用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株

用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株
技术领域
1.本发明属于疫苗制备技术领域，尤其是一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株。


背景技术：

2.疫苗免疫是水生动物病毒病防治最有效的手段，已有灭活疫苗、亚单位疫苗、dna疫苗和弱毒活疫苗等，免疫方式有注射免疫和浸泡免疫，其中浸泡免疫因操作简单、效率高、成本低且对水生动物损害小等被认为是最具有实用性的免疫方式。由于浸泡免疫对毒株量的需求远远高于注射免疫，故现有活疫苗、亚单位疫苗、dna疫苗等均只能采用注射免疫接种的方式，只有部分弱毒活疫苗可采用浸泡免疫，这也是弱毒活疫苗的优势之一。但是，弱毒活疫苗的缺点是弱毒株的毒力易返强，故体内传代后毒力不返强且对细胞系敏感（产生较高毒株量）的弱毒株是制备弱毒活疫苗且实现浸泡免疫的必要条件。
3.鲫鱼是我国淡水养殖的常见鱼种，约占淡水鱼总养殖产量的12%。鲤疱疹病毒ⅱ型（cyprinid herpesvirus 2, cyhv-2）感染鲫鱼而引起的鲫造血器官坏死病，其传染性强，致死率高达90-100%，针对鲫造血器官坏死病，目前已有相关疫苗研究。中国专利申请号为202010183827.6的发明专利申请，公开了一种鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株及其应用，所述鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株是分离自白鲢的鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株cyhv-2dx2019，作为鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒疫苗的应用。然而，该专利申请说明书（0018-0027）记载，cyhv-2 dx2019接种鲫脑组织细胞（gicb）连续盲传10代培养，在该感染过程中细胞不出现典型的病变效应，仅对盲传第10代接毒细胞的培养物进行病毒dna扩增，证明盲传第10代接毒细胞中含有鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株cyhv-2 dx2019，采用pcr技术确定病毒浓度≥5
×
105copies/ml。说明鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株cyhv-2 dx2019对鲫脑组织细胞（gicb）系不敏感，很难做到大规模培养毒株。因此，以鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株cyhv-2dx2019制备的疫苗只能通过腹腔注射免疫方式刺激鱼体产生免疫应答，且最小剂量注射免疫保护率只能达到92.85%。


