一种靶向TRPML1调控自噬的抗肿瘤效应

一种靶向trpml1调控自噬的抗肿瘤效应
技术领域
1.本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种靶向trpml1调控自噬的抗肿瘤效应。


背景技术：

2.转移是恶性肿瘤的重要特征，也是导致肿瘤患者远期预后差以及病死率高的主要原因，自噬活动在肿瘤转移级联过程中的多方面参与调控肿瘤细胞的生物学行为，但是由于目前对自噬活动缺乏特异性的干预药物和干预方法，大大限制了有关自噬与肿瘤转移关系的研究，因此，寻找特异性调控自噬的药物或者干预手段，对于明确自噬与肿瘤转移的关系、阐述自噬调控肿瘤转移的分子机制尤为重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种靶向trpml1调控自噬的抗肿瘤效应，以解决上述背景技术中提出的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.一种靶向trpml1调控自噬的抗肿瘤效应，包括以下过程：
6.s1、trpml1激活；
7.s2、肿瘤细胞自噬下游受阻；
8.s3、线粒体更新障碍，受损线粒体大量累积；
9.s4、ros水平升高；
10.s5、dna受损，激活p53活性；
11.s6、触发肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移。
12.优选的，所述trpml1为特异性存在于溶酶体膜上的非选择性阳离子通道。
13.优选的，所述肿瘤细胞选用人黑色素瘤(a-375)和神经胶质瘤细胞(u-87mg)。
14.优选的，所述trpml1自噬活性调控采用的是trpml1的特异性小分子激动剂ml-sa5。
15.优选的，实验方法如下：
16.h1、蛋白免疫印迹检测自噬小体标记蛋白lc3ii和自噬降解底物蛋白p62的表达变化，共聚焦显微镜检测自噬进程；
17.h2、采用transwell migration实验和transwell invasion实验分别用于监测肿瘤细胞的体外迁移和侵袭能力；
18.h3、运用台盼蓝染色实验检测肿瘤细胞的存活率，采用流式细胞术检测线粒体膜电位和细胞内ros含量；蛋白免疫印迹、双荧光素酶报告基因实验分别检测p53蛋白表达水平和转录因子活性；qrt-pcr、蛋白免疫印迹分别检测转移相关基因mmps和twist的mrna和蛋白水平；明胶酶谱法检测mmp2和mmp9的酶活性；migration实验和invasion实验检测不同条件下肿瘤细胞体外转移特性的变化；
19.h4、构建黑色素瘤裸鼠转移模型，进行he染色和小鼠活体成像检测人黑色素瘤在体转移情况，免疫组织化学染色检测肺转移瘤lc3和p62蛋白变化。
20.本发明的有益效果是：
21.本发明通过以trpml1为切入点，应用trpml1的特异性小分子激动剂ml-sa5调控自噬活性，发现trpml1介导的自噬抑制可以抑制人黑色素瘤、神经胶质瘤在体外的迁移与侵袭，同时ml-sa5作为trpml1的特异性小分子激动剂可以有效地抑制在体实验中人黑色素瘤细胞向裸鼠肺脏的转移，发现了trpml1介导的自噬抑制阻碍肿瘤转移的基本的分子通路，trpml1介导的自噬抑制源自自噬小体与溶酶体的融合受阻，因此随着自噬小体的大量沉积，包裹在自噬小体双层膜结构中的受损线粒体也逐渐累积，导致线粒体更新障碍，进而诱发肿瘤细胞内ros水平升高，高水平的ros通过提高转录因子p53的活性调控与肿瘤转移相关的一系列靶基因，最终有效抑制人黑色素瘤、神经胶质瘤在体外的迁移与侵袭，以及有效地抑制在体实验中人黑色素瘤细胞向裸鼠肺脏的转移。
附图说明
