一种蜕皮激素含量及有关物质的检测方法与流程

1.本发明属于物质检测技术领域，特别是涉及一种蜕皮激素含量及有关物质的检测方法。


背景技术：

2.蜕皮激素是无脊椎动物类固醇激素家族，参与调节蜕皮、发育和繁殖，英文名称ecdysteroids。蜕皮甾酮并没有荷尔蒙的相互作用，不会对性腺轴产生抑制。它们的结构、极性、体积和形状与脊椎动物类固醇激素明显不同。根据其分布，分为：如果存在于无脊椎动物中，是动物蜕皮激素即zooecdysteroids，如果分布在植物中就是植物蜕皮激素，即phytoecdysteroids(有助于威慑无脊椎动物捕食者)。1976年露水草提取物问世主要的作用实际上停留在治疗关节炎，祛湿，消肿之类降低胆固醇和降低血糖浓度的传统中医治疗。2000年左右，露水草提取物中的蜕皮甾酮才被逐渐重视，化妆品，保健品才纷纷加入。它能促进胶原蛋白合成，促进真皮细胞分裂、生长；增加骨骼肌和心脏的蛋白质合成；增加肌肉中的atp合成；刺激红细胞的产生降低糖尿病动物的高血糖症降低甘油三酯脂肪酶的活性；防止兔实验性动脉粥样硬化；激活大脑中的乙酰胆碱酯酶；激活大脑中的谷氨酸脱羧酶；具有免疫调节活性；降低血浆胆固醇水平。
3.目前并没有任何文献公开过该蜕皮激素含量及有关物质的高效液相检测方法，也没有明确的该蜕皮激素有关物质的结构。本专利将公开一种高效液相色谱法对该蜕皮激素含量及有关物质进行检测，同时公开该蜕皮激素有关物质的结构。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种蜕皮激素含量及有关物质的检测方法，解决了以上问题。
5.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
6.本发明的一种蜕皮激素含量及有关物质的检测方法，包括；
7.s1、配制蜕皮激素对照品及供试品溶液。
8.s2、按以下色谱条件对步骤一的对照品、供试品进样，色谱条件：检测波长为254nm；柱温为25℃；流动相分为流动相a，流动相b；流动相a：(水+0.1％三氟乙酸)，流动相b：(乙腈+0.1％三氟乙酸)。梯度洗脱：0到30min，流动相a从90％变化到70％，流动相b从10％变化到30％；30到32min，流动相a，流动相b比例保持不变；32到32.1min流动相a从70％变化到20％，流动相b从30％变化到80％；32.1到35min，流动相a，流动相b比例保持不变；35到35.1min，流动相a从20％变化到90％，流动相b从80％变化到10％，恢复初始比例，35.1到40min，流动相a，流动相b比例不变，运行时间40min。流速：1.1ml/min。
9.进一步地，s2步骤中色谱条件：最优检测波长为254nm。
10.进一步地，s2步骤中色谱条件：s2步骤最优柱温为25℃。
11.进一步地，s2步骤中色谱条件，最优流动相流速为1.1ml/min。
12.进一步地，s2步骤中色谱条件，最优进样量为2微升。
13.进一步地，s2步骤中色谱条件，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。
14.进一步地，s2步骤中色谱柱最优选择是waters xbridge c18，4.6
×
150mm，3.5μ。
15.进一步地，s1步骤中使用的稀释剂为水：乙腈＝50:50(％；v/v)。
16.进一步地，s1步骤中的空白溶液为稀释剂。
17.进一步地，s1中对照品、供试品浓度为2.5mg/ml。
18.启动数据分析工作站，面积百分比法，计算含量。
19.明确该蜕皮激素有关物质的结构。
20.本发明相对于现有技术包括有以下有益效果：
21.本发明对蜕皮激素含量及有关物质的检测具有很高的灵敏度及专属性。
22.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为具体实施例中蜕皮激素std的红外图谱；
25.图2为具体实施例中蜕皮激素样品的红外图谱；
26.图3为具体实施例中蜕皮激素样品的红外图谱
27.图4为具体实施例中空白溶液的色谱图；
28.图5为具体实施例中蜕皮激素对照品的色谱图；
29.图6为具体实施例中蜕皮激素供试品的色谱图；
30.图7为具体实施例中蜕皮激素供试品的色谱图；
31.图8为蜕皮激素的化学结构图；
32.图9为蜕皮激素有关物质中17β-oh蜕皮甾酮的化学结构图；
33.图10为蜕皮激素有关物质中17α-oh蜕皮甾酮的化学结构图；
34.图11为蜕皮激素有关物质中土克蜕皮甾酮的化学结构图；
35.图12为蜕皮激素有关物质中20,26-双羟基蜕皮甾酮的化学结构图；
36.图13为蜕皮激素有关物质中红苋甾酮的化学结构图；
37.图14为蜕皮激素有关物质中20e的化学结构图；
38.图15为蜕皮激素有关物质中牛膝甾酮的化学结构图；
39.图16为蜕皮激素有关物质中2-去氧-20,26-双羟基蜕皮甾酮的化学结构图；
40.图17为蜕皮激素有关物质中坡斯特甾酮的化学结构图；
41.图18为蜕皮激素有关物质中旌节花甾酮c、d的化学结构图；
42.图19为蜕皮激素有关物质中3-乙酰基-20e的化学结构图；
43.图20为蜕皮激素有关物质中筋骨草甾酮c的化学结构图；
44.图21为蜕皮激素有关物质中2-乙酰基-20e的化学结构图。
具体实施方式
45.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
46.本发明的一种蜕皮激素含量及有关物质的检测方法，本具体实施例中具体如下：
47.1、实验方法
48.1.1色谱条件
[0049][0050]
1.2溶液配制
[0051]
①
稀释剂：水：乙腈＝50:50(％；v/v)
[0052]
②
空白溶液：即稀释剂
[0053]
③
流动相a：(水+0.1％三氟乙酸)(如：水+三氟乙酸＝2000ml水+2ml三氟乙酸)
[0054]
④
流动相b：(乙腈+0.1％三氟乙酸)(如：乙腈+三氟乙酸＝2000ml乙腈+2ml三氟乙酸)
[0055]
⑤
标准溶液t(2.5)：取蜕皮激素标准品约125mg，精密称定，置于50ml棕色容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，得浓度约2.5mg/ml的标准溶液t(2.5)，平行配制2份，得标准溶液-1【t(2.5)
[0056]-1】，标准溶液-2【t(2.5)-2】；进样前用0.45μm滤膜过滤。
[0057]
⑥
sst-hplc溶液：取标准溶液t(2.5)约50μl，置于100ml棕色容量瓶中，用稀释剂
定容，摇匀，得浓度约1.25μg/ml的sst溶液；进样前用0.45μm滤膜过滤。
[0058]
⑦