技术实现要素：

4.本发明是为了解决现有技术所存在的问题，提供一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株。所述鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株（cyprinid herpesvirus2, cyhv-2），已于2022年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址：北京市朝阳区大屯路甲3号；保藏编号：cgmcc no: 24099。
5.本发明的技术解决方案是一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株，是鲤疱疹病毒ⅱ型（cyprinid herpesvirus 2, cyhv-2）g-rp7，保藏编号是cgmcc no.24099。
6.本发明提供的鲤疱疹病毒ⅱ型g-rp7是分离自金鱼的鲤疱疹病毒ii型弱毒株，以该弱毒株感染金鱼鳍条细胞系（ryuf-2），4-5天后观察细胞出现典型的细胞病变效应（cpe）且连续传代均能稳定引起细胞病变，对ryuf-2细胞系敏感，实现弱毒株体外稳定培养与扩
增，reed-muench法测定病毒悬液的tcid
50
可达10
5.9
/ml，同时该弱毒株经体外和体内连续传代后不出现毒力返强。可用于制备鲫造血器官坏死病疫苗，浸泡免疫和腹腔注射免疫均可刺激鱼体产生特异性免疫应答，具有良好抗鲤疱疹病毒ii型感染的效果，其中注射免疫保护率高达100%，明显高于现有技术注射免疫保护率；浸泡免疫在最小免疫量研究中发现，当病毒悬液tcid
50
为2
×
102/ml时，免疫保护率可达94%，在免疫途径优于注射免疫情况下，免疫保护率也高于现有技术注射免疫保护率。
附图说明
7.图1是本发明实施例光学显微镜下的正常ryuf-2细胞和接种g-rp7后出现细胞病变图。
8.图2是本发明实施例不同免疫浓度下对异育银鲫的保护率示意图。
9.图3是本发明实施例g-rp7浸泡免疫21天后病毒抗体水平（elisa）示意图。
10.图4是本发明实施例g-rp7注射免疫21天后病毒抗体水平（elisa）示意图。
11.保藏日期：2022年1月17日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc；地址：北京市朝阳区大屯路甲3号；保藏编号：cgmcc no: 24099。
具体实施方式
12.1. 鲤疱疹病毒ii型g-rp7株的分离鉴定和培养（1）鲤疱疹病毒ii型g-rp7株的分离鉴定本发明中的鲤疱疹病毒ii型g-rp7株来源于患病的金鱼。取患病濒死金鱼肾脏组织经含有1%青霉素-链霉素-两性霉素b混合溶液的m199培养基清洗后，进行匀浆，匀浆液12,000 rpm/min离心10 min，取上清经0.22 μm滤膜除菌后，接种于鎏金金鱼的鳍条细胞ryuf-2中，25℃条件下，培养于添加5%胎牛血清和1%三抗（青霉素、链霉素和庆大霉素）m199培养基中。持续观察细胞病变，于10天后收集细胞培养上清（细胞培养物），储存于-80oc。该细胞培养物用引物cyhv-2hel-f：5
’‑
ggggacttgcgaagagtttgatttctac-3’和cyhv-2hel-r：5
’‑
ccatagtcaccatcgtctcatc-3’进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果显示约为360bp，与鲤疱疹病毒ii型阳性目的片段条带大小一致，序列比对结果表明其为cyhv-2序列。
13.（2）鲤疱疹病毒ii型g-rp7株的培养将保存于-80oc的细胞培养物，室温融化后取100 μl，接种于长有单层ryuf-2细胞的25cm3细胞培养瓶中，于血清浓度为5%的m199培养基中培养，光学显微镜下每日观察细胞病变效应，结果如图1a、b所示，图1a是正常的ryuf-细胞光学显微镜下图；图1b是接种 g-rp7株后5天细胞光学显微镜下图。结果表明：接种g-rp7株后5天ryuf-细胞出现明显细胞病变。收集培养物，如此反复传代10次，均能稳定出现细胞病变。将各传代细胞培养物收集后，经pcr验证、序列比对表明鲤疱疹病毒ii型g-rp7株可在ryuf-2中稳定扩增，并产生明显的细胞病变。reed-muench法测定各代培养获得病毒悬液的tcid
50
为10
3.9-5.9
/ml。
14.2. 鲤疱疹病毒ii型g-rp7株对异育银鲫致病性及保护率实验
取300尾异育鲫鱼，平均体重52.0
±
5.0g，平均体长16.0
±
2.0cm。实验前，鲫鱼需进行病毒核酸检测，确认为鲤疱疹病毒ii型阴性。按照免疫方式随机将鲫鱼平均分为浸泡免疫和腹腔注射免疫。每种免疫方式分别设置g-rp7实验组和m199对照组；各实验组和对照组再分别设置观察组（记录存活率）和攻毒组（计算保护率）。其中浸泡免疫使用的cyhv-2 g-rp7株的tcid
50
为102/ml，25℃下浸泡2 h后循环水中饲养；注射免疫使用的cyhv-2 g-rp7株的tcid
50
为103/ml，每尾腹腔注射100
µ