22.图1为本发明的激活trpml1通道抑制细胞自噬活性实验数据示意图；
23.图2为本发明的trpml1介导的自噬抑制阻碍线粒体更新从而引发细胞内ros累积实验数据示意图；
24.图3为本发明的ros升高激活p53转录调控活性实验数据示意图；
25.图4为本发明的trpml1特异性小分子激动剂ml-sa5抑制人黑色素瘤在体转移实验数据示意图；
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例一：
28.实验具体方法为:h1、蛋白免疫印迹检测自噬小体标记蛋白lc3ii和自噬降解底物蛋白p62的表达变化，共聚焦显微镜检测自噬进程；
29.其中实验过程为：h101、细胞培养:细胞复苏:从液氮罐中取出待复苏细胞，置于37c恒温水浴箱摇动使其快速融化，酒精擦拭冻存管后，吸取冻存细胞并加到含4ml培养基的15m离心管中800-1000rpm离心5分钟，弃掉上清，以新鲜的10％fbs dmem培养液重悬细胞沉淀，加到新培养皿中，并依据培养皿大小加入适量培养液，十字交叉混匀并置于二氧化碳培养箱中孵育24小时，之后根据细胞汇合密度选择更换新鲜培养基10％fbsdmem继续培养或者传代培养；细胞传代:弃去旧培养基，使用pbs清洗1-3遍，加入适量胰酶后置于室温或37℃培养箱消化1-2分钟，然后除去大部分胰酶，培养皿中只保留2-3滴，放置于显微镜下观察细胞的消化程度，当大部分细胞变圆且最外圈细胞有部分脱落时，予以1ml 10％fbs dmem终止消化消化下来的细胞悬液经800-1000rpm离心5分钟，弃掉上清后用新鲜培养液重悬细胞沉淀，按1:3一1:5的比例接种到新培养皿上进行培养，或者按一定比例接种到培养
板中进行实验；细胞冻存:将生长状态良好的细胞进行冻存保种；消化处理步骤同细胞传代，只是在离心后加入冻存液进行重悬；冻存液按照dmem、fbs.dmso 7:2:1的比例进行配置，细胞冻存密度为3x10ml，冻存液悬浮细胞后放入程序降温盒内，并置于-80℃冰箱梯度降温，12h后从-80℃冰箱转入液氮罐中储存。
30.h102、线粒体提取：(1)消化并收集大约2x107个细胞；(2)细胞沉淀中加入a液(含蛋白酶抑制剂)，利用dounce组织匀浆器手动匀浆80-100次；(3)加入c液(含蛋白酶抑制剂)混匀，700g离心10分钟后收集上清液；(4)将上清以12000g离心15分钟，然后在所得沉淀中加入c液进行洗涤，再次12000g离心5分钟，最终所得沉淀即为粗提的线粒体；整个线粒体提取过程中保持低温。
31.h103、蛋白免疫印迹：采用经典的蛋白免疫印迹技术分别对肿瘤细胞的lc3、p62、p53、mmp2mmp9、twist以及线粒体上pink1的蛋白水平进行了检测，整个过程涉及蛋白样品的制备、聚丙烯酷胺凝胶(sds-page)电泳、湿法转印、封闭、一抗/二抗的先后孵育、蛋白条带显色一系列规范化操作步骤，运用imagej软件测算蛋白条带的灰度值用于统计分析。
32.h104、细胞转染：要求35mm培养皿中的细胞汇合度至少在80％以上，取两支1.5ml的ep管，分别盛装用opti-mem稀释的lipofectamine 2000和质粒，lipofectamine2000与质粒的配比为10ui/4ug，每只ep管中的稀释液总体积均为250ul；根据计算分别配置好lipofectamine 2000和质粒的稀释液，手动摇匀后室温静置5分钟；然后将质粒稀释液加到lipofectamine2000稀释液中，再次手动摇匀，静置；20分钟后，弃掉35mm培养皿中的培养基，加入1.5ml新鲜的10％fbs dmem，之后将lipofectamine2000和质粒的混合液加入细胞的培养基中，轻轻摇匀，并置于二氧化碳培养箱中孵育；6-8小时后给细胞换液，24小时后荧光显微镜下评估转染。
