一种免疫相关不良反应事件发生的预测模型的构建方法及标志物和试剂盒

1.本发明属于生物检测领域，涉及一种标志物和试剂盒，具体来说是一种免疫相关不良反应事件发生的预测模型的构建方法及标志物和试剂盒。


背景技术：

2.随着肿瘤免疫学的快速发展，肿瘤免疫治疗尤其是免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，icis)的应用已然重塑了多种癌症治疗的新范式，为很多难治性晚期肿瘤患者带来了新的治疗选择和疾病的缓解。传统的icis药物，包括抗细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4)和靶向程序性死亡受体1(pd-1)/程序性死亡受体-配体1(pd-l1)的检查点抑制剂，已被批准用于治疗多种癌症，如黑色素瘤、非小细胞肺癌等。然而，icis药物在有效激活机体的抗肿瘤免疫反应的同时，它们也可能会带来免疫相关的不良反应，统称为免疫相关不良事件(immune-related adverse events，iraes)。据统计，将近1/2的使用icis药物的肿瘤患者会发生iraes。
3.iraes的发生主要是由于机体自身免疫效应过度激活而导致正常组织的损害，严重的iraes会导致icis药物的停用，同时可致全身多处靶器官的损害甚至是危及生命。常见iraes临床表现可以从轻微程度(如呕吐或皮疹)到严重(如肺炎、心肌炎)。值得注意的是，与没有发生iraes的患者相比，据统计发生iraes的患者通常与更好的临床预后相关，患者无进展生存期(progression free survival，pfs)和总生存期(overall survival，os)可相对改善，甚至不少发明针对iraes建立的预测模型对于疗效也有很好的预测作用。
4.因此，有效预防和治疗iraes，对于最大程度地发挥免疫疗法的效用具有十分重要的临床意义。临床上，肿瘤科医生在开具icis处方之前，必须权衡患者发生iraes的风险及其对于icis的临床效益。这推动了对识别iraes发展和严重程度的潜在生物标志物相关发明的展开。开发出高效的识别及预测iraes发生的生物标志物，从而指导这些icis物的合理处方，以为高危患者制定监测策略，以便更早地发现和干预iraes。尽管越来越多的发明旨在挖掘识别易发免疫不良反应患者的潜在机制和相应策略，但由于缺乏科学严谨性和可重复性，加之临床上iraes判定标准的复杂性和临床发明规模的局限性，使得识别iraes高效生物标志物的综合方法具有挑战性。
5.越来越多的发明表明，肠道菌群可以协同ici治疗提高抗肿瘤疗效或影响iraes的发展。靶向肠道微生物组被证实可增强ici疗效同时减轻毒性。补充特定的益生菌可以缓解小鼠免疫检查点抑制剂相关的结肠炎，粪便微生物群移植(fmt)在临床中已被证明可以有效治疗难治性免疫检查点抑制剂相关的结肠炎。因此，使用肠道微生物群作为对预防和治疗iraes的新型生物标志物具有很大的应用前景。最近，一些发明也提出了基于肠道微生物群的特定疾病预测模型和icis疗效。一组基线肠道微生物组构成的生物标志物可以预测从接受icis药物治疗中受益更多的候选患者。然而，用于预测免疫治疗期间不良事件较少的患者的高效微生物生物标志物几乎没有被提出。此外，开发潜在的微生物生物标志物来预
测iraes的发生概率，并发现驱动检查点阻断毒性的潜在机制，将具有重要的临床意义。更有针对性的治疗策略可以在治疗前识别高危患者，从而提供预防方法以减轻不良反应。
6.粪便肠道微生物定量技术：包括高通量测序技术(包括16s rdna测序以及鸟枪法(shotgun)宏基因组测序技术)以及实时荧光定量pcr可特异性检测粪便中肠道微生物群的相对丰度。随着高通量技术的普及应用，其高效，受众广，检测微生物群范围覆盖全等优点可以快速了解多个样本的肠道菌群的丰度特征。对于科学发明及临床实践应用都有着广泛的应用前景，有助于更好的了解肠道微生物群与疾病之间的联系。然而由于肠道菌群的多样性特点，在不同发明队列内所筛选出的与疾病相关的特征性微生物群存在较大的差异，这一定程度上受限于不同发明队列的样本数目，患者来源，以及测序平台和测序策略等因素，整合多个发明队列，进行特异性的菌群筛选和分析能够辅助开发更加高效的微生物预测模型，同时帮助更好地探索肠道微生物与宿主疾病之间的联系。


技术实现要素：

7.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种免疫相关不良反应事件发生的预测模型的构建方法及标志物和试剂盒，所述的这种免疫相关不良反应事件发生的预测模型的构建方法及标志物和试剂盒要解决现有技术中对于预防和治疗免疫相关不良事件的效果不佳的技术问题。
8.本发明提供了一种免疫相关不良反应事件发生的预测模型的构建方法，包括如下步骤：
9.1)微生物标志物筛选及模型构建：
10.利用已发表的包含“免疫检查点抑制剂不良反应”(immune-related adverse events，iraes)以及“肠道菌群”(gut microbiome)数据的相关研究作为训练集，针对训练集数据，对纳入的与免疫相关不良反应相关的微生物标记物进行迭代特征筛选，利用机器学习算法(随机森林算法构建决策树模型)，使用迭代特征提取出用于构建模型的微生物特征，获得十四个肠道微生物标志物，所述的十四个肠道微生物标志物如下所示：enterococcus faecalis、massilimicrobiota timonensis、enterocloster aldenensis、ligilactobacillus salivarius、ruminococcus bromii、porphyromonas somerae、agathobacter rectalis、actinomyces oris、subdoligranulum variabile、prevotella buccalis、parabacteroides merdae、beduinibacterium massiliense、parabacteroides goldsteinii、ruminococcus champanellensis；
