用于治疗阿兹海默症的医药组合物的制作方法

1.本发明关于一种用于治疗阿兹海默症的医药组合物，特别是关于一种具有能够高度表达脑啡肽酶、mir-29a、及/或mir-29b的表现型间质干细胞及/或所述高表现型间质干细胞所衍生的细胞外囊泡的医药组合物。


背景技术：

2.类淀粉蛋白沉积(amyloidosis)是一种后天或遗传性疾病，由各种组织中β折迭纤维状蛋白聚集体(beta-sheet fibrillar protein)的异常沉积引起。类淀粉蛋白沉积(amyloidosis)分类为原发型淀粉样变(primary amyloidosis,al)、次要型淀粉样变(secondary amyloidosis,aa)、遗传性淀粉样变(hereditary amyloidosis,attr)、原发型淀粉样变(al amyloidosis)。这种疾病可以是局部的或全身性的，淀粉样蛋白(amyloid)在神经、肝脏、肾脏、脾脏和血管等不同器官中积聚，引起不同临床症状，包含家族性淀粉样多发性神经病(familial amyloid polyneuropathy)、腱鞘炎(tenosynovitis)、家族性淀粉样变性(familial amyloidosis)、颅神经疾病(cranial nerve disease)、遗传性脑出血(hereditary cerebral hemorrhage)、遗传性海绵状脑病(heredity spongiform encephalopathy)、肾病(chronic dialysis disease)、耳聋、荀氏麻疹、四肢痛、心肌病、皮肤锯齿症、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、骨髓瘤依赖性淀粉样变性(myelomatosis dependency amyloidosis)、tiroidina骨髓癌(tiroidina bone marrow cancer)、早期/非遗传/遗传阿兹海默症(alzheimer’s disease,ad)、帕金森氏症(parkinson’s disease)、亨丁顿氏舞蹈症(huntington’s disease)、库贾氏症(creutzfeldt-jakob disease)、大脑类淀粉血管病变(cerebral amyloid angiopathy)、包涵体肌炎(inclusion body myositis)、黄斑变性(macular degeneration)、轻度认知障碍或轻度或中度认知障碍(mild cognitive damage or mild or moderate cognitive impairment)、与年龄相关的认知退化(the cognitive deterioration relevant with the age)、唐氏综合症(down's syndrome)、糖尿病(diabetes)、血管性痴呆(vascular dementia)、老年性痴呆(senile dementia)、aa型淀粉样变性(aa amyloidosis)、al型淀粉样变性(al amyloidosis)、血液透析相关性淀粉样变性或遗传性脑出血(hemodialysis-associated amyloidosis or heredity cerebral hemorrhage)等。
3.阿兹海默症(alzheimer’s disease,ad)是一种最常见的神经退行性疾病会导致一系列表型，包括记忆力减退和其他认知障碍，最终甚至会导致死亡。2020年全球约有5,000万人受到痴呆症的影响，预计于2050年将影响1.35亿人。阿兹海默症主要病理特征是细胞外淀粉样蛋白(beta amyloid,aβ)斑块聚集和细胞内tau蛋白过度磷酸化形成神经原缠结(neurofibrillary tangles,nfts)，导致突触丧失(synaptic loss)、皮质(cortex)和海马体神经元(hippocampus)通讯中断以及神经元死亡，进而影响记忆和学习能力受损。目前尚无有效的治疗手段或药物能够抑制淀粉样蛋白沉积(aβdeposition)、神经元死亡及记忆
力减退和认知障碍。
4.现今以减少神经炎症(reducing neuroinflammation)、氧化压力(oxidative stress)或给予生长因子来调节小胶质细胞(microglia)功能进行神经保护(neuroprotection)。然而，这些策略未能同时发挥神经保护和神经发生诱导功效(neurogenesis-inductive efficacy)。此外，血脑屏障(blood-brain barrier,bbb)会阻碍神经保护剂(neuroprotective agents)进入中枢神经系统(central nervous system,cns)。近年研究发现间质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)为治疗中枢神经系统疾病新选择。mscs可以归巢于损伤区域，并能分化为功能细胞直接替换受损细胞。同时，mscs具有易于分离(isolation)和扩增(expansion)、自我更新(self-renew)、多向分化(multilineage differentiation)、低免疫原性(low immunogenicity)和免疫调节(immunoregulation)的特性；此外，mscs移植已被证明可以减缓肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)病程(disease progression)进展，因此，推断mscs具有治疗神经退行性疾病的潜力。