供试品溶液：精密称定蜕皮激素成品供试品约125mg，置于50ml棕色容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，平行配制2份，得供试品溶液s1，供试品溶液s2；进样前用0.45μm滤膜过滤。
[0059]
1.3有关物质信息
[0060][0061]
实施案例
[0062]
1、分析方法验证结果如下：
[0063]
1.1专属性
[0064]
1.1.1溶液配制
[0065][0066]
[0067]
1.1.2测试结果
[0068][0069][0070]
1.2定量限和检测限1.2.1系统适用性
[0071]
①
系统适用性溶液配制
[0072][0073]
②
系统适用性检测结果
[0074]
[0075][0076]
1.2.2定量限和检测限溶液配制
[0077]
①
蜕皮激素定量限溶液：取标准溶液t(2.5)进行稀释或者直接称取5mg蜕皮激素标准品进行稀释，直至信噪比s/n≥10:1。
[0078]
②
检测限溶液配制：将定量限溶液稀释至信噪比s/n≥3:1即为检测限溶液。
[0079][0080]
1.2.3定量限和检测限测试结果
[0081]
①
定量限测试结果
[0082][0083][0084]
②
检测限测试结果
[0085][0086]
1.3精密度
[0087]
1.3.1重复性
[0088]
①
系统适用性：详见“1.2定量限和检测限”项下的“1.2.1系统适用性”。
[0089]
②
溶液配制：供试品溶液配制：精密称定蜕皮激素供试品约125mg，置于50ml棕色容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，平行配制6份；进样前用0.45μm滤膜过滤。
[0090][0091]
③
检测结果
[0092][0093]
[0094]
1.3.2中间精密度2
①
系统适用性
[0095][0096][0097][0098]
②
溶液配制：供试品溶液配制：精密称定蜕皮激素供试品约125mg，置于50ml棕色容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，平行配制6份；进样前用0.45μm滤膜过滤。
[0099][0100]
③
检测结果
[0101][0102][0103]
1.3.3中间精密度3
①
系统适用性
[0104]
[0105][0106][0107]
②
溶液配制：供试品溶液配制：精密称定蜕皮激素供试品约125mg，置于50ml棕色容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，平行配制6份；进样前用0.45μm滤膜过滤。
[0108][0109]
③
检测结果
[0110][0111]
1.3.4中间精密度合并后结果
[0112][0113]
1.4溶液稳定性
[0114]
1.4.1系统适用性
[0115]
①
t(2.5)、sst-hplc溶液冷藏0d。
[0116]
[0117][0118][0119]
②
适用于t(2.5)、sst-hplc溶液冷藏4d。
[0120][0121][0122]
③
适用于t(2.5)、sst-hplc溶液冷藏10d：详见“1.2定量限和检测限”项下的“1.2.1系统适用性”。
[0123]
④
适用于t(2.5)、sst-hplc溶液冷藏19d。
[0124][0125][0126]
⑤
适用于t(2.5)、sst-hplc溶液冷藏30d。
[0127]
[0128]
[0129][0130]
1.4.2溶液配制
[0131]
①
标准溶液t(2.5)：取蜕皮激素标准品约125mg，精密称定，置于50ml棕色容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，即得；进样前用0.45μm
[0132]
滤膜过滤。
[0133]
②
sst-hplc溶液：取标准溶液t(2.5)约50μl，置于100ml棕色容量瓶中，用稀释剂溶解，定容，摇匀，得浓度约1.25μg/ml的sst溶液；进样前用0.45μm滤膜过滤。
[0134]
●
室温条件下分别于0、6、12、24、48、72、96小时进样，通过规定时间内蜕皮激素的峰面积与0h比较的变化值来判断溶液的稳定性情况。
[0135]
●
2℃～8℃条件下分别于0d，3d，10d，21d，30d，35d进样，通过规定时间内蜕皮激素的峰面积与0h比较的变化值//蜕皮激素的信噪比s/n来判断溶液的稳定性情况。
[0136]
[0137]
1.4.3检测结果
[0138]
①
冷藏t(2.5)检测结果
[0139][0140]
②
冷藏sst-hplc溶液检测结果
[0141][0142]
1.5供试品检测批号：210301-ngb1968
[0143]
1.5.1水分
[0144]
①
仪器
[0145][0146][0147]
②
检验
[0148][0149]
1.5.2ir鉴别
①
仪器
[0150][0151]
②
试剂、标准品信息
[0152][0153]
③
检验
[0154]
a前处理过程
[0155][0156][0157]
b制备过程
[0158]
环境温度(℃)16环境相对湿度(％rh)50标准品称样量(mg)1.035溴化钾称样量(mg)100.116供试品称样量(mg)1.040溴化钾称样量(mg)100.021
[0159]
c仪器参数设置
[0160]
扫描波数范围4000cm-1
～400cm-1
分辨率2cm扫描次数16次//
[0161]
d测试结果
[0162][0163]
1.5.3hplc鉴别：含量测定项下的色谱图中样品溶液主峰的保留时间与标准溶液主峰的保留时间一致。
[0164][0165]
1.5.4含量及有关物质
[0166]
①
系统适用性：详见详见“1.4溶液稳定性”项下的
“⑤
适用于t(2.5)、sst-hplc溶液冷藏30d。”[0167]
②
供试品溶液配制：按照1.2平行配制3份。
[0168]
样品编号称样量(mg)溶解体积(ml)浓度(mg/ml)tpjs-220411-4-1125.1650c＝2.5032tpjs-220411-4-2125.3650c＝2.5072tpjs-220411-4-3125.9750c＝2.5194
[0169]
③
检测结果
[0170]
a含量检测结果
[0171]
[0172][0173]
b有关物质检测结果
[0174][0175]
2.结论
[0176]
[0177]
[0178][0179]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