11.2)在训练集所有研究中进行队列之间的交叉验证以及留一研究法验证来评估模型的稳定性和可重复性；
12.3)利用训练集数据，针对所筛选出的14个肠道微生物标志物，输入微生物特征丰度矩阵，利用python-scikit-learn中随机森林random forest函数，使用predict()函数预测发生概率，并计算不良反应评分rf score，利用约登指数计算不良反应评分的截断值，得到不良反应评分rf score＝0.499，并利用此截断值作为阈值用于后续验证模型的评估；
13.4)一个验证的过程，收集患者粪便，利用定量pcr测序技术或者微生物16s rdna测序技术获取粪便中步骤1)所得肠道菌群标志物的相对丰度特征；通过步骤3)的方法计算不良反应评分rf score，如果患者的不良反应评分小于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反
应高风险人群，如果患者不良反应评分大于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应低风险人群。
14.本发明还提供了肠道菌群标志物在制备预测免疫治疗不良反应的试剂盒中应用，肠道菌群标志物为enterococcus faecalis、massilimicrobiota timonensis、enterocloster aldenensis、ligilactobacillus salivarius、ruminococcus bromii、porphyromonas somerae、agathobacter rectalis、actinomyces oris、subdoligranulum variabile、prevotella buccalis、parabacteroides merdae、beduinibacterium massiliense、parabacteroides goldsteinii、ruminococcus champanellensis。
15.进一步的，收集患者粪便，通过实时定量pcr技术或者粪便微生物16s rdna测序技术获取粪便中上述肠道菌群标志物的相对丰度；将所述的肠道菌群标志物的相对丰度特征输入微生物特征丰度矩阵，利用python-scikit-learn中随机森林random forest函数predict()函数预测发生概率，并计算不良反应发生评分rf score，如果患者的评分小于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应高风险人群，如果患者评分大于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应低风险人群。
16.本发明还提供了一种预测免疫治疗不良反应的试剂盒，含有检测下述肠道菌群标志物的试剂，所述的肠道菌群标志物为enterococcus faecalis、massilimicrobiota timonensis、enterocloster aldenensis、ligilactobacillus salivarius、ruminococcus bromii、porphyromonas somerae、agathobacter rectalis、actinomyces oris、subdoligranulum variabile、prevotella buccalis、parabacteroides merdae、beduinibacterium massiliense、parabacteroides goldsteinii、ruminococcus champanellensis。
17.进一步的，收集患者粪便，通过实时定量pcr技术或者粪便微生物16s rdna测序技术获取粪便中上述肠道菌群标志物的相对丰度；输入微生物特征丰度矩阵，利用python-scikit-learn中随机森林random forest函数，使用predict()函数预测发生概率，并计算不良反应发生评分rf score，得到不良反应评分rf score＝0.499，如果患者的不良反应评分小于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应高风险人群，如果患者不良反应评分大于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应低风险人群。
18.进一步的，所述的试剂盒，可通过下述含有检测肠道菌群标志物的引物，利用实时定量pcr技术检测微生物丰度，所述的引物如下所示：
19.检测enterococcus faecalis的上游引物序列为：gttggtgaggtaacggctca；
20.检测enterococcus faecalis的下游引物序列为：tgctcggtcagactttcgtc；
21.检测massilimicrobiota timonensis的上游引物序列为：atacatgcaagtcggacgca；
22.检测massilimicrobiota timonensis的下游引物序列为：ggggcaggttgcttatgtct；
23.检测enterocloster aldenensis的上游引物序列为：gacgatcagtagccgacctg；
24.检测enterocloster aldenensis的下游引物序列为：cgggctttcactccagactt；
25.检测ligilactobacillus salivarius的上游引物序列为：agtcacggctaactacgtgc；