5.然而，mscs的应用仍然主要受到它们从循环中快速清除以及损伤部位恶劣的微环境阻碍其生存的限制，进而发现mscs移植只能发挥短期作用，再加上，mscs的副作用(side effect)和安全性仍然具争议。目前研究显示mscs主要是通过旁分泌效应(paracrine effect)发挥修复作用。mscs会分泌多种生长因子、蛋白质、细胞激素(cytokine)脂质讯号分子(signaling lipids)、mrna和小分子核糖核酸(microrna,mirna)等生物活性分子，经由细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)携带至目标细胞(target cells)。evs是细胞与细胞间通讯(intercellular communication)的重要媒介，并参与调控生理过程和疾病的发生。与mscs相比，mscs衍生的evs(mscs-derived evs)不具有功能性的核心(functional nuclei)、不能复制(replicate)及不受控制地分裂(divide uncontrollably)，降低其分离和扩增过程中遗传破坏的风险，同时，mscs衍生的evs通过提供更高的安全性和更低的免疫原性，填补了无细胞疗法的希望，对免疫调节和再生具有相似的影响。因此，mscs衍生的evs将为用于疾病治疗的细胞移植的替代方案。
6.mscs衍生的evs为一异质(heterogeneous)颗粒，由原始细胞向外出芽(outward budding)或胞吐作用(exocytosis)形成，包括外泌体(exosome)和微囊泡(microvesicles,mvs)，是由细胞分泌具有磷脂双分子层(phospholipid bilayer)的纳米颗粒(nano-sized particles)。evs直径范围在30nm至1μm之间。evs富含四跨膜蛋白(tetraspanin proteins)于细胞表面上，主要为cd9、cd63和cd81和其他蛋白，如：alg-2interacting protein-x(alix)和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,tsg101)。alix又称programmed cell death 6interacting protein(pdcd6ip)是与escrt和endophilin-a蛋白结合的衔接蛋白(adaptor protein)。alix于神经元(neurons)表达，并在癫痫发作(epileptic seizures)期间时，集中于突触处(synapses)。tsg101和讯号传递转接分子(signal-transducing adaptor molecules)在外泌体生成(exosome biogenesis)和分泌扮演关键作用，已有研究发现在神经干细胞(neural stem cells)大量表达tsg101可以增加外泌体生成相关基因，进而提高外泌体分泌。evs可以促进细胞间通讯，包含bbb。根据研究显示，在阿兹海默症模式中，特定细胞会优先释放evs，其中部份的evs提供一定程度的神经保护(neuroprotection)。
7.然而，以细胞外囊泡作为治疗药物或药物递送平台的临床开发研究需要生产大量细胞外囊泡，且如何将药物或可改善疾病状态的基因封装至细胞外囊泡仍是一项挑战。迄今为止，这种情况阻碍了评估临床前疗效的研究，一般而言，支持一个完整的动物模型研究的外泌体生产可能需要几个月的时间。而分离外泌体的黄金标准(gold standard)通常需要四到五个连续的高速或超高速离心步骤，通过超速离心纯化所获得的外泌体为平均每细胞500-1,000个颗粒，而这些方法均不可扩展及回收率低。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种治疗阿兹海默症的医药组合物，是利用脂肪间质干细胞所衍伸的细胞外囊泡，在没有使用动物血清或异种动物材料、或者不含有任何异种动物性来源的衍生物的培养基中，于无异种成分(xeno-free)的细胞培养环境对脂肪间质干细胞进行培养，且能够大量且稳定地获得细胞外囊泡，例如，在一具体实施例中，富细胞外囊泡的产量为500～2,500个，为传统工艺的2至5倍，培养过程中还可利用纳米电穿孔技术(nanochannel electroporation,nep)，将脑啡肽酶的mrna、mir-29a、及/或mir-29b转染至细胞中，以提升治疗效果。
9.具体而言，本发明可以提供一种用于治疗阿兹海默症的医药组合物，其至少包含有细胞外囊泡，且所述细胞外囊泡的制备方法如下：第一培养步骤：将脂肪间质干细胞以6,000～15,000个细胞/cm2的细胞密度在一第一培养基中扩增培养，直到所述脂肪间质干细胞的扩增数量为培养前的90％以上；第二培养步骤：将扩增后的所述脂肪间质干细胞以10,000～100,000个细胞/cm2的细胞密度在一第二培养基中培养20～30小时；细胞外囊泡分离步骤：收集所述培养液并利用切向流过滤法(tff)或超滤法从所述培养液中分离出所述细胞外囊泡；其中所述第一培养基为包含有胎牛血清(fetal bovine serum)、n-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、抗坏血酸磷酸酯镁(l-ascorbic acid 2-phosphate)和keratinocyte-sfm培养基；以及所述第二培养基为包含有n-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、抗坏血酸磷酸酯镁(l-ascorbic acid 2-phosphate)和keratinocyte-sfm培养基。
10.根据本发明的一实施例，在所述第二培养步骤之后进一步包含有：基因转染步骤：将所述脂肪干细胞铺展在3d nep硅芯片表面上，细胞贴附后，并使用电穿孔系统以使用120-150v的方波脉冲电场、10ms的持续时间脉冲(pulses)5-15次，经由纳米通道将预先添加在pbs缓冲液中的质体(plasmid)注入单个细胞中，培养20～30小时候进行所述细胞外囊泡分离步骤。
11.根据本发明的一实施例，所述质体在pbs缓冲液中的浓度为在400-600ng/ml之间。
12.根据本发明的一实施例，所述质体为脑啡肽酶的mrna、mir-29a、及/或mir-29b。
13.根据本发明的一实施例，所述细胞外囊泡高度表达脑啡肽酶、mir-29a、及/或mir-29b。
14.根据本发明的一实施例，所述医药组合物经由鼻腔给药。