33.h105、dq-red-bsa实验：do-bsa染料被细胞内吞后，可被溶酶体的活性水解酶降解成带有荧光团的小片段，导致染料去淬灭，故共聚焦显微镜下可见明亮的红色荧光点；在质子泵抑制剂bafilomycin-a1的作用下，因溶酶体的酸性环境改变，所以溶酶体的降解功能遭到破坏；此时应用do-bsa对细胞进行染色，共聚焦显微镜下的红色荧光点极其微弱，因此，do-bsa实验可通过检测溶酶体酸性水解酶活性来反映溶酶体的功能，共聚焦显微镜下红色荧光点越弱越少越提示溶酶体的功能不全；其中，使用共聚焦专用24孔板培养细胞，并且选择dq-bsa 1ug/ml为最终工作浓度；每孔取5ul浓度为lug/ul的dq-red-bsa溶于500ul体积的10％fbsdmem，在37℃二氧化碳培养箱中作用细胞2小时，然后弃掉含dq-red-bsa染料的培养基，pbs清洗2-3次，加入不含氨基酸和血清的培养基，作用4小时后进行相应药物处理；次日在共聚焦显微镜的油镜下进行成像，细胞内的荧光斑点用来评估药物对溶酶体功能的影响。
34.h2、采用transwell migration实验和transwell invasion实验分别用于监测肿瘤细胞的体外迁移和侵袭能力；
35.其中实验过程为：选择孔径8um大小的transwell小室来检测肿瘤细胞的迁移和侵袭能力；migration实验中，在下室置入体积600ul含10％fbs的完全培养基dmem，上室接入无血清培养基混匀的细胞悬液200ul，每个孔接种的细胞数目约为2-4x104个，其中根据分组不同，上室细胞悬液中还含有相应浓度的药物。将培养板置于二氧化碳培养箱中孵育16-24小时，然后用4％的多聚甲醛固定细胞20分钟，pbs清洗后用0.5％的结晶紫染色30分钟，
再用pbs将多余的结晶紫染料清洗掉，显微镜成像后用一定体积20％的乙酸溶解掉结晶紫，取200ul溶解液置于酶标仪上检测600nm处的吸光光度值，数值的高低反映了肿瘤细胞从上室迁移到下室的细胞数量；invasion实验与migration实验的方法大致相似，不同的地方在于，前者在细胞接种前需要用基质胶(matrigel)对transwell小室上侧的聚碳酸酷膜进行包被；将基质胶以1:7的比例释于无血清的dmem培养液中(此过程基质胶的融化和稀释均在低温条件下进行),每个小室取50ul的基质胶稀释液进行覆盖，37℃条件下经1-2小时可聚合形成三维基质，以此来模拟基膜的结构，另外成胶后室上侧的细胞接种数目约为每孔5-8x104个细胞；同时结晶紫染色前擦掉基质胶以及基质胶内未转移下去的肿瘤细胞，其余步骤同migration实验。
36.h3、运用台盼蓝染色实验检测肿瘤细胞的存活率；采用流式细胞术检测线粒体膜电位和细胞内ros含量；蛋白免疫印迹、双荧光素酶报告基因实验分别检测p53蛋白表达水平和转录因子活性；qrt-pcr、蛋白免疫印迹分别检测转移相关基因mmps和twist的mrna和蛋白水平；明胶酶谱法检测mmp2和mmp9的酶活性；migration实验和invasion实验检测不同条件下肿瘤细胞体外转移特性的变化；
37.其中，台盼蓝染色实验过程为：将细胞进行消化处理，混匀后取500ul细胞悬液加到等体积的台盼蓝染色液中，再次混匀后吸取10u的细胞混合液加到血球计数板上，最后在显微镜下分别计数活细胞和死细胞(蓝色细胞)数细胞的存活率＝(1-死细胞数/细胞总数)x100％；