26.检测ligilactobacillus salivarius的下游引物序列为：accggctttgggtgttacaa；
27.检测ruminococcus bromii的上游引物序列为：gtgaggtaacggctcaccaa；
28.检测ruminococcus bromii的下游引物序列为：tgtctcagtcccaatgtggc；
29.检测porphyromonas somerae的上游引物序列为：atgatgtaggcggaatgcgt；
30.检测porphyromonas somerae的下游引物序列为：gtaagctgccttcgcaatcg；
31.检测agathobacter rectalis的上游引物序列为：acacgtgctacaatggcgta；
32.检测agathobacter rectalis的下游引物序列为：caccttccgatacggctacc；
33.检测actinomyces oris的上游引物序列为：ggaccggtttttgctggttc；
34.检测actinomyces oris的下游引物序列为：aaaacacccaaaggcgcatc；
35.检测subdoligranulum variabile的上游引物序列为：actcctgtcgttagggacga；
36.检测subdoligranulum variabile的下游引物序列为：tctacgcattccaccgctac；
37.检测prevotella buccalis的上游引物序列为：gcacggtaaacgatggatgc；
38.检测prevotella buccalis的下游引物序列为：tgtaacacgtgtgtagcccc；
39.检测parabacteroides merdae的上游引物序列为：gaggaaggtcccccacattg；
40.检测parabacteroides merdae的下游引物序列为：gtaagctgccttcgcaatcg；
41.检测beduinibacterium massiliense的上游引物序列为：agagatcgggaggaacacca；
42.检测beduinibacterium massiliense的下游引物序列为：gtttgctacccacgctttcg；
43.检测parabacteroides goldsteinii的上游引物序列为：gtgaggtaacggctcaccaa；
44.检测parabacteroides goldsteinii的下游引物序列为：ccttcatccttcacgcgact；
45.检测ruminococcus champanellensis的上游引物序列为：gacgatcagtagccggactg；
46.检测ruminococcus champanellensis的下游引物序列为：caatattccgcactgctgcc。
47.本发明利用已发表的包含“免疫检查点抑制剂不良反应”以及“肠道菌群”数据的相关研究作为训练集，通过机器学习方法，构建随机森林模型，最终利用共计14种肠道微生物标志物构建微生物预测模型，具体如
48.下表所示。
[0049][0050][0051]
利用python-scikit-learn中随机森林random forest函数，使用predict()函数预测发生概率，并计算不良反应评分rf score，利用约登指数计算不良反应评分的截断值(rf score＝0.499)。
[0052]
进一步的，除采用微生组中16s rdna测序以外，还可使用实时定量pcr定量检测预测不良反应事件发生的微生物群中1-14中的菌群丰度。
[0053]
进一步的，所述采用的实时定量pcr检测方法中，采用的预测不良反应事件发生的微生物群中1-14种的菌群特异性引物，同时需要标准的16s微生物引物作为标准品定量。
[0054]
本发明公开了用于预测接受抗pd-1/pd-l1免疫治疗的肿瘤患者免疫相关不良反应事件发生及严重程度的肠道菌群标志物。本发明系统性回顾了当前已发表发明(同时包含pd1免疫治疗患者免疫相关不良反应临床信息以及基线粪便微生物16s rdna测序信息的数据，n》50)，使用qiime2对所有16s测序原始数据进行质量控制及数据合并，利用ribosomal database project(rdp)数据库对细菌基因组进行注释，在种属的水平对细菌信息进行统计分析。最终在三个队列(n＝190)中筛选出14个与免疫相关不良反应事件发生相关的菌属，构建出免疫相关不良反应事件发生的预测模型，根据模型计算的风险评分可以有效预测接受免疫治疗患者免疫相关不良反应事件发生情况。
[0055]
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明提供一组用于预测icis药物iraes发生概率的肠道菌群标志物，试剂盒和模型的构建方法，肠道菌群特征与pd-1/pd-l1阻断治疗引起的免疫相关不良反应事件发生情况间的联系在不同类别的肿瘤中或许存在共性。本发明能够基于基线肠道微生物的多样性水平对使用免疫检查点抑制剂
药物(抗pd1/pd-l1药物)患者发生iraes进行预测并划分高低风险人群。本发明的肠道菌群构建的免疫相关不良反应事件预测风险模型具有在多种类型的肿瘤，如大肠癌/肺癌/黑色素瘤/胃癌等中应用前景并使患者获益的可能。
附图说明
[0056]
图1是模型建立流程图。
[0057]
图2是迭代特征筛选后，使用最佳微生物群进行发明间交叉验证以及留一法验证结果。
[0058]
图3是使用迭代特征筛选后，纳入模型auc最佳微生物群特征的10折交叉验证的roc曲线和曲线下最大面积auc值。
[0059]
图4.使用1个外部数据(上海队列为粪便16s rdna测序队列(n＝65))对训练集来源的模型预测评分进行验证(卡方检验)。
具体实施方式
[0060]