15.另外，本发明还可提供一种高表现型间质干细胞的培养方法，其包含有以下步骤：第一培养步骤：将脂肪间质干细胞以6,000～15,000个细胞/cm2的细胞密度在一第一培养基中扩增培养，直到所述脂肪间质干细胞的扩增数量为培养前的90％以上；第二培养步骤：
将扩增后的所述脂肪间质干细胞以10,000～100,000个细胞/cm2的细胞密度在一第二培养基中培养20～30小时；基因转染步骤：将所述脂肪干细胞铺展在3d nep硅芯片表面上，待细胞贴附后，并使用电穿孔系统以使用120-150v的方波脉冲电场、10ms的持续时间脉冲5-15次、经由纳米通道将预先添加在pbs缓冲液中的质体注入单个细胞中，培养20～30小时后获得高表现型间质干细胞；其中所述质体为脑啡肽酶的mrna、mir-29a、及/或mir-29b；以及所述高表现型间质干细胞高度表现脑啡肽酶、mir-29a、及/或mir-29b。
16.根据本发明的一实施例，所述高表现型间质干细胞及/或所述高表现型间质干细胞所衍生的细胞外囊泡可用于治疗阿兹海默症。
17.本发明还可提供上述高表现型间质干细胞的培养方法获得的高表现型间质干细胞，以及所述高表现型间质干细胞用于治疗阿兹海默症及/或类淀粉蛋白沉积的用途。
18.本发明还可提供上述医药组合物用于治疗阿兹海默症及/或类淀粉蛋白沉积的用途。
附图说明
19.图1a为显示实施例1中的经由adscs所衍生而得的evs的粒径分析图。
20.图1b和图1c分别为显示实施例1中的西方墨点法分析的结果图。
21.图2a和图2b为分别显示evs对于神经炎症的影响分析中no和tnf-α的含量比较图。
22.图3a至图3e为分别显示经鼻途径(in route)给药分析中的操作流程图、具有pkh26标记的对照组(pbs)或ev在小鼠体内的分布状态图、具有pkh26标记的对照组(pbs)或ev的在小鼠各器官內的分布状态图、小鼠体内的荧光量比较图、和小鼠器官的荧光量比较图。
23.图4a和图4b分别显示副作用分析中的操作时程图和小鼠体重变化比较图。
24.图5a至5f分别显示动物行为测试分析中小鼠的筑巢照片、评分示意图、筑巢测试分析中各组的评分比较图和巢重比较图、挖洞测试中各组在2小时内挖出的食物重量比较图和24小时内挖出的食物重量比较图。
25.图6a至6c分别显示在动物记忆测试分析中的测试示意图、总探索时间比较图、辨别指数比较图。
26.图7a和图7b分别显示app/ps1小鼠的aβ斑块负荷分析中皮质区局部增大图和全半球aβ斑块相对强度的定量比较图。
27.图8显示app/ps1小鼠的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生分析中的免疫组织化学染色结果，图8中的a显示通过免疫组化染色检测wt+pbs、wt+adsc-ev、app/ps1+pbs(ad+pbs)和app/ps1+adsc-ev(ad+adsc-ev)皮质中的活化星形胶质细胞与gfap(蓝色)和de2(aβ1-16，绿色)；图8中的b为通过gfap表达的蛋白质印迹分析对皮质裂解物进行分析。
28.图9a和9b分别显示app/ps1小鼠的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生分析中的免疫组织化学染色结果，图9a为显示wt+pbs、wt+adsc-ev、app/ps1+pbs(ad+pbs)和app/ps1+adsc-ev(ad+adsc-ev)的海马中激活的小胶质细胞通过免疫组织化学染色检测iba-1(红色)和de2(aβ1-16，绿色)，数据为平均值
±
sem，图9b为显示图9a量化数据结果。
29.图10a至10c分别显示透过活体经鼻给药对神经新生分析中齿状回内侧区(the sgz in dentate gyrus)的局部放大图、brdu阳性细胞的数量比较图、dcx阳性细胞的数量
比较图。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术特征及优点，能更为相关技术领域人员所了解，并得以实施本发明，在此配合所附的图式、具体阐明本发明的技术特征与实施方式，并列举较佳实施例进一步说明。以下文中所对照的图式，为表达与本发明特征有关的示意，并未亦不需要依据实际情形完整绘制。
31.本文中，本文所使用的所有技术及科学术语具有与一般熟习本发明所属技术者通常所理解的相同的含义。此外，除非另外明确地与上下文相矛盾，否则本文所使用的单数术语应包括复数形式且复数术语应包括单数形式。
32.虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考量而定。除了实施例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
33.为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对本发明实施态样与具体实施例提出说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
34.接着，以下以具体实施例和比较例来说明本发明。
35.《实施例1》
36.在本实施例分别采用了脂肪间质干细胞(adipose-derived stem cells,adscs)和脐带间质干细胞(wharton's jelly mesenchymal stem cells,wj-mscs)来获得细胞外囊泡。
37.将6,000～15,000个脂肪干细胞或脐带间质干细胞/cm2以包含有10wt％的胎牛血清(fetal bovine serum)、1-100mm的n-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、0.05-50mm的抗坏血酸磷酸酯镁(l-ascorbic acid2-phosphate)的keratinocyte-sfm培养基进行细胞培养5-14天，使细胞的数量扩增至10,000-100,000个，培养环境为温度控制在36.5-38.5℃，且含有5％二氧化碳的细胞培养箱中。
