一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法与流程

1.本发明属于壳聚糖生产技术领域，具体涉及一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法。


背景技术：

2.壳聚糖作为自然界唯一存在的碱性阳离子多糖，是近年来公认的既具有一定抑菌作用，又具有良好保鲜效果的果蔬涂膜保鲜剂。壳聚糖能抑制一些真菌、细菌和病毒的生长繁殖，其抑菌机理也有较多研究，此外壳聚糖还有吸湿保湿性、抗氧化性等优点，被广泛应用于食品和医药等领域。
3.目前生产壳聚糖主要使用的化学法(40％以上氢氧化钠)存在诸多问题，例如，能耗大、产品质量(主要是指提取率和纯度)不稳定，尤为严重的是排放物造成了巨大的环境污染，对周边生态破坏严重，后期环保处理成本较高。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，甲壳素在微波辅助条件下进行酶解，并利用超临界二氧化碳萃取工艺对粗壳聚糖进行纯化，最终得到提取率和纯度均较高的壳聚糖。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，该方法包括以下步骤：
7.(1)将甲壳素用流水冲洗至表面没有杂质后，常温风干，粉碎，备用；
8.(2)向甲壳素粉末中加入双氧水，迅速升温氧化，得到氧化壳聚糖，冷却至室温；
9.(3)向氧化壳聚糖中加入复合蛋白酶，放入微波反应器进行反应；处理结束后加热灭酶，得到壳聚糖粗液；
10.(4)将经步骤(3)得到的壳聚糖粗液过滤后清水冲洗至ph至中性；
11.(5)将步骤(4)得到的产物低温烘干，将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中，萃取完成后残留物料即为纯化后的壳聚糖。
12.所述方法，甲壳素粉碎至100～120目。
13.所述方法，甲壳素氧化前，先将甲壳素粉末加入到0.1mol/l的盐酸溶液中，固液比为1∶3～1∶8，50～70℃下搅拌3～4小时，随后过滤分离，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；然后将所得物料加入到质量分数15wt％的氢氧化钾溶液中，固液比为1∶12，充分搅拌1～2h，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性。
14.所述方法，双氧水质量浓度为10％～15％，氧化温度为60～80℃，氧化时间为0.1～1.5h；优选双氧水质量浓度为13％～15％，氧化温度为68～75℃，氧化时间为1～1.5h。
15.所述方法，复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中任意两种的
混合物，酶活力2万单位～4万单位，酶解温度为38～40℃；在100℃灭活处理10～15min。
16.所述方法，微波处理1～5h，所使用微波反应器磁通管频率为1800-2500mhz，功率为500-1000w。
17.所述方法，微波处理2～4h，所使用微波反应器磁通管频率为2000-2300mhz，功率为650-800w；优选为微波处理3h，所使用微波反应器磁通管频率为2180mhz，功率为750w；。
18.所述方法，一次微波处理1～5h，结束后恒温静置0.5～2h，然后加入与之前完全相同的复合蛋白酶，再次微波处理1～5h。
19.所述方法，一次微波处理2～4h，结束后恒温静置1h，然后加入与之前完全相同的复合蛋白酶，再次微波处理2～4h。
20.所述方法，低温烘干温度为40～60℃；超临界二氧化碳萃压力10～12mpa、温度35～55℃、二氧化碳流速6～8kg/h，处理时间为1～2h。
21.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
22.本发明甲壳素在微波辅助条件下进行酶解，并利用超临界二氧化碳萃取工艺对粗壳聚糖进行纯化，最终得到提取率(达到60.8％)和纯度(达到99.9％)均较高的壳聚糖。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
24.实施例1
25.一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，包括以下步骤：
26.(1)将甲壳素用流水冲洗至表面没有杂质后，常温风干，甲壳素粉碎至100～120目；
27.(2)向甲壳素粉末中加入质量浓度为13％的双氧水，迅速升温至75℃氧化1.5h，得到氧化壳聚糖，冷却至室温；
28.(3)向氧化壳聚糖中加入枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，酶活力为4万单位；放入微波反应器在38℃下微波处理4h，微波反应器磁通管频率为2300mhz，功率为800w；处理结束后加热至100℃灭活处理15min，得到壳聚糖粗液；
29.(4)将经步骤(3)得到的壳聚糖粗液过滤后清水冲洗至ph至中性；
30.(5)将步骤(4)得到的产物60℃低温烘干，将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中，在超临界二氧化碳萃压力10mpa、温度35℃、二氧化碳流速6kg/h条件下处理2h，萃取完成后残留物料即为纯化后的壳聚糖。
31.实施例2
32.一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，包括以下步骤：
33.(1)将甲壳素用流水冲洗至表面没有杂质后，常温风干，甲壳素粉碎至100～120目；
34.(2)将甲壳素粉末加入到0.1mol/l的盐酸溶液中，固液比为1∶8，70℃下搅拌3小时，随后过滤分离，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；然后将所得物料加入到质量分数15wt％的氢氧化钾溶液中，固液比为1∶12，充分搅拌2h，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
35.(3)向所得固体中加入质量浓度为13％的双氧水，迅速升温至75℃氧化1.5h，得到氧化壳聚糖，冷却至室温；
36.(4)向氧化壳聚糖中加入枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，酶活力为4万单位；放入微波反应器在38℃下微波处理4h，微波反应器磁通管频率为2300mhz，功率为800w；处理结束后加热至100℃灭活处理15min，得到壳聚糖粗液；
37.(5)将经步骤(3)得到的壳聚糖粗液过滤后清水冲洗至ph至中性；
38.(6)将步骤(4)得到的产物60℃低温烘干，将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中，在超临界二氧化碳萃压力10mpa、温度35℃、二氧化碳流速6kg/h条件下处理2h，萃取完成后残留物料即为纯化后的壳聚糖。
39.实施例3
40.一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，包括以下步骤：
41.(1)将甲壳素用流水冲洗至表面没有杂质后，常温风干，甲壳素粉碎至100～120目；