下面结合附图和具体的实施例来对本发明一种预测免疫治疗相关不良反应事件的肠道微生物模型及其构建方法作进一步地详细阐述，以求更为清楚明了地理解其结构类型和使用方式，但不能以此来限定本发明专利的保护范围。
[0061]
实施例1
[0062]
如图1所示，本发明通过对现有已发表的发明进行文献回顾：收集现有已发表的关于程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1(pd1/pd-l1)免疫检查点抑制剂治疗的相关发明。
[0063]
所纳入的发明具体需满足以下要求：
[0064]
1.单纯接受抗pd1/pdl1药物治疗的患者；
[0065]
2.发明可以提供详细的临床信息(特别是包括使用免疫治疗患者的预后及iraes信息)；
[0066]
3.发明提供可下载分析的原始16s rdna测序数据。
[0067]
最终纳入目前发表发明及其sra下载序列号：chau等(prjna687361)，hakozaki等(prjna606061)，zhang等(prjeb48780)，mcculloch等(prjna762360)。
[0068]
原始测序数据下载及处理：
[0069]
根据sra序列号，使用qiime2软件下载16s rdna原始测序数据，测序阅读框质控评分q》25，对所有16s rdna测序原始数据进行质量控制及数据合并，利用ribosomal database project(rdp)数据库对细菌基因组进行注释。
[0070]
混杂因素处理：
[0071]
鉴于不同发明所纳入的发明对象的人群特征(包括肿瘤类型，性别占比，年龄及bmi等)可能存在差异，同时不同发明队列上机测序的测序时间，测序平台，测序深度等都可能存在差异，发明对所获得的可能作为影响发明目的的诸多因素作为混杂因素进行处理，对影响较大的混杂因素分区间进行阻断(最终纳入发明数目(n》50)的发明队列作为训练集(n＝190)。
[0072]
重要微生物标志物筛选：
[0073]
考虑到“发明”所占据的混杂因素较大，发明人使用微生物组发明中异质性的统一
管道元分析方法(mmuphin)基于“发明”对微生物丰度矩阵进行批量校正。进一步使用r软件(v.4.1.2)中“coin”包中实现的双面阻断wilcoxon秩和检验逐一针对单个微生物标记物计算差异丰度的显著性，为了识别出更多潜在的微生物生物标志物，纳入p值《0.1的61个微生物特征进一步进行分析。
[0074]
不少发明指出获益于免疫检查点抑制剂的患者由于使用药物的时间延长，在一定程度上会导致不良反应事件发生的概率增大，使得疗效与不良反应之间存在一定的关联关系。故此，发明者使用相同的方法基于疗效筛选出与疗效相关的微生物标记物，并鉴定出与疗效相关的微生物群标记物(p《0.1)共计34个。随后在所筛选出的不良反应相关的微生物标记物中进一步剔除了与疗效相关的微生物群(n＝11)个，最终纳入51个与不良反应特异性相关的肠道微生物进行后续特征筛选和模型构建。
[0075]
微生物特征筛选和模型构建：
[0076]
发明人通过对训练集收集的患者的微生物特征及免疫不良反应结局进行整合分析，针对训练集数据(n＝190)，发明人对纳入的51个与不良反应相关的微生物标记物进行迭代特征筛选，利用机器学习算法——随机森林算法构建决策树模型，使用根节点数(n＝501)，每一子节点占据上一节点的10％。如图3所示，使用迭代特征提取出14个用于构建模型的最佳微生物特征，可使得受试者操作曲线(roc)下曲线最大面积(auc)达到最优(auc＝0.88)。
[0077]
利用eli5包(https://eli5.readthedocs.io/)中的permutation importance函数来计算模型的特征重要性，具体微生物特征及其在模型中的重要性如下表所示。
[0078][0079]
[0080]
如图2所示，为进一步验证所筛选出的模型中14个重要微生物特征在不同研究队列中都能得到稳定的应用，通过在训练集所有研究中进行队列之间的交叉验证(study-by-study cross-validation)以及留一研究验证法(leave-one-subject-out(loso)cross-validation)进一步评估了在模型在不同研究队列中的稳定性和可重复性。结果表明，发明人所筛选出的14个重要特征性微生物群在不同研究队列中都能得到较为稳定的应用。
[0081]
微生物预测不良反应评分及应用
[0082]
发明人利用训练集数据，针对所筛选出的14个重要特征，输入微生物特征丰度矩阵，使用randomfroest中的predict()函数预测发生不良反应的风险概率，并计算一个不良反应评分(称为rf score)，并利用约登指数(youden index)计算训练集的不良反应评分的截断值。并利用此截断值(rf score＝0.499)作为阈值用于后续验证模型的评估。
[0083]
实施例2
[0084]
实验方法
[0085]
使用1个泛癌队列进行外部验证
[0086]
患者招募及临床样本收集
[0087]
招募欲在临床行免疫治疗(pd-1/pd-l1抑制剂)的患者(泛癌种)患者共计65名，患者招募具体如下：
[0088]
【纳入标准】
[0089]
1)经组织病理学明确诊断的肿瘤患者；
[0090]
2)有明确可测量病灶；
[0091]
3)门诊及住院临床资料清晰可查，能规律入院进行疗效评估(包括核磁共振、胸腹增强ct及骨显像等影像学资料)；
[0092]
4)接受肿瘤免疫检查点抑制剂药物如抗pd1/pd-l1抑制剂等治疗的肿瘤患者。
[0093]
【排除标准】
[0094]
1)既往3个月内患有全身严重感染、鼻咽及口腔炎症(如牙周炎、牙龈炎、扁桃体炎等)、呼吸道感染、软组织或皮肤感染、脓肿、心内膜炎；
[0095]
2)既往3个月内使用过以下药物：抗生素、非甾体类抗炎药、益生菌、激素、免疫抑制剂超过1周；
[0096]
3)既往有严重便秘、腹泻，或3个月内排便习惯发生较大变化；
[0097]