38.接着，利用磷酸盐缓冲生理盐水(dpbs)润洗细胞两次，再将干细胞以包含有1-100mm的n-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、0.05-50mm的抗坏血酸磷酸酯镁(l-ascorbic acid 2-phosphate)的keratinocyte-sfm培养基细胞培养24小时，培养环境为温度控制在36.5-38.5℃，且含有5％二氧化碳的细胞培养箱中。
39.收集培养完成后的培养液，以300g的离心速度在4℃的温度条件下进行离心5分钟，以去除培养液中的死细胞；接着收集上清液后再以2,000g的离心速度在4℃的温度条件
下进行离心20分钟，以去除细胞碎片，然后收集上清液以孔径为0.22μm滤网过滤，再利用不同的截留分子量(molecular weight cut off,mwco)的切向流过滤法(tff)或超滤法(amicon uf)从过滤后的培养液中分离出细胞外囊泡，并且利用纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis)确认细胞外囊泡的尺寸分布和浓度。
40.细胞外囊泡对于人神经母细胞瘤sh-sy5y app695细胞(sh-sy5yapp695)的影响
41.淀粉样斑块(amyloid plaque)是阿兹海默症病理学的标志之一。aβ由类淀粉前驱蛋白(amyloid precursor protein,app)经过酵素切割水解而成的。app经由α-分泌酶(α-secretase)作用生成从细胞表面释放的可溶性app(sappα)和ctfα。app经由β分泌酶(β-secretase)作用sappβ和ctfβ。γ-分泌酶(γ-secretase)可以直接或间接地产生各种序列长度的aβ胜肽，即aβ40和aβ42，其中aβ42疏水性(hydrophobic)更强，更容易聚集，产生神经毒性，导致神经变性和神经元死亡。aβ42和aβ40之间的相互作用通常被认为在阿兹海默症中起关键作用。增加的aβ42/aβ40比率似乎与由早老素突变引起的早发性家族性阿兹海默症病例相关。降低转基因小鼠的aβ42/aβ40比率可减少aβ沉积。根据研究指出aβ42/aβ40比率较高时，具有更高的神经毒性。
42.本实施例中所使用的sh-sy5yapp695细胞株如“yuan-hu zhi tong prescription mitigates tau pathology and alleviates memory deficiency in the preclinical models of alzheimer's disease”；front pharmacol.2020oct 30；11:584770.所示。人神经母细胞瘤sh-sy5y app695细胞过表达app695，可产生高水平的aβ，因此可被用作针对aβ堆积的药物筛选平台。在本实施例中，sh-sy5y app695细胞在添加了10％去外泌体胎牛血清、青霉素(100iu/ml)和链霉素(10μg/ml)的dmem/f12(gibco)培养基中于37℃、5％二氧化碳、以及湿度适宜的条件下生长，并通过g418抗生素筛选。接着，将sh-sy5yapp695细胞接种于24孔板24小时后更换新鲜培养基，并加入如表1所示的数量及来源的外泌体培养48小时。最后分析各组的细胞活性并收集上清液确认aβ1-40和aβ1-42表达程度(以elisa assay分析)，所得结果记录于表1中
43.表1
44.[0045][0046]
用不同的evs给予sh-sy5y-app695细胞发现在高剂量10^9个颗粒adscs-evs(n0.3)其细胞活性(cell viability)增加至132.2％，比低剂量5
×
10^8个颗粒adscs-evs(n0.2)比低剂量的104.3％高。此外，通过amicon uf分离纯化的evs比通过tff分离纯化的evs增强具有更高的细胞存活率(no.1v.s.no.2-3；no.1v.s.no.4-9和no.10-11)，基于amicon uf具有较低的渗透率，因此，它可以保持留高浓度的mscs分泌蛋白，mscs的分泌蛋白组(secretome)含有多种生长因子，如：内皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子-2(fgf-2)等，在细胞增殖和存活中发挥作用，因此，通过amicon uf分离纯化的evs组的细胞活性增加为evs加上其他分泌蛋白组的作用。
[0047]
此外，如表1所示，adsc衍生的evs组(no.1-3)、wj-mscs衍生的evs组(no.4-11)，其细胞外aβ1-40分别减少到50.4％、50.6％、72.0％、131.9％、142.5％、139.3％、137.8％、118.2％、126.4％、96.4％和92.5％；adsc衍生的evs组(no.1-3)、wj-mscs衍生的evs组(no.4-11)，其细胞外aβ1-42分别减少到68.5％、73.7％、49.1％、200.6％、205.2％、194.7％、228.9％、110.8％、139.0％、84.8％和84.3％，结果显示，相对于wj-mscs衍生的evs，adsc衍生的evs具有更好的降低细胞外aβ1-40和aβ1-42效果。而相对于amicon uf分离纯化方法，tff分离纯化方法在adsc衍生的evs组及wj-mscs衍生的evs组具有更好的降低细胞外aβ1-40和aβ1-42效果。如表1中在no.4-7(3kda)及no.8-9(100kda)发现由较低的载留分子量(molecular weight cut off,mwco)膜分离的evs显示降低细胞外aβ1-40和aβ1-42
效果较低，这些结果显示降低aβ是由evs而非secretome，由此可知adscs相对于wj-mscs为更好用于治疗阿兹海默氏症的evs来源，且tff分离纯化模式为更好evs分离方法，而以500kda载留分子量膜分离优于3kda及100kda。
[0048]
接着，分析不同adsc来源衍生的evs，并同时与wj-mscs衍生的evs作为比较，结果如表2所示。
[0049]
表2
[0050][0051][0052]