38.其中，流式细胞术实验过程为：ros的检测:使用h2dcfda作为检测细胞内活性氧水平的探针，h2dcfda探针本身不发荧光且可自由透过细胞膜,在细胞内可被酷酶水解为具有极性的dcfda，从而固定装载在细胞内，遇到活性氧可被氧化成有荧光的dcf，因此可用于流式细胞术检测胞内ros的含量，具体操作步骤为，胰酶消化并收集各处理组的细胞，pbs洗涤细胞2-3遍后加入用dmem稀释的h2dcfda荧光探针37℃孵育，pbs洗净多余染料后上机进行检测；线粒体的检测:jc-1是常用的检测线粒体膜电位的荧光探针，健康的线粒体膜电位较高，大量的jc-1依赖电势聚集在线粒体基质中形成聚合物，发出强烈的红色荧光，一旦线粒体损伤，随着膜电位的下降和丧失，jc-1只能以单体形式存在于胞浆，可激发出绿色荧光，因此可以用红/绿荧光的强度比来反映线粒体的去极化程度，操作上先消化收集细胞，再加入合适浓度的jc-1探针，然后洗净多余染料，最后上机检测，其中jc-1采用10ug/ml的工作浓度；
39.其中，双荧光素酶报告基因实验过程为：将a-375和u-87mg细胞接种到35mm的培养皿上，培养至贴壁细胞的汇合度在80％以上时，使用lipofectamine 2000作为转染试剂将pg13-luc(含有正常的p53结合位点)和mg15-uc(含有突变的p53结合位点)分别转染至对应组的细胞内，同时共转染pgl4.75(renillaluc)，6小时后将细胞按相应比例接种到12孔板内，使用10％fbs dmem培养液继续培养16小时，之后按组别分别给予不同的药物处理，最后利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒和多功能酶标仪来检测董火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。并以海肾荧光素酶(renillaluciferase)作为内参，计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶对应的荧光比值，通过目的基因的激活程度来间接反映药物对转录因子p53活性的影响。
40.其中，qrt-pcr实验过程为：收集不同处理组的a-375和u-87mg细胞，经过反转录生
成cdna、最后用lc480系统进行实时定量pcr分析，结果处理采用2-aact
法，所使用的引物有:hgapdh-f:5-agccacatcgctcagacac-3
41.hgapdh-r:5-gcccaatacgaccaaatcc-3
42.hmmp2-f:5-caagttccccggcgatgtc-3
43.hmmp2-r:5-ttctggtcaaggtcacctgtc-3
44.hmmp9-f:5-tgtaccgctatggttacactcg-3
45.hmmp9-r:5-ggcagggacagttgcttct-3
46.htwist-f:5-ggagtccgcagtcttacgag-3
47.htwist-r:5-tctggaggacctggtagagg-3
48.其中，明胶酶谱法实验过程为：将a-375和u-87mg细胞接种于六孔板内，待细胞快长满时，将旧培养基更换为800ul无血清的dmem培养液，其中培养液中按计划溶解有相应浓度的药物，然后置于二氧化碳培养箱中孵育24小时，次日收集上清液至离心管中，2000rpm离心10分钟后弃去沉淀，此时的上清液即为我们的待测样品，根据测定的蛋白浓度调整各组上清液的体积，并与不含dtt的4x上样缓冲液以1:3混合，配置含有1mg/ml明胶的10％sds-聚丙烯酷胺凝胶,加样后在4c条件下进行电泳，电泳结束后依次经过洗脱与复性、漂洗、孵育、染色、脱色处理，最终肉眼可见凝胶的深蓝色背景下显现出无色清晰酶谱条带，可利用wb成像系统扫描成像，条带灰度值的强弱反映了mmps活性的高低，其中涉及的溶液配制为：(1)10x明胶溶液:500mg明胶，去离子水40ml，室温放置2小时，置于65℃水浴，15分钟后溶成均匀液体后,定容至50ml,最终配成浓度为10mg/ml的母液分装后-20℃保存；