4)既往有肿瘤个人史(口腔癌、咽喉癌、食管癌等)、器官移植史，或严重的寄生虫病史、消化系统其他疾病史(如炎症性肠病、肝硬化等)；
[0098]
5)3个月内患有创伤史、手术史等；
[0099]
6)既往3个月内存在消化性出血、梗阻、穿孔等情况；
[0100]
7)未受到良好控制的慢性代谢性、感染性或内分泌疾病(如高血压、糖尿病、高血脂、高尿酸、高嘌呤、甲状腺功能异常等)；
[0101]
8)素食主义者或3个月内用餐习惯发生较大改变。
[0102]
收集每位患者在接受免疫治疗前的基线样本数据(包括血浆、粪便标本)以及相应的临床信息(包括性别/年龄/体脂数/基础疾病/组织病理特点等)，并纵向地在每一次治疗周期末收集一次粪便，建立免疫治疗样本库，部分患者收集初诊时的肿瘤组织标本(包括活检及手术标本)。
[0103]
粪便标本采集方法如下：为防止收集的粪便受到尿液的污染，嘱发明对象排尿干净后再收集粪便。粪便标本质量至少5-10g，采集后的粪便标本保存于一次性无菌容器中，置于阴凉处(避免光照或高温)，即刻迅速冻存于-80℃冰箱。
[0104]
最终总共收集来自65名来自上海交通大学医学院附属仁济医院接受pd-1单抗药物/pd-l1单抗药物免疫治疗肿瘤患者的粪便，发明者对来自仁济医院患者的粪便进行16srdna测序，具体如下：
[0105]
最终总共收集来自65名来自上海交通大学医学院附属仁济医院接受pd-1单抗药物/pd-l1单抗药物免疫治疗肿瘤患者的粪便；研究者对来自仁济医院患者的粪便进行16srdna测序。具体如下：
[0106]
微生物实时定量pcr技术
[0107]
基于模型微生物合成设计相应引物，具体如下：
[0108]
检测enterococcus faecalis的上游引物序列为：gttggtgaggtaacggctca；
[0109]
检测enterococcus faecalis的下游引物序列为：tgctcggtcagactttcgtc；
[0110]
检测massilimicrobiota timonensis的上游引物序列为：atacatgcaagtcggacgca；
[0111]
检测massilimicrobiota timonensis的下游引物序列为：ggggcaggttgcttatgtct；
[0112]
检测enterocloster aldenensis的上游引物序列为：gacgatcagtagccgacctg；
[0113]
检测enterocloster aldenensis的下游引物序列为：cgggctttcactccagactt；
[0114]
检测ligilactobacillus salivarius的上游引物序列为：agtcacggctaactacgtgc；
[0115]
检测ligilactobacillus salivarius的下游引物序列为：accggctttgggtgttacaa；
[0116]
检测ruminococcus bromii的上游引物序列为：gtgaggtaacggctcaccaa；
[0117]
检测ruminococcus bromii的下游引物序列为：tgtctcagtcccaatgtggc；
[0118]
检测porphyromonas somerae的上游引物序列为：atgatgtaggcggaatgcgt；
[0119]
检测porphyromonas somerae的下游引物序列为：gtaagctgccttcgcaatcg；
[0120]
检测agathobacter rectalis的上游引物序列为：acacgtgctacaatggcgta；
[0121]
检测agathobacter rectalis的下游引物序列为：caccttccgatacggctacc；
[0122]
检测actinomyces oris的上游引物序列为：ggaccggtttttgctggttc；
[0123]
检测actinomyces oris的下游引物序列为：aaaacacccaaaggcgcatc；
[0124]
检测subdoligranulum variabile的上游引物序列为：actcctgtcgttagggacga；
[0125]
检测subdoligranulum variabile的下游引物序列为：tctacgcattccaccgctac；
[0126]
检测prevotella buccalis的上游引物序列为：gcacggtaaacgatggatgc；
[0127]
检测prevotella buccalis的下游引物序列为：tgtaacacgtgtgtagcccc；
[0128]
检测parabacteroides merdae的上游引物序列为：gaggaaggtcccccacattg；
[0129]
检测parabacteroides merdae的下游引物序列为：gtaagctgccttcgcaatcg；
[0130]
检测beduinibacterium massiliense的上游引物序列为：agagatcgggaggaacacca；
[0131]
检测beduinibacterium massiliense的下游引物序列为：gtttgctacccacgctttcg；
[0132]
检测parabacteroides goldsteinii的上游引物序列为：gtgaggtaacggctcaccaa；
[0133]
检测parabacteroides goldsteinii的下游引物序列为：ccttcatccttcacgcgact；
[0134]
检测ruminococcus champanellensis的上游引物序列为：gacgatcagtagccggactg；
[0135]
检测ruminococcus champanellensis的下游引物序列为：caatattccgcactgctgcc。微生物16s rdna测序技术
[0136]
实验步骤具体如下：