由表2的结果可知，在细胞活性上可以看到，在不同细胞密度下，干细胞衍生的evs皆有增加细胞活性的趋势，然而在清除aβ1-40及aβ1-42的效果则以自adscs#1来源衍生的evs最佳，且随着给予adscs#1来源衍生的evs剂量增加，效果愈显著。
[0053]
adscs#1年龄为20-70岁，同时不具有相关传染性病原或疾病(relevant communicable disease agents or diseases，rcsads)的风险，亦没有因异体移植传播疾病的风险；人类免疫缺乏病毒第一与第二型(hiv type 1&2)、b型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)、c型肝炎病毒(hepatitis c virus，hcv)、梅毒螺旋体(treponema pallidum)、人类传染性海绵样脑症(human transmissible spongiform encephalopathy，tse)等相关传染性病原或疾病测试结果，均为阴性或不反应性(non-reactive)。
[0054]
经由adscs所衍生而得的evs在经过纳米粒子追踪分析(nanoparticle tracking analysis)后可知，evs的平均粒径尺寸为124.1
±
2.8nm、众数粒径尺寸(mode size)为78.4
±
3.2nm，并且分布范围为在30nm至300nm，如图1a所示。另外，从西方墨点法分析(western blotting)的结果可知，经由adscs所衍生而得的evs具有cd81和cd9标记，而在开始培养前的培养基和利用tff分离纯化后通过的液体皆没有发现，如图1b所示，在图1b中，adsc-cm表示开始培养前的培养基、adsc-pt表示利用tff分离纯化后通过的液体、adsc-evs表示分离纯化后所得的细胞外囊泡。
3c)。经过24小时后，对实验小鼠实施安乐死并进行简单解剖以收集大脑、心脏、肺、肝脏、肾脏和脾脏以捕获ev的分布(图3d)。与肺(p《0.0001)和所有其他器官(p《0.0001)相比，发现pkh26标记的ev仍然存在并且主要分布在大脑中(图3d-3e)。这表明经鼻途径成功地将ev输送到中枢神经系统。
[0069]
动物实验-副作用分析
[0070]
将小鼠分为4组(n＝3-4)：用pbs处理的野生型c57bl/6小鼠(健康小鼠模型)(wt+pbs，n＝3)，用adsc衍生的ev处理的野生型(wt+adsc-evs，n＝4)，用pbs处理的app/ps1小鼠(ad小鼠模型)(app/ps1+pbs，n＝4)，用adsc衍生的ev处理的app/ps1小鼠(app/ps1+adsc-evs,n＝4)。ev(5
×
10^8颗粒/天)或pbs每天通过in途径递送，持续2周，剂量为24μl/小鼠(每个鼻孔12μl)，小鼠的两个鼻孔平均分为4轮，具体操作时程如图4a所示。
[0071]
在第0周至第4周的整个治疗期间，每周监测小鼠的异常行为活动和身体变化。各组小鼠给药部位均无病理变化，无炎症反应。此外，小鼠体重变化显示出显著变化(p《0.05)(如图4b所示)。总而言之，我们的数据表明，通过经鼻途径递送ev并未显示出对小鼠的不良副作用。
[0072]
动物实验-动物行为测试分析
[0073]
与认知缺陷相关的行为障碍是ad的标志之一。为了评估日常生活活动(adl)的表现，在ad小鼠模型中采用了挖洞和筑巢测试。为进行筑巢试验，在黑暗周期前1小时，将两只重5克的雏鸟放入笼中。第二天根据六分制的构造形状对巢进行评分(流程及评分标准如图5b所示)，每组建造的巢如图5a所示。
[0074]
筑巢测试方法：
[0075]
在黑暗周期前一小时，每只小鼠的笼子里都放了两个5g的雀巢。嵌套能力基于六分制的结构形状进行评分：0＝不受干扰；1＝受到干扰(但不清楚巢穴在笼子中的位置)；2＝平坦(难以识别巢壁)；3＝杯形巢(建筑巢壁比圆顶实际高度短两倍)；4＝不完整的圆顶(墙是圆顶高度的一半)；5＝完整的圆顶(圆顶的墙壁比预期高度的一半高)。
[0076]
挖洞测试方法：
[0077]
在黑暗期前2小时，将每只小鼠圈养在一个尺寸为42.5
×
26.6
×
18.5cm的单个聚砜笼中，笼子底部用玉米芯覆盖。将一个单端密封圆筒(由塑料制成，尺寸为20
×
7厘米)放入笼中，并填充230克普通食物颗粒。进行测试两小时后，称量留在圆筒中的食物颗粒。次日重复此步骤(至少16小时后)。
[0078]
app/ps1小鼠在筑巢测试中表现较差，巢得分较低(图5c)，未切碎的巢重量较重(图5d)，adsc衍生的ev对此有所改善，但并不显著。有趣的是，用adscs衍生的ev处理的野生型小鼠组似乎比没有ev处理的野生型小鼠更好地执行此测试(图5c-5d)。另一方面，在挖洞测试中，在测试开始后2小时(图5e)和过夜(图5f)，用adscs衍生的ev处理的app/ps1比pbs处理的app/ps1挖出的食物颗粒略多。然而，野生型小鼠比app/ps1小鼠挖洞的次数少。它说穴居试验的敏感性在小鼠品系之间是不同的。此外，与我们每组的实验规模(每组三到四只小鼠)相比，所述测试的适当组大小为十。
[0079]
动物实验-动物记忆测试分析
[0080]
给药两周后，通过新物体识别(novel object recognition test)测试对小鼠的识别记忆进行了测试。
[0081]
新物体识别测试方法(novel object recognition test)：
[0082]
新物体识别测试包含3个阶段，包括习惯化阶段、熟悉阶段和测试阶段。小鼠在黑暗循环中在方形开放区域(50
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50
×
50cm)中适应5分钟。习惯化阶段24小时后，将两个相同的物体(乐高积木塔)放置在距离墙壁5厘米的空地上。小鼠在开阔的场地中熟悉物体10分钟。在一小时的间歇间隔后，将一个旧物体替换为一个新物体(装满falcon沙子的falcon组织培养瓶)，使小鼠能够再次探索开阔场地和物体10分钟。整个实验由摄像机记录下来，然后将结果用于分析。
[0083]