42.(2)将甲壳素粉末加入到0.1mol/l的盐酸溶液中，固液比为1∶8，70℃下搅拌3小时，随后过滤分离，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；然后将所得物料加入到质量分数15wt％的氢氧化钾溶液中，固液比为1∶12，充分搅拌2h，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
43.(3)向甲壳素粉末中加入质量浓度为13％的双氧水，迅速升温至75℃氧化1.5h，得到氧化壳聚糖，冷却至室温；
44.(4)向氧化壳聚糖中加入枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，酶活力为4万单位；放入微波反应器在38℃下一次微波处理4h，结束后恒温静置1h，然后加入与之前完全相同的复合蛋白酶，再次微波处理4h，微波反应器磁通管频率为2300mhz，功率为800w；处理结束后加热至100℃灭活处理15min，得到壳聚糖粗液；
45.(5)将经步骤(3)得到的壳聚糖粗液过滤后清水冲洗至ph至中性；
46.(6)将步骤(4)得到的产物60℃低温烘干，将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中，在超临界二氧化碳萃压力10mpa、温度35℃、二氧化碳流速6kg/h条件下处理2h，萃取完成后残留物料即为纯化后的壳聚糖。
47.实施例4
48.一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，包括以下步骤：
49.(1)将甲壳素用流水冲洗至表面没有杂质后，常温风干，甲壳素粉碎至100～120目；
50.(2)将甲壳素粉末加入到0.1mol/l的盐酸溶液中，固液比为1∶3，50℃下搅拌3小时，随后过滤分离，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；然后将所得物料加入到质量分数15wt％的氢氧化钾溶液中，固液比为1∶12，充分搅拌2h，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
51.(3)向甲壳素粉末中加入质量浓度为15％的双氧水，迅速升温至75℃氧化1.5h，得到氧化壳聚糖，冷却至室温；
52.(4)向氧化壳聚糖中加入枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，酶活力为4万单位；放入微波反应器在40℃下一次微波处理3h，结束后恒温静置1h，然后加入与之前完全相同的复合蛋白酶，再次微波处理3h，微波反应器磁通管频率为2000mhz，功率为1000w；处理结束后加热至100℃灭活处理15min，得到壳聚糖粗液；
53.(5)将经步骤(3)得到的壳聚糖粗液过滤后清水冲洗至ph至中性；
54.(6)将步骤(4)得到的产物60℃低温烘干，将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳
萃取器中，在超临界二氧化碳萃压力10mpa、温度35℃、二氧化碳流速6kg/h条件下处理2h，萃取完成后残留物料即为纯化后的壳聚糖。
55.实施例5
56.一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，包括以下步骤：
57.(1)将甲壳素用流水冲洗至表面没有杂质后，常温风干，甲壳素粉碎至100～120目；
58.(2)将甲壳素粉末加入到0.1mol/l的盐酸溶液中，固液比为1∶3，50℃下搅拌3小时，随后过滤分离，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；然后将所得物料加入到质量分数15wt％的氢氧化钾溶液中，固液比为1∶12，充分搅拌2h，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
59.(3)向甲壳素粉末中加入质量浓度为15％的双氧水，迅速升温至75℃氧化1.5h，得到氧化壳聚糖，冷却至室温；
60.(4)向氧化壳聚糖中加入枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，酶活力为4万单位；放入微波反应器在40℃下一次微波处理5h，结束后恒温静置1h，然后加入与之前完全相同的复合蛋白酶，再次微波处理5h，微波反应器磁通管频率为1800mhz，功率为1000w；处理结束后加热至100℃灭活处理15min，得到壳聚糖粗液；
61.(5)将经步骤(3)得到的壳聚糖粗液过滤后清水冲洗至ph至中性；
62.(6)将步骤(4)得到的产物60℃低温烘干，将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中，在超临界二氧化碳萃压力12mpa、温度55℃、二氧化碳流速6kg/h条件下处理1h，萃取完成后残留物料即为纯化后的壳聚糖。
63.实施例5
64.一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，包括以下步骤：
65.(1)将甲壳素用流水冲洗至表面没有杂质后，常温风干，甲壳素粉碎至100～120目，备用；
66.(2)将甲壳素粉末加入到0.1mol/l的盐酸溶液中，固液比为1∶5，60℃下搅拌3小时，随后过滤分离，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；然后将所得物料加入到质量分数15wt％的氢氧化钾溶液中，固液比为1∶12，充分搅拌2h，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
67.(3)向甲壳素粉末中加入质量浓度为13％的双氧水，迅速升温至70℃氧化1.5h，得到氧化壳聚糖，冷却至室温；
68.(4)向氧化壳聚糖中加入枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合蛋白酶，酶活力为3万单位；放入微波反应器在40℃下一次微波处理3h，结束后恒温静置2h，然后加入与之前完全相同的复合蛋白酶，再次微波处理3h，微波反应器磁通管频率为2180mhz，功率为750w；处理结束后加热至100℃灭活处理15min，得到壳聚糖粗液；
69.(5)将经步骤(3)得到的壳聚糖粗液过滤后清水冲洗至ph至中性；
70.(6)将步骤(4)得到的产物60℃低温烘干，将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中，在超临界二氧化碳萃压力11mpa、温度45℃、二氧化碳流速6kg/h条件下处理1h，萃取完成后残留物料即为纯化后的壳聚糖。
71.对实施例1-6不同处理条件下壳聚糖提取率和纯度进行测试，结果如表1所示。纯度采用液相色谱进行测定，提取率(％)＝提取物重量*100/原料。
72.表1实施例1-6不同处理条件下壳聚糖提取率和纯度结果
73.组别实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6提取率/％42.945.148.154.150.760.8纯度/％89.190.598.199.999.999.9