[0137]
1.粪便dna提取：采用hipure stool dna mini kit提取试剂盒(中国)提取100-200mg粪便样本中总微生物基因组dna。dna提取物放－80℃冰箱保存。
[0138]
1)转移100～200mg粪便样品至2ml离心管中，立即加入1.2ml buffer ssl至样品中，最高涡旋1分钟充分打散样品。若样品是液体状的，吸取0.15～0.2ml样品。处理板结的样品可能需要延长涡旋时间才能充分打散样品。
[0139]
2)70℃水浴10分钟。若需要提取难裂解细菌dna时，把水浴温度提高至90℃。若只需提取人源dna，省略70℃或90℃
[0140]
3)涡旋15秒。室温下，≥14，000x g离心10分钟。
[0141]
4)转移250μl上清液至新的1.5ml离心管中，若需去除rna，加入2μl rnase a至裂解液中，室温静置15分钟。
[0142]
5)加入20μl proteinase k和250μl buffer al上清液中。颠倒混匀10次。70℃水浴10分钟。
[0143]
6)加入250μl无水乙醇至样品中，颠倒混匀10次
[0144]
7)把hipure dna mini column i装在2ml收集管中。转移混合液至柱子中。10，000x g离心30～60秒。
[0145]
8)倒弃流出液，把柱子装回收集管中。加入500μl buffer gw1(已用无水乙醇稀释)至柱子上。10，000x g离心30～60秒。buffer gw1须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。
[0146]
9)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入600μl buffer gw2(已用乙醇稀释)至柱子中。
[0147]
10，000x g离心30～60秒。buffer gw2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。
[0148]
10)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入600μl buffer gw2(已用乙醇稀释)至柱子中。10，000x g离心30～60秒。
[0149]
11)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。13，000
×
g离心2分钟甩干柱子。
[0150]
12)将柱子装在1.5ml离心管中。加入30～100μl预热至70℃的ddh2o至柱子的膜中央，室温放置2分钟。13，000
×
g离心1分钟。
[0151]
13)丢弃dna结合柱，把dna保存于-20℃。
[0152]
2.dna质检
[0153]
取1ul dna产物使用qubit荧光计(美国，thermo公司)进行dna定量检测，质量合格
标准(dna》50ng，同时dna电泳能看到清晰的主条带)。
[0154]
3.16s dna v4区pcr扩增及纯化
[0155]
选取细菌基因组16s区域中v3-v4区作为扩增区域。
[0156]
引物序列为：
[0157]
341f:cctacgggnggcwgcag；
[0158]
785r:gactachvgggtatctaatcc。
[0159]
在通用引物的上游引物序列前随机添加7个核苷酸碱基作为区分不同样品barcode序列。
[0160]
pcr反应条件为：预变性，94℃，3min；变性94℃，10s；退火50℃，20s；延伸72℃，30s；循环数20个；最后延伸72℃，10min。
[0161]
根据不同样本依据微生物含量多少，适当调整pcr循环数(最大不超过35cycles)。扩增产物采用axygen dna胶回收纯化试剂盒(axyprep dnagel extraction kit，axygen，usa)进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化，具体步骤为：
[0162]
1)pcr后取3μl进行琼脂糖凝胶电泳；
[0163]
2)预先将pcr clean beads votex捕获磁珠(中国vazyme公司)混匀后在室温放置30min备用；
[0164]
3)加20ul pcr clean beads充分混匀，室温放置10min；
[0165]
4)然后静置于磁力架上，beads完全分离后去上清；
[0166]
5)加200ul 80％乙醇，30s后去上清，重复洗涤一次；
[0167]
6)将样品置于室温晾干，至无液滴残留；
[0168]
7)加22ul的ddh2o充分悬浮，室温放置5min；
[0169]
8)然后静置于磁力架上，beads完全分离后转移20ul上清至新1.5ml离心管；
[0170]
9)qubit定量，待测序。
[0171]
4.illumina高通量测序及原始数据处理
[0172]
使用miseq高通量测序仪(美国illumnia公司)进行上机测序。
[0173]
数据预处理
[0174]
采用illumina miseq测序仪对文库进行双端序列测定。原始测序数据按如下标准过滤：
①
判定非低质量序列：50个连续碱基平均质量大于25且序列长度大于50。舍弃不符合标准的低质量序列。
②
用软件flash将对应的两端序列进行连接，舍弃无法连接的序列。
③
舍弃碱基长度在200～1000之外的、含有模糊碱基的、含有错配碱基的、最多连续相同碱基数大于6的连接序列。过滤后序列数据根据barcode标签划分到具体个体。
[0175]
16s rdna测序序列分类
[0176]
将所获得优质序列在qiime中根据序列相似度将序列归为多个otu(operational taxonomic unit)，调用uclust(http:∥www.drive5.com/uclust)对序列进行聚类，选取每个类最长的序列为代表序列。