测试的示意图如图6a所示。与野生型小鼠相比，用pbs处理的app/ps1小鼠在新物体的总探索时间花费(图6b)和测试阶段新物体的辨别指数(图6c)方面表现出认知表现下降。值得注意的是，经过adsc衍生的ev处理的app/ps1小鼠在新物体中的探索时间有所改善(p《0.05)(图6b)，并且辨别指数更高(图6c)，但不显著。
[0084]
这些数据表明，adsc衍生的ev有可能挽救ad小鼠模型中识别记忆的衰退。
[0085]
动物实验-app/ps1小鼠的aβ斑块负荷(aβplaque loading)分析
[0086]
收集app/ps1小鼠的大脑用于免疫组织化学以评估aβ斑块的表达。通过用de2[anti-amyloid antibody,β1-16,clone de2,，绿色)和iba1(小胶质细胞，红色)进行免疫组织化学染色来检测aβ斑块负载，结果如图7a和图7b所示(图7a为皮质区局部增大图，图7b为全半球aβ斑块相对强度的定量比较图，数据是平均值
±
sem，并通过未配对的双尾司徒顿t检定来分析参数数据。*p《0.05、***p《0.001和#p《0.05说明了显著差异)。从图中可观察到通过in给药处理app/ps1小鼠中adsc衍生的evs后aβ斑块的减少。与wt相比，app/ps1小鼠的aβ斑块强度明显更高。然而，与用pbs处理的app/ps1小鼠相比，用ev处理显著降低了aβ斑块的强度。这些结果表明，adsc衍生的ev对改善ad小鼠模型中的aβ负荷具有有益作用。
[0087]
动物实验-app/ps1小鼠的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生分析
[0088]
已知星形胶质细胞(astrocytes)和小胶质细胞(microglia)的活化与ad大脑中的神经炎症有关。如图8所示，免疫组织化学染色显示app/ps1小鼠显示出被gfap标记物染色的活化星形胶质细胞表达的显著增加(图中的a显示通过免疫组化染色检测wt+pbs、wt+adsc-ev、app/ps1+pbs(ad+pbs)和app/ps1+adsc-ev(ad+adsc-ev)皮质中的活化星形胶质细胞与gfap(蓝色)和de2[anti-amyloid antibody,β1-16,clone de2,，绿色)；图中的b为通过gfap表达的蛋白质印迹分析对皮质裂解物进行分析。数据是平均值
±
sem。与对照组比较的统计数据用*表示。**p《0.01说明了显著差异)。然而，与用pbs处理的app/ps1相比，adsc衍生的ev的施用显著降低了gfap表达。蛋白质印迹分析表明，adsc衍生的ev降低了app/ps1小鼠中检测到的gfap水平升高。这些结果表明，in施用adsc衍生的ev可减少ad小鼠模型中的神经炎症。
[0089]
此外，adsc衍生ev的处理显示app/ps1小鼠的小胶质细胞活化减少(如图9a和图9b所示，图9a为显示wt+pbs、wt+adsc-ev、app/ps1+pbs(ad+pbs)和app/ps1+adsc-ev(ad+adsc-ev)的海马中激活的小胶质细胞通过免疫组织化学染色检测iba-1(红色)和de2(aβ1-16，绿色)，数据为平均值
±
sem，图9b为显示图9a量化数据结果)，这由iba-1表达水平的降低表明。这一结果进一步表明了adsc衍生的evs在ad脑中的免疫抑制和抗炎作用。
[0090]
动物实验-透过活体经鼻给药对神经新生分析
[0091]
通过在小鼠海马部分用双皮质素(投射神经元，红色)和brdu(神经元祖细胞，绿
色)进行免疫组织化学染色来测量神经新生，包含有来自用pbs处理的野生型(wt+pbs，n＝3)、用adsc衍生的ev处理的野生型(wt+adsc-ev，n＝4)、用pbs处理的app/ps1小鼠(app/ps1+pbs，n＝4)、以及用adsc衍生的ev处理的app/ps1小鼠(app/ps1+adsc-ev，n＝4)，每只小鼠1-3个切片。
[0092]
结果如图10a至图10c所示，图10a为显示齿状回内侧区(the sgz in dentate gyrus)的局部放大图，图10b为显示brdu阳性细胞的数量比较图，图10c为显示dcx阳性细胞的数量比较图。(数据是平均值
±
sem。通过未配对的双尾司徒顿t检定分析参数数据，**p《0.01、****p《0.0001和#p《0.05说明了显著差异)；由图10a至图10c的结果可知，经鼻施用adscs衍生的evs可减轻app/ps1小鼠的神经发生损伤。
[0093]
《实施例2》
[0094]
目前，msc-ev纯化通过超速离心产生平均每个细胞500-1,000个颗粒，进一步为了克服目前evs产量的问题，使用纳米电穿孔技术(nanochannel electroporation,nep)。nep系统由纳米通道阵列组成，每个通道的直径为500nm。添加到缓冲液中的质粒(plasmid)在瞬态电脉冲下通过纳米通道进入附着细胞。nep可以通过质粒的快速非内吞传递在细胞表面提供强烈但短暂的电刺激和热刺激，从而在转染细胞中触发强烈的自噬，其中细胞膜修复引导内源合成的功能性外泌体大量分泌，其中含有治疗作用rna和靶向肽。
[0095]
将6,000～15,000个脂肪干细胞/cm2以包含有10wt％的胎牛血清(fetal bovine serum)、1-100mm的n-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、0.05-50mm的抗坏血酸磷酸酯镁(l-ascorbic acid 2-phosphate)的keratinocyte-sfm培养基进行细胞培养5-14天，使细胞的数量扩增至10,000-100,000个，培养环境为温度控制在36.5-38.5℃，且含有5％二氧化碳的细胞培养箱中。
[0096]
接着，利用磷酸盐缓冲生理盐水(dpbs)润洗细胞两次后，将8.0
×
10^4个脂肪干细胞铺展在1cm
×
1cm的3d nep硅芯片表面上，其无血清培养基包含有1-100mm的n-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、0.05-50mm的抗坏血酸磷酸酯镁(l-ascorbic acid 2-phosphate)的keratinocyte-sfm培养基，待细胞贴壁后，使用电穿孔系统(bio-rad gene pulser xcell)以125v的方波脉冲电场、10ms的持续时间脉冲10次，培养环境为温度控制在36.5-38.5℃，且含有5％二氧化碳的细胞培养箱中，24小时后收集培养基进行细胞外囊泡纯化。