49.(2)10x电泳缓冲液:tris base 29g，甘氨酸144g，sds 10g，以去离子水溶解，总体积1l，ph为8.3；
50.(3)10x洗脱(复性)缓冲液(renaturing buffer):25％(体积比)的tritonx-100，用去离子水配置；
51.(4)1x孵育缓冲液(developing buffer):50mmtris-hcl，02mnacl，5mmcacl，0.02％brij 35，ph 7.5；
52.(5)10x漂洗液:tris-hcl 39.4g，caci2
·
2h203.6755 g，去离子水配置，ph7.6，总体积500ml；
53.(6)考马斯亮蓝r-250染色液:甲醇30％；乙酸10％；coomassie r blue0.25％，以上均为体积比；
54.(7)脱色液:甲醇20％:乙酸10％:去离子水配置。
55.h4、构建黑色素瘤裸鼠转移模型，进行he染色和小鼠活体成像检测人黑色素瘤在体转移情况，免疫组织化学染色检测肺转移瘤lc3和p62蛋白变化；
56.其中，构建黑色素瘤裸鼠转移模型过程为：依次将6周龄balb/c裸鼠固定到小鼠固定器上,经尾静脉注入数目0.5～1x106.体积0.2ml的a-375或者a-375-luc细胞悬液，并于成瘤第3天开始进行每日一次的腹腔药物注射，给药时间持续3周，将裸鼠分为pbs组，ml-sa5组，ml-sa5+ml-si3组。其中，用药量为ml-sa52mg/kg，ml-si316mg/kg；
57.其中，小鼠活体成像过程为：a375-luc转移模型鼠在连续腹腔给药3周后进行活体成像，麻醉后的裸鼠给予腹腔注射底物荧光素(d-luciferin),浓度为30mg/ml,注射体积为每只裸鼠200ul，注射后10分钟使用xenogen ivis活体成像系统进行成像；
58.其中，免疫组织化学染色和he染色过程为:剖取裸鼠肺组织行石蜡包埋,制作完成的石蜡切片经过烤片、脱蜡、水化、抗原修复、细胞膜打孔、封闭、孵育一抗、孵育荧光抗、dapi染色、封片这一系列顺序操作后，运用共聚焦显微镜对其进行成像,检测的蛋白为lc3和p62,此外肺组织石蜡切片经过he染色后，可用以分析转移瘤的数目和大小。
59.实施例二，通过上述实施例一的实验方法，得到以下结论：
60.s1、trpml1激活；s2、肿瘤细胞自噬下游受阻；
61.具体的，肿瘤细胞采用的是人源恶性黑色素瘤细胞a-375和神经胶质瘤细胞u-87mg，应用蛋白免疫印迹分别对两种细胞的lc3ii和p62蛋白进行了检测，结果显示，a-375和u-87mg细胞接触trpml1的特异性小分子激动剂ml-sa54小时后，胞内同时出现了自噬小体标记蛋白lc3ii和自噬降解底物蛋白p62的升高(图1a-b)，提示a-375和u-87mg细胞的自噬活动受到阳滞，同时采用gfp-lc3融合蛋白示踪a-375和u-87mg细胞内自噬小体的形成，荧光显微镜下成像显示，ml-sa5处理组细胞内可见较多的绿色荧光斑点(puncta结构),提示自噬小体在肿瘤细胞内的聚集(图1c)，复合应用trpml1的特异性抑制剂ml-si3后，肿瘤细胞表现出lc3ii和p62蛋白水平的回落(图1a-b),以及绿色荧光斑点(puncta结构)的减少(图1c)，从而得到ml-sa5对trpml1的特异性激活可抑制a-375和u-87mg的自噬活动，诱导肿瘤细胞内自噬小体大量聚集；
