进行操作(天根，北京，中国)，进行pcr，核酸电泳鉴定，并进行dna测序，得到基因型鉴定结果。
[0068]
a、设计pcr引物如下：
[0069]
上游引物：gagtgagcctggagtagtagtt；
[0070]
下游引物：tgtacacgcacgggtaattaag；
[0071]
b、pcr反应体系如下：
[0072][0073]
c、pcr反应条件：
[0074]
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸5min；
[0075]
pcr产物进行测序，测序结果在sod1基因引物设计的打靶位点出现完全突变或者不完全突变的情况，样本则为基因突变。测序结果在sod1基因引物设计的打靶位点附近出现双峰的情况，选择双峰的样品再次pcr，产物胶回收后连接至pgm-t载体，转化后挑取阳性克隆再次进行测序，测序结果中在sod1基因靶位点附近发生碱基插入或碱基缺失，导致阅读框移码突变，样本则为基因敲除；
[0076]
如图2所示，得到了sod1(p.i151v)f0代基因编辑兔；
[0077]
如图3所示dna测序结果可得到：f0代个体均发生不同的突变情况；
[0078]
图4-5是f0代sod1(p.i151v)点突变兔模型进行肌电检测图，可以看到突变组存在静息电位不稳定，存在正锐波和纤颤。运动单元电位存在多项波。
[0079]
2)兔生理学分析
[0080]
在第12周，我们利用肌电仪对als疾病模型兔神经元电传导及表面肌电信号进行检测，结果表明als疾病模型兔左右两侧腓肠肌静息电位不稳定，存在正锐波和纤颤；运动单元电位存在多项波，双侧腓总神经神经传导速度显著降低，波形振幅上升，时限增长，多相增加，符合人类肌萎缩侧索硬化症肌电图的临床症状。
[0081]
3)兔病理学分析
[0082]
观察兔头部、骨骼、四肢等重要部位或组织是否发生病变；突变兔在生长过程中，出现死亡的个体，解剖观察脊髓及肌肉病变情况，固定组织，做组织病理切片；如图6-7所示，可见sod1(p.i151v)兔存在脊髓神经细胞退化，后肢肌肉存在肌束萎缩；
[0083]
图8中seqno.1为兔sod1基因cds区序列，红色下划线标注为设计位置，seqno.2为puc57-sgrna1序列，斜体下划线标注为sgrna一条寡聚核苷酸链。
[0084]
结论：本发明成功构建sod1(p.i151v)碱基编辑兔模型，其具有典型的肌萎缩侧索硬化症症状，与人类临床病例结果相一致，本发明构建的模型准确可靠。
[0085]
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限定本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型，其特征在于，利用spg-abemax技术突变sod1基因p.i151v位点构建一对寡聚核苷酸链，在sod1基因靶位点处设计1个sgrna序列，合成一对寡聚核苷酸链制备sgrna表达载体，寡聚核苷酸序列为：sgrna-f：gagtgagcctggagtagtagtt；sgrna-r：tgtacacgcacgggtaattaag。2.一种sod1基因p.i151v突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)sgrna表达载体的构建：将权利要求1合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链，使用bbsⅰ限制性核酸内切酶将puc57载体线性化，随后将酶切产物进行纯化回收，并将退火的sgrna连接到puc57载体上，进而完成puc57-sgrna载体的构建；2)cas9mrna的合成：cas9表达质粒经酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中；酶切37℃3h，核酸电泳后，使用普通dna琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；3)受精卵的获取和显微注射：注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混好cas9mrna与sgrna混合物注射到受精卵细胞质中；4)受精卵的培养和发育：将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，待其发育至桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中；5)胚胎移植和模型种群的获得：将胚胎移植到适龄母兔的输卵管内，待其自然生产，获得基因编辑动物模型；利用pcr及测序方法进行遗传鉴定；筛选纯合突变个体，并对其遗传及表型稳定性进行监测鉴定，表型稳定的疾病模型进行集中扩繁，获得可稳定传代的模型种群。

技术总结
本发明提供一种SOD1基因p.I151V突变的人源肌萎缩侧索硬化症兔模型及构建方法，利用SpG-ABEmax技术突变SOD1基因p.I151V位点构建一对寡聚核苷酸链，在SOD1基因靶位点处设计1个sgRNA序列，合成一对寡聚核苷酸链制备sgRNA表达载体。本发明利用SpG-ABEma单碱基基因编辑技术构建SOD1(p.I151V)点突变兔模型，能够有效模拟人SOD1(p.I151V)点突变型ALS病理过程，有助于探究SOD1基因突变对于动物神经发育的具体调控作用及影响因素，增强对SOD1生物学功能的了解,为临床上预防和诊疗ALS疾病奠定相关的理论基础，提供新的思路和方法；能更有效地测试新药和新诊断标记物等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。研究提供基础模型。研究提供基础模型。


技术研发人员：李占军 宋宇宁 赖良学 王东旭
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2022.07.12
技术公布日：2023/7/31