l，循环水中饲养。免疫21天后，对存活鱼进行攻毒并记录各组存活率，结果如表1所示：表1： cyhv-2 g-rp7株安全性、保护率结果结果表明：cyhv-2 g-rp7株浸泡免疫和注射免疫组，25天内其存活率高达100%，21天后攻毒实验结果显示浸泡免疫和注射免疫的保护率分别为92%和100%。
15.至此，本发明获得了一株在ryuf-2中稳定增殖且对异育银鲫无致病性的鲤疱疹病毒ii型弱毒株。所述毒株于2022年1月17日送至中国菌种保藏中心，分类命名：鲤疱疹病毒ⅱ型g-rp7株，保藏编号：cgmcc no: 24099, 地址：北京市朝阳区大屯路甲3号。
16.3. 鲫造血器官坏死症弱毒活疫苗的制备将cyhv-2 g-rp7于ryuf-2细胞中培养获得病毒悬液，接种于长有单层ryuf-2细胞的75cm3的细胞培养瓶中，待出现50%以上细胞病变后，培养物于-80℃冷冻后室温融化，如此反复冻融3次，随后在4 ℃条件下，4000 rpm/min离心 30 min。应用reed-muench法测定收集的病毒悬液的浓度，以m199培养基稀释制备成鲫造血器官坏死病弱毒疫苗，疫苗含鲤疱疹病毒ii型g-rp7株，其tcid
50
为104/ml。
17.4. 鲫造血器官坏死病弱毒活疫苗的应用(1) 鲫造血器官坏死病活疫苗最小免疫量的研究将上述制备的鲫造血器官坏死病弱毒活疫苗，分别稀释至浓度为2
×
100/ml tcid
50
、2
×
101/ml tcid
50
、2
×
102/ml tcid
50
，每组30尾鱼，25℃浸泡免疫2 h，免疫后21天攻毒，计算保护率，结果如图2所示。
18.结果表明cyhv-2 g-rp7含量为2
×
102/ml tcid
50
免疫保护率为94%，随着疫苗浓度的降低保护率也随之降低。
19.(2) 鲫造血器官坏死病活疫苗引起异育银鲫体液免疫应答报告将上述制备的鲫造血器官坏死病弱毒活疫苗稀释相应浓度后分别注射（103/ml tcid
50
）免疫和浸泡 （102/ml tcid
50
）免疫接种异育银鲫，21天后每组各取20尾鱼，应用抗鲫鱼igm
+
特异性单克隆抗体，通过间接酶联免疫反应实验（elisa）测定注射免疫和浸泡免疫两种方式中受免疫鲫鱼血清中抗病毒抗体水平，其中未免疫鱼作为阴性对照。结果分别如图3、图4所示。
20.结果表明：g-rp7浸泡免疫和注射免疫组抗病毒抗体水平均高于阴性对照组，相较于浸泡免疫，注射免疫组抗体水平升高更为显著。
21.(3) 鲫造血器官坏死症活疫苗毒力返强评价报告
①
鲤疱疹病毒ⅱ型g-rp7体外传代实验在25 cm3细胞培养瓶中，用含有5%胎牛血清和1%三抗的m199培养基培养金鱼鳍条细胞系（ryuf-2），待细胞长成单层后（24 h-48 h），每瓶加入0.1 ml上述-80℃冷冻保存的cyhv-2g-rp7株（记为p1）。放入25℃恒温培养箱中培养4-6天后，细胞出现典型的细胞病变（cpe），收集培养物，在4℃下4000 rpm离心30 min，收集上清，于-80℃保存，记为p2。再将p2接种到ryuf-2中，反复上述操作15次后，取p1、p5、p10、p15均稀释至103/ml tcid
50
注射鲫鱼，每组30尾，每尾0.1 ml；连续观察21天并纪录存活率。免疫21天后，对p1、p5、p10、p15进行腹腔注射攻毒，连续观察25天，记录感染情况和存活率。
22.结果如表2所示。
23.表2鲫造血器官坏死症弱毒活疫苗体外传代安全性及保护率。
24.结果表明：g-rp7株作为弱毒疫苗可以在ryuf-2中稳定传代，传代后其对鲫鱼仍无致病性，免疫21天后的攻毒保护率均为100%。
25.②
鲤疱疹病毒ⅱ型g-rp7体内传代实验将上述制备的鲫造血器官坏死症弱毒活疫苗稀释至tcid
50
为103/ml， 注射免疫健康的异育鲫鱼，注射剂量为0.1 ml/尾，其中20尾用于观察感染情况并计算存活率；其中5尾在接种后第5天取免疫鱼的脾和肾混合研磨，约每0.1 g 组织匀浆加入1 ml m199培养基，4℃下4000rpm离心30 min，吸取上清后，用0.22 μm的滤膜过滤；该组织匀浆上清液注射到新一组的健康鲫鱼体内；反复上述操作5次，将注射弱毒活疫苗的鲫鱼记为p1，其余各组依次为p2、p3、p4、p5、p6，结果如表3所示。
26.表3鲫造血器官坏死症弱毒活疫苗在体内传代的存活率结果表明：上述p1、p2、p3、p4、p5、p6经过体内传代后，毒力均未出现明显返强。

技术特征：
1.一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒ⅱ型弱毒株，其特征是鲤疱疹病毒ⅱ型（cyprinid herpesvirus2, cyhv-2）g-rp7，保藏编号是cgmcc no.24099。

技术总结
本发明公开一种用于制备鲫造血器官坏死病疫苗的鲤疱疹病毒Ⅱ型弱毒株，是鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）G-RP7，保藏编号是CGMCC No.24099。以该弱毒株感染金鱼鳍条细胞系（RyuF-2），4-5天后观察细胞出现典型的细胞病变效应（CPE）且连续传代均能稳定引起细胞病变，对RyuF-2细胞系敏感，实现弱毒株体外稳定培养与扩增，Reed-Muench法测定病毒悬液的TCID


技术研发人员：魏畅 李强 乔帼 孙雨雨 徐超楠
受保护的技术使用者：盐城工学院
技术研发日：2022.10.26
技术公布日：2023/7/31