62.具体的，由于gfp对溶酶体的酸性环境较为敏感，所以细胞内gfp-lc3越少代表自噬溶酶体的形成越通畅，反之代表自噬的下游受阻，所以用乏氨基酸和血清的培养基饥饿已转染了gfp-rfp-lc3的a-375和u-87mg细胞，由于自噬流通畅，故荧光显微镜下该组细胞表现为绿色荧光点减弱,红色荧光斑点数目大于绿色荧光斑点(图1e)，ml-sa5处理组的细胞表现为荧光斑点增多，同时红色荧光斑点约等于绿色荧光斑点(图1e)，该实验表明a-375和u-87mg细胞trpml1通道激活后阻断的是自噬下游；
63.具体的，利用dq-bsa实验对肿瘤细胞的溶酶体功能进行了鉴定，低浓度的ml-sa5(14m)几乎不影响a-375细胞的酶体功能，当ml-sa5浓度增加到5um时，溶酶体的消化功能甚至有轻度增高(图1d)，可知trpml1通道的激活对溶酶体的功能几乎不产生抑制，因此极有可能trpml1介导的自噬下游阻滞来自于自噬溶酶体的形成障碍，结合gfp-lc3质粒瞬时转染和lysotracker溶酶体探针标记，在共聚焦显微镜下对a-375和u-87mg这两种细胞的自噬溶酶体进行监测，当自噬小体与溶酶体融合正常时，细胞内红绿荧光点的共标率较高，反之共标率下降，由于ml-sa5处理组表现为红绿荧光点的共标减少(图1f)，所以trpml1通道的激活可能介导了自噬溶酶体的形成障碍；
64.结论：激活trpml1通道可抑制滚酶体与自噬小体的融合，从而阻碍人黑色素瘤和神经胶质瘤细胞的自噬活性，最终导致肿瘤细胞内出现自噬小体堆积现象。
65.s3、线粒体更新障碍，受损线粒体大量累积；s4、ros水平升高；
66.具体的，通过jc-1流式细胞术检测线粒体膜电位的高低进而反映线粒体的质量，由于正常线粒体的膜电位较高，jc-1会聚集到线粒体基质中形成聚合物，发射红色荧光，流式检测结果呈现fl1与fl2通道双阳性；当线粒体去极化时基质内的jc-1浓度随膜电位下降而减低，单体形式的jc-1可被激发出绿色荧光，流式细胞术检测呈fl1通道单阳性，在a-375和u-87mg细胞的jc-1流式检测结果图中，绿色区为双通道阳性该区域分布的肿瘤细胞群线粒体膜电位正常:蓝色区为单通道阳性，该区域分布的肿瘤细胞群线粒体膜电位下降，检测
结果为mlsa5(5um,48h)处理组蓝色区比重大于对照组(图2b)，说明ml-sa5可以诱导a-375和u-87mg细胞内损伤线粒体积聚，复合应用ml-si3抗ml-sa5对trpml1的激活作用后,肿瘤细胞受损线粒体积聚现象得到改善(图2b)，说明trpml1通道的特异性激活是构成ml-sa5引起肿瘤细胞受损线粒体累积的关键，并且给予3-ma(10mm)预处理2h,从起始阶段阻断自噬小体的生成后，a-375和u-87mg细胞受损线粒体数目有所下降(图2b)，而单独使用ml-si3和3-ma对肿瘤细胞的线粒体影响不大(图2b)，所以是ml-sa5对肿瘤细胞自噬下游的阻断，最终导致黑色素瘤细胞a-375和神经胶质瘤细胞u-87mg的受损线粒体随着内部自噬小体的堆积而出现大量滞留；
67.具体的，利用活性氧荧光探针h2dcfda以及流式细胞术对a-375和u-87mg细胞内的ros信息进行了采集，其中ml-sa5处理组肿瘤细胞内ros水平明显升高(图2a)；抗氧化剂nac可以清除ml-sa5作用过程中细胞内过多的ros(图2a)；ml-sa5联合ml-si3组以及3-ma预处理组均可见瘤细胞内ros水平回落(图2a)，并且单独使用ml-si3和3-ma不会引起细胞内ros水平的明显改变(图2a)；所以ml-sa5是通过激活trpml1通道诱导自噬抑制，使受损线粒体大量累积，引发人黑色素瘤细胞和神经胶质瘤细胞ros生成增多；并且利用荧光探针对黑色素瘤细胞a-375的线粒体ros进行了标记，共聚焦成像结果显示，ml-sa5可诱导线粒体ros的显著抬高(图2c)。