技术特征：
1.一种蜕皮激素含量及有关物质的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、配制蜕皮激素对照品及供试品溶液，所使用的稀释剂为水：乙腈＝50:50(％；v/v)；s2、按以下色谱条件对s1步骤的对照品、供试品进样，空白溶液为稀释剂，色谱条件：检测波长为254nm；色谱柱的柱温为25℃；流动相分为流动相a，流动相b；流动相a：水+0.1％三氟乙酸；流动相b：色谱级乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱：0到30min，流动相a从90％变化到70％，流动相b从10％变化到30％；30到32min，流动相a，流动相b比例保持不变；32到32.1min流动相a从70％变化到20％，流动相b从30％变化到80％；32.1到35min，流动相a，流动相b比例保持不变；35到35.1min，流动相a从20％变化到90％，流动相b从80％变化到10％，恢复初始比例，35.1到40min，流动相a，流动相b比例不变，运行时间40min，流动相流速为1.1ml/min，进样量2.0微升。2.根据权利要求1所述的一种蜕皮激素含量及有关物质的检测方法，其特征在于，所述s2步骤中检测波长采用紫外线检测器或二极管阵列检测器。3.根据权利要求1所述的一种蜕皮激素含量及有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

技术总结
本发明公开了一种蜕皮激素含量及有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，检测波长为254nm；采用紫外线或二极管阵列检测器；柱温为25℃；流速为：1.1ml/min，稀释剂为水：乙腈＝50:50(％；v/v)；流动相分为流动相A，流动相B；流动相A：水+0.1％三氟乙酸，流动相B：乙腈+0.1％三氟乙酸；洗脱程序如下：0到30min，流动相A从90％变化到70％，流动相B从10％变化到30％；30到32min，流动相A，流动相B比例保持不变；32到32.1min流动相A从70％变化到20％，流动相B从30％变化到80％；32.1到35min，流动相A，流动相B比例保持不变；35到35.1min，流动相A从20％变化到90％，流动相B从80％变化到10％，恢复初始比例，35.1到40min，流动相A，流动相B比例不变，运行时间40min，具有很高的灵敏度及专属性。专属性。专属性。


技术研发人员：赵晓怡 杨青春 胡倩 滕院 马秋丽 毛自平 蔡克仙 申文静 陆春梅 张丽华 李文
受保护的技术使用者：云南汉德生物技术有限公司
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/1