技术特征：
1.一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将甲壳素用流水冲洗至表面没有杂质后，常温风干，粉碎，备用；(2)向甲壳素粉末中加入双氧水，迅速升温氧化，得到氧化壳聚糖，冷却至室温；(3)向氧化壳聚糖中加入复合蛋白酶，放入微波反应器进行反应；处理结束后加热灭酶，得到壳聚糖粗液；(4)将经步骤(3)得到的壳聚糖粗液过滤后清水冲洗至ph至中性；(5)将步骤(4)得到的产物低温烘干，将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中，萃取完成后残留物料即为纯化后的壳聚糖。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，甲壳素粉碎至100～120目。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，甲壳素氧化前，先将甲壳素粉末加入到0.1mol/l的盐酸溶液中，固液比为1∶3～1∶8，50～70℃下搅拌3～4小时，随后过滤分离，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；然后将所得物料加入到15wt％的氢氧化钾溶液中，固液比为1∶12，充分搅拌1～2h。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，双氧水质量浓度为10％～15％，氧化温度为60～80℃，氧化时间为0.1～1.5h。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，复合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中任意两种的混合物，酶活力2万单位～4万单位，酶解温度为38～40℃；在100℃灭活处理10～15min。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，微波处理1～5h，所使用微波反应器磁通管频率为1800-2500mhz，功率为500-1000w。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，微波处理2～4h，所使用微波反应器磁通管频率为2000-2300mhz，功率为650-800w。8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，一次微波处理1～5h，结束后恒温静置0.5～2h，然后加入与之前完全相同的复合蛋白酶，再次微波处理1～5h。9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，一次微波处理2～4h，结束后恒温静置1h，然后加入与之前完全相同的复合蛋白酶，再次微波处理2～4h。10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，低温烘干温度为40-60℃；超临界二氧化碳萃压力10～12mpa、温度35～55℃、二氧化碳流速6～8kg/h，处理时间为1～2h。

技术总结
本发明公开了一种酶法和微波辅助联合降解甲壳素高效提纯壳聚糖的方法，属于壳聚糖生产技术领域。该方法为将甲壳素用流水冲洗至表面没有杂质后，常温风干，粉碎；向其中加入双氧水，迅速升温氧化，得到氧化壳聚糖，冷却；向其中加入复合蛋白酶，放入微波反应器反应；加热灭酶，得到壳聚糖粗液；将壳聚糖粗液过滤后清水冲洗至pH至中性；将产物低温烘干，放入超临界二氧化碳萃取器中，萃取完成后残留物料即为纯化后的壳聚糖。本发明甲壳素在微波辅助条件下进行酶解，并利用超临界二氧化碳萃取工艺对粗壳聚糖进行纯化，最终得到提取率和纯度均较高的壳聚糖。高的壳聚糖。


技术研发人员：丁振中 张超 王士刚 陆金森 陈磊
受保护的技术使用者：扬州日兴生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/1