68.结论：trpml1通道的特异性激活可造成自噬小体与溶酶体的融合障碍，然后导致线粒体的更新受阻，从而诱发了肿瘤细胞内ros水平的抬高。
69.s5、dna受损，激活p53活性；s6、触发肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移；
70.具体的，通过蛋白免疫印迹结果显示a-375和u-87mg细胞，ml-sa5对这两种肿瘤细胞p53蛋白表达水平均无明显影响(图3a-b)，荧光素酶基因报告质粒pg13-luc检测系统显示，a-375和u-87mg细胞经ml-sa5处理后荧光素酶活性明显升高(图3c-d)，同时mg15-luc系统检测结果显示，失去p53的结合位点后ml-sa5组和对照组的荧光值无明显差别(图3e)，证明ml-sa5可以激活a-375和u-87mg细胞的p53转录因子活性，并且ml-si3(20um)可以反转ml-sa5对p53活性的激活，但ml-si3本身不构成对p53的调控(图3c-d)，说明ml-sa5对p53活性的调控作用是通过trpml1介导的自噬抑制实现的，同时已知ros升高会对dna造成损伤，追踪人黑色素瘤a-375细胞株24小时内ml-sa5作用后多个时间点上对应的ros水平和p53活性ml-sa5作用于a-375细胞后，胞内ros在短时间内迅速升高，并于给药后8小时左右达到高峰(图3h)；相较而言p53活性从开始增加至出现高峰迟后了大约4小时(图3h)，意味着p53的激活是在trpml1通道激活之后，随着ros升高而出现的，利用migration实验和invasion实验重新评估了ml-sa5对黑色素瘤细胞转移力的调控。实验结果显示，对于成功敲低p53基因表达的a-375细胞来说(图3g)，ml-sa5很难再发挥显著地抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的作用(图3f)，肿瘤细胞p53的正常表达与功能是维持trpml1介导的自噬抑制参与抑制肿瘤转移的关键；
71.具体的，通过动物在体水平评估ml-sa5抑制肿瘤转移的效果，选择培养状态极佳的a-375细胞用于构建裸鼠肺转移模型，尾静脉注射肿瘤细胞三天后我们开始对模型小鼠进行每日一次的腹腔注射，根据分组分别予以pbs(含dmso)、ml-sa5(2mg/kg)、ml-sa5(2mg/kg)叠加mlsi3(16mg/kg)，3周后，在麻醉状态下取出裸鼠肺组织，甲醛固定后进行石蜡包埋、切片、he染色。最终的结果显示，ml-sa5组的裸鼠相较于pbs组肺部转移灶体积更小且肿
瘤数目明显减少(图4a,c)；同时对比ml-sa5组，ml-si3的使用可以大大地削弱ml-sa5对黑色素瘤小鼠肺转移的抑制作用(图4c)，另外构建可以稳定表达荧光素酶的黑色素瘤细胞株a375-luc，并用它来建立新的裸鼠转移模型，然后利用小鼠活体成像技术监测移植鼠体内黑色素瘤的转移情况，结果显示，ml-sa5可显著抑制黑色素瘤在裸鼠肺脏的转移，ml-si3可拮抗ml-sa5的这一有效作用(图4b)，由此可见trpml1通道的激活是ml-sa5抑制黑色素瘤转移的关键；最后，对小鼠肺转移瘤的细胞自噬活性进行了检测，免疫组织化学染色结果显示，ml-sa5组的肿瘤转移中lc3和p62的puncta结构均有显著增加(图4d)，提示在转移瘤中细胞的自噬活性受到抑制，trpml1介导的自噬抑制依赖癌细胞中ros p53途径触发凋亡；
72.结论：ml-sa5是通过特异性激活trpml1通道诱导肿瘤细胞自噬受阻，进而在在体水平发挥抑制黑色素瘤转移的作用。