[0177]
采用rdp-classifier数据库(http://rdp.cme.msu.edu)的序列为训练集，对0tu代表序列进行注释，得到每个otu的分类学信息。
[0178]
验证结果：
[0179]
如图4所示，使用上海队列(16s rdna测序队列，n＝65)，计算肠道菌群相对丰度，
筛选出模型中14个特征性微生物群，利用训练集来源的模型分类器对每个患者发生不良反应事件可能性进行预测，随后使用模型截断阈值(如前文所述，rf score＝0.499)进行人群预测分类，使用卡方检验评估模型鉴别效力(p《0.05)，提示发明者所开发的基于14个肠道微生物特征预测接受免疫检查点抑制剂的患者发生免疫不良事件的模型具有一定可行性和可重复性。同时基于训练集的模型评估参数(如敏感性/特异性/准确性/真阳性率(ppv)/真阴性率/(npv)精确召回曲线下面积(prauc)等)。

技术特征：
1.一种免疫相关不良反应事件发生的预测模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)微生物标志物筛选及模型构建：利用已公开发表的“免疫相关不良反应”以及“肠道菌群”数据的相关研究作为训练集，针对训练集数据，对纳入的与“免疫相关不良反应”相关的微生物标记物进行特征筛选，利用机器学习算法，使用迭代特征提取出用于构建模型的微生物特征，获得十四个肠道微生物标志物，所述的十四个肠道微生物标志物如下所示：enterococcus faecalis、massilimicrobiota timonensis、enterocloster aldenensis、ligilactobacillus salivarius、ruminococcus bromii、porphyromonas somerae、agathobacter rectalis、actinomyces oris、subdoligranulum variabile、prevotella buccalis、parabacteroides merdae、beduinibacterium massiliense、parabacteroides goldsteinii、ruminococcus champanellensis；2)在训练集所有研究中进行队列之间的交叉验证以及留一研究法验证来评估模型的稳定性和可重复性；3)利用训练集数据，针对所筛选出的14个肠道微生物标志物，输入微生物特征丰度矩阵，利用python-scikit-learn中随机森林random forest函数，使用predict()函数预测发生概率，并计算不良反应评分rf score，利用约登指数计算不良反应评分的截断值rf score＝0.499，并利用此截断值作为阈值用于后续验证模型的评估；4)一个验证的过程，收集患者粪便，利用定量pcr测序技术或者微生物16s rdna测序技术获取粪便中步骤1)所得肠道菌群标志物的相对丰度特征；通过步骤3)的方法计算不良反应评分rf score，如果患者的不良反应评分小于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应高风险人群，如果患者不良反应评分大于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应低风险人群。2.肠道菌群标志物在制备预测免疫治疗不良反应的试剂盒中应用，其特征在于，肠道菌群标志物为enterococcus faecalis、massilimicrobiota timonensis、enterocloster aldenensis、ligilactobacillus salivarius、ruminococcusbromii、porphyromonas somerae、agathobacter rectalis、actinomyces oris、subdoligranulum variabile、prevotella buccalis、parabacteroides merdae、beduinibacterium massiliense、parabacteroides goldsteinii、ruminococcuschampanellensis。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，收集患者粪便，通过实时定量pcr技术或者粪便微生物16s rdna测序技术获取粪便中上述肠道菌群标志物的相对丰度；将所述的肠道菌群标志物的相对丰度特征输入微生物特征丰度矩阵，利用python-scikit-learn中随机森林random forest函数predict()函数预测发生概率，并计算不良反应发生评分rf score，如果患者的评分小于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应高风险人群，如果患者评分大于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应低风险人群。4.一种预测免疫治疗不良反应的试剂盒，其特征在于，含有检测下述肠道菌群标志物的试剂，所述的肠道菌群标志物为enterococcus faecalis、massilimicrobiotatimonensis、enterocloster aldenensis、ligilactobacillus salivarius、ruminococcus bromii、porphyromonas somerae、agathobacter rectalis、