[0097]
收集培养完成后的培养液，以300g的离心速度在4℃的温度条件下进行离心5分钟，以去除培养液中的死细胞；接着收集上清液后再以2000g的离心速度在4℃的温度条件下进行离心20分钟，以去除细胞碎片，然后收集上清液以孔径为0.22μm滤网过滤，再利用切向流过滤法(tff，500ka)从过滤后的培养液中分离出细胞外囊泡，并记录于表3中。
[0098]
结果如表3所示，在无血清条件下，不同供体和不同传代数之间没有显著差异(如表3所示)，与常规培养条件相比，分泌的细胞外囊泡(ev)的产量增加了2-5倍。
[0099]
表3
[0100]
[0101][0102]
《实施例3》
[0103]
将6,000～15,000个脂肪干细胞/cm2以包含有10wt％的胎牛血清(fetal bovine serum)、1-100mm的n-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、0.05-50mm的抗坏血酸磷酸酯镁(l-ascorbic acid 2-phosphate)的keratinocyte-sfm培养基进行细胞培养5-14天，使细胞的数量扩增至10,000-100,000个，培养环境为温度控制在36.5-38.5℃，且含有5％二氧化碳的细胞培养箱中。
[0104]
接着，利用磷酸盐缓冲生理盐水(dpbs)润洗细胞两次后，将8.0
×
10^4个脂肪干细胞铺展在1cm
×
1cm的3d nep硅芯片表面上，其无血清培养基包含有1-100mm的n-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、0.05-50mm的抗坏血酸磷酸酯镁(l-ascorbic acid 2-phosphate)的keratinocyte-sfm培养基，待细胞贴壁后，使用电穿孔系统(bio-rad gene pulser xcell)以使用125v的方波脉冲电场、10ms的持续时间脉冲10次经由纳米通道将预先添加在pbs缓冲液中的脑啡肽酶表达质体(neprilysin expression plasmids,产品名cd10(mme)(nm_000902)human tagged orf clone购自origene technologies,inc.)注入单个细胞中，培养环境为温度控制在36.5-38.5℃，且含有5％二氧化碳的细胞培养箱中，24小时后收集培养基进行细胞外囊泡纯化。脑啡肽酶的mrna在pbs中的浓度为500ng/ml。
[0105]
收集培养完成后的培养液，以300g的离心速度在4℃的温度条件下进行离心5分钟，以去除培养液中的死细胞；接着收集上清液后再以2,000g的离心速度在4℃的温度条件下进行离心20分钟，以去除细胞碎片，然后收集上清液以孔径为0.22μm滤网过滤，再利用切向流过滤法(tff，500ka)从过滤后的培养液中分离出细胞外囊泡，并分析细胞外囊泡中脑啡肽酶表现量(以western blot分析，image j软体定量)，并记录于表4中。
[0106]
表4
[0107][0108]
在表4中的各组样品说明如下：
[0109]
control组：以pbs处理。
[0110]
adscs naive组：利用实施例1的方法以脂肪干细胞衍生而得的细胞外囊泡。
[0111]
adsc nep-pbs组：利用本实施例的方法并在pbs中未添加任何质体而得的细胞外囊泡。
[0112]
adsc nep-mme组：利用本实施例的方法并在pbs中添加脑啡肽酶的mrna而得的细胞外囊泡。
[0113]
由表4的结果可知，control组几乎不表现脑啡肽酶，adscs naive组及adsc nep-pbs组表现量相同，而adsc nep-mme组其表现量约为adscs naive组或及adsc nep-pbs组的1.5至1.6倍。
[0114]
接着，确认细胞外囊泡分别对于app基因突变的诱导性多功能干细胞(app
v1711 mutant ad-ipscs或appd
678h mutant ad-ipscs)和psen1基因突变的诱导性多功能干细胞(psen1
a246e mutant ad-ipscs)的影响。app基因和psen1基因皆与阿兹海默症相关，遗传性阿兹海默症是由一群在第21、14、1对染色体上基因变异和这些变异形成不正常的蛋白质所引起。第21对染色体上的app基因突变造成不正常的淀粉样蛋白前驱蛋白(amyloid precursor protein)形成，第14对染色体上的psen1基因突变生成不正常的早老蛋白一号(presenilin 1)。
[0115]
app
v1711 mutant ad-ipscs和psen1
a246e mutant ad-ipscs(相关材料方法如“assessing the therapeutic potential of graptopetalum paraguayense on alzheimer’s disease using patient ipsc-derived neurons.sci rep.2019dec 17；9(1):19301所示)以不同的细胞外囊泡进行处理，包含利用实施例1的方法以脂肪干细胞衍生而得的细胞外囊泡(adscs naive组)、利用本实施例的方法并在pbs中未添加任何质体而得的细胞外囊泡(adsc nep-pbs组)、利用本实施例的方法并在pbs中添加脑啡肽酶的mrna而得的细胞外囊泡(adsc nep-mma组)，其中所有组别的细胞外囊泡浓度为1.3
×
10^9或6
×
10^9个细胞外囊泡。培养两天后更换成新鲜的培养基并加入与前次相同浓度的细胞外囊泡再培养两天。最后收集培养基分析aβ1-42表达程度(以elisa assay分析)。
[0116]