73.整体实验表明：通过特异性激活trpml1通道后肿瘤细胞的自噬溶酶体形成发生障碍，自噬活动受阻破坏了线粒体的及时更新，随后造成细胞内ros持续高水平，高水平的ros可通过激活p53的转录调控活性，进而调控转移相关基因的表达和活性，最终发挥抑制肿瘤细胞转移的重要作用。
74.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种靶向trpml1调控自噬的抗肿瘤效应，其特征在于，包括以下过程：s1、trpml1激活；s2、肿瘤细胞自噬下游受阻；s3、线粒体更新障碍，受损线粒体大量累积；s4、ros水平升高；s5、dna受损，激活p53活性；s6、触发肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移。2.根据权利要求1所述的一种靶向trpml1调控自噬的抗肿瘤效应，其特征在于：所述trpml1为特异性存在于溶酶体膜上的非选择性阳离子通道。3.根据权利要求1所述的一种靶向trpml1调控自噬的抗肿瘤效应，其特征在于：所述肿瘤细胞选用人黑色素瘤细胞系(a-375)和人胶质母细胞瘤细胞系(u-87mg)。4.根据权利要求1所述的一种靶向trpml1调控自噬的抗肿瘤效应，其特征在于：所述trpml1自噬活性调控采用的是trpml1的特异性小分子激动剂ml-sa5和抑制剂ml-si3。5.根据权利要求1所述的一种靶向trpml1调控自噬的抗肿瘤效应，其特征在于：实验方法如下：h1、蛋白免疫印迹检测自噬小体标记蛋白lc3i i和自噬降解底物蛋白p62的表达变化，共聚焦显微镜检测自噬进程；h2、采用transwell migration实验和transwell invasion实验分别用于监测肿瘤细胞的体外迁移和侵袭能力；h3、运用台盼蓝染色实验检测肿瘤细胞的存活率，采用流式细胞术检测线粒体膜电位和细胞内ros含量；蛋白免疫印迹、双荧光素酶报告基因实验分别检测p53蛋白表达水平和转录因子活性；qrt-pcr、蛋白免疫印迹分别检测转移相关基因mmps和twist的mrna和蛋白水平；明胶酶谱法检测mmp2和mmp9的酶活性；migration实验和invasion实验检测不同条件下肿瘤细胞体外转移特性的变化；h4、构建黑色素瘤裸鼠转移模型，进行he染色和小鼠活体成像检测人黑色素瘤在体转移情况，免疫组织化学染色检测肺转移瘤lc3和p62蛋白变化。

技术总结
本发明涉及医药生物技术领域，具体公开了一种靶向TRPML1调控自噬的抗肿瘤效应，包括以下过程：S1、TRPML1激活；S2、肿瘤细胞自噬下游受阻；S3、线粒体更新障碍，受损线粒体大量累积；S4、ROS水平升高；S5、DNA受损，激活p53活性；S6、触发肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移，其中，肿瘤细胞选用人黑色素瘤细胞系A-375和人胶质母细胞瘤细胞系U-87MG，TRPML1自噬活性调控采用的是TRPML1的特异性小分子激动剂ML-SA5和抑制剂ML-SI3，通过以TRPML1为切入点，应用TRPML1的特异性小分子激动剂ML-SA5调控自噬活性，发现TRPML1介导的自噬抑制可以抑制人黑色素瘤、神经胶质瘤在体外的迁移与侵袭，同时ML-SA5作为TRPML1的特异性小分子激动剂可以有效地抑制在体实验中人黑色素瘤细胞向裸鼠肺脏的转移。鼠肺脏的转移。鼠肺脏的转移。


技术研发人员：王欣艳 刘宇程 丁顾炀 聂小丫 孙晨霖 李韵晗
受保护的技术使用者：徐州医科大学
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/7/31