actinomyces oris、subdoligranulum variabile、prevotella buccalis、parabacteroides merdae、beduinibacterium massiliense、parabacteroidesgoldsteinii、ruminococcus champanellensis。5.根据权利要求4所述的一种预测免疫治疗不良反应的试剂盒，其特征在于，收集患者粪便，通过实时定量pcr技术或者粪便微生物16s rdna测序技术获取粪便中上述肠道菌群标志物的相对丰度；输入微生物特征丰度矩阵，利用python-scikit-learn中随机森林random forest函数，使用predict()函数预测发生概率，并计算不良反应发生评分rf score，得到不良反应评分rf score＝0.499，如果患者的不良反应评分小于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应高风险人群，如果患者不良反应评分大于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应低风险人群。6.根据权利要求4所述的一种预测免疫治疗不良反应的试剂盒，其特征在于，可通过下述含有检测肠道菌群标志物的引物，利用实时定量pcr技术检测微生物丰度，所述的引物如下所示：检测enterococcus faecalis的上游引物序列为：gttggtgaggtaacggctca；检测enterococcus faecalis的下游引物序列为：tgctcggtcagactttcgtc；检测massilimicrobiota timonensis的上游引物序列为：atacatgcaagtcggacgca；检测massilimicrobiota timonensis的下游引物序列为：ggggcaggttgcttatgtct；检测enterocloster aldenensis的上游引物序列为：gacgatcagtagccgacctg；检测enterocloster aldenensis的下游引物序列为：cgggctttcactccagactt；检测ligilactobacillus salivarius的上游引物序列为：agtcacggctaactacgtgc；检测ligilactobacillus salivarius的下游引物序列为：accggctttgggtgttacaa；检测ruminococcus bromii的上游引物序列为：gtgaggtaacggctcaccaa；检测ruminococcus bromii的下游引物序列为：tgtctcagtcccaatgtggc；检测porphyromonas somerae的上游引物序列为：atgatgtaggcggaatgcgt；检测porphyromonas somerae的下游引物序列为：gtaagctgccttcgcaatcg；检测agathobacter rectalis的上游引物序列为：acacgtgctacaatggcgta；检测agathobacter rectalis的下游引物序列为：caccttccgatacggctacc；检测actinomyces oris的上游引物序列为：ggaccggtttttgctggttc；检测actinomyces oris的下游引物序列为：aaaacacccaaaggcgcatc；检测subdoligranulum variabile的上游引物序列为：actcctgtcgttagggacga；检测subdoligranulum variabile的下游引物序列为：tctacgcattccaccgctac；检测prevotella buccalis的上游引物序列为：gcacggtaaacgatggatgc；检测prevotella buccalis的下游引物序列为：tgtaacacgtgtgtagcccc；检测parabacteroides merdae的上游引物序列为：gaggaaggtcccccacattg；检测parabacteroides merdae的下游引物序列为：gtaagctgccttcgcaatcg；检测beduinibacterium massiliense的上游引物序列为：agagatcgggaggaacacca；检测beduinibacterium massiliense的下游引物序列为：gtttgctacccacgctttcg；检测parabacteroides goldsteinii的上游引物序列为：gtgaggtaacggctcaccaa；检测parabacteroides goldsteinii的下游引物序列为：ccttcatccttcacgcgact；检测
ruminococcus champanellensis的上游引物序列为：gacgatcagtagccggactg；检测ruminococcus champanellensis的下游引物序列为：caatattccgcactgctgcc。。

技术总结
一种免疫相关不良反应事件发生的预测模型的构建方法，使用外部数据构建基于肠道菌群丰度预测不良反应发生的模型，并提出免疫相关不良反应发生的评分RF score，使用约登指数计算RF score的截断值，如果患者评分RF score小于0.499，表明患者属于免疫治疗不良反应高风险人群，反之属于免疫治疗不良反应低风险人群。本发明还提供了肠道菌群标志物在制备预测免疫治疗不良反应的试剂盒中应用，肠道菌群为Enterococcus faecalis、Massilimicrobiota timonensis等十四个。本发明能够基于基线肠道微生物丰度对免疫治疗不良反应进行预测并划分高低风险人群。分高低风险人群。分高低风险人群。


技术研发人员：陈豪燕 洪洁 胡慕妮 房静远 黄孝雯 朱小强
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属仁济医院
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/1