app-d678h mutant ad-ipscs进行分化为神经(neurons)，收集分化后12周的培养基(以下简称12w培养基)，将12w培养基或aβ标准蛋白(amyloid-βstandard protein)与2
×
evs处理psen1
a246e mutant ad-ipscs组的aβ1-42(1.3pmol/l)表达较未处理组(4.11pmol/l)减少68.4％。
[0124]
app-d678h mutant ad-ipscs进行分化为神经(neurons)，收集分化后12周的培养基(以下简称12w培养基)，将12w培养基或aβ标准蛋白(amyloid-βstandard protein)与2
×
10^9或1
×
10^10细胞外囊泡(adsc nep-mir29-evs)混合培养16小时，培养环境为温度控制在36.5-38.5℃，且含有5％二氧化碳的细胞培养箱中。最后收集培养基分析aβ1-42表达程度(以elisa assay分析)。
[0125]
结果发现12w培养基与2
×
10^9adsc nep-mir29-evs组的aβ1-42(40.3pg/ml)表达较未处理组(496pg/ml)减少91.9％；12w培养基与1
×
10^10adsc nep-mir29-evs组的aβ1-42(8pg/ml)表达较未处理组(496pg/ml)减少98.4％。aβ标准蛋白与2
×
10^9adsc nep-mir29-evs组的aβ1-42(638pg/ml)表达较未处理组(987pg/ml)减少35.3％；aβ标准蛋白与1
×
10^10adsc nep-mir29-evs组的aβ1-42(257pg/ml)表达较未处理组(987pg/ml)减少73.9％。如上述结果所述，带有mir29的细胞外囊泡能有效抑制aβ1-42的表现量，
[0126]
综上所述，本发明的内容已以如上的实施例举例说明了，然而本发明并非仅限定于此等实施方式而已。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可再进行各种的更动与修饰；例如，将前述实施例中所例示的各技术内容加以组合或变更而成为新的实施方式，此等实施方式亦当然视为本发明所属内容之一。因此，本案所欲保护的范围亦包括权利要求书及其所界定的范围。

技术特征：
1.一种用于治疗阿兹海默症的医药组合物，其特征在于，至少包含有细胞外囊泡，且所述细胞外囊泡的制备方法如下：第一培养步骤：将脂肪间质干细胞以6,000～15,000个细胞/cm2的细胞密度在一第一培养基中扩增培养，直到所述脂肪间质干细胞的扩增数量为培养前的90％以上；第二培养步骤：将扩增后的所述脂肪间质干细胞以10,000～100,000个细胞/cm2的细胞密度在一第二培养基中培养20～30小时；细胞外囊泡分离步骤：收集所述培养液并利用切向流过滤法(tff)或超滤法从所述培养液中分离出所述细胞外囊泡；其中所述第一培养基包含有胎牛血清、n-乙酰半胱氨酸、抗坏血酸磷酸酯镁和keratinocyte-sfm培养基；以及所述第二培养基包含有n-乙酰半胱氨酸、抗坏血酸磷酸酯镁和keratinocyte-sfm培养基。2.根据权利要求1所述的治疗阿兹海默症的医药组合物，其特征在于，在所述第二培养步骤之后进一步包含有：基因转染步骤：将所述脂肪干细胞铺展在3d nep硅芯片表面上，待细胞贴附后，使用电穿孔系统以使用25-150v的方波脉冲电场、10ms的持续时间脉冲5-15次的条件经由纳米通道处理或将预先添加在pbs缓冲液中的质体注入单个细胞中，培养20～30小时后进行所述细胞外囊泡分离步骤。3.根据权利要求2所述的治疗阿兹海默症的医药组合物，其特征在于，所述质体在pbs缓冲液中的浓度为在400～600ng/ml之间。4.根据权利要求1所述的治疗阿兹海默症的医药组合物，其特征在于，所述细胞外囊泡高度表达脑啡肽酶。5.根据权利要求2所述的治疗阿兹海默症的医药组合物，其特征在于，所述细胞外囊泡高度表达脑啡肽酶、mir-29a、及/或mir-29b。6.根据权利要求1所述的治疗阿兹海默症的医药组合物，其特征在于，经由鼻腔给药。7.一种高表现型间质干细胞的培养方法，其特征在于，包含有以下步骤：第一培养步骤：将脂肪间质干细胞以6,000～15,000个细胞/cm2的细胞密度在一第一培养基中扩增培养，直到所述脂肪间质干细胞的扩增数量为培养前的90％以上；第二培养步骤：将扩增后的所述脂肪间质干细胞以10,000～100,000个细胞/cm2的细胞密度在一第二培养基中培养20～30小时；基因转染步骤：将所述脂肪干细胞铺展在3d nep硅芯片表面上，待细胞贴附后，使用电穿孔系统以使用120-150v的方波脉冲电场、10ms的持续时间脉冲5-15次的条件经由纳米通道处理或将预先添加在pbs缓冲液中的质体注入单个细胞中，培养20～30小时后获得高表现型间质干细胞；其中所述质体为脑啡肽酶的mrna、mir-29a、及/或mir-29b；以及所述高表现型间质干细胞高度表现脑啡肽酶、mir-29a、及/或mir-29b。8.根据权利要求7所述的高表现型间质干细胞的培养方法，其特征在于，所述质体在pbs缓冲液中的浓度为在400～600ng/ml之间。9.根据权利要求7所述的高表现型间质干细胞的培养方法，其特征在于，所述高表现型
间质干细胞用于治疗阿兹海默症及/或类淀粉蛋白沉积。10.根据权利要求7所述的高表现型间质干细胞的培养方法，其特征在于，所述高表现型间质干细胞所衍生的细胞外囊泡可用于治疗阿兹海默症及/或类淀粉蛋白沉积。

技术总结
本发明提供一种用于治疗阿兹海默症的医药组合物，其至少包含有细胞外囊泡，且所述细胞外囊泡的制备方法如下：第一培养步骤：将脂肪间质干细胞以6,000～15,000个细胞/cm2的细胞密度在一第一培养基中扩增培养，直到所述脂肪间质干细胞的扩增数量为培养前的90％以上；第二培养步骤：将扩增后的所述脂肪间质干细胞以10,000～100,000个细胞/cm2的细胞密度在一第二培养基中培养20～30小时；细胞外囊泡分离步骤：收集所述培养液并利用切向流过滤法(TFF)或超滤法从所述培养液中分离出所述细胞外囊泡。外囊泡。外囊泡。


技术研发人员：黄奇英 蔡侑珍 庄明熙 林珀丞
受保护的技术使用者：黄奇英
技术研发日：2023.01.17
技术公布日：2023/7/31