一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针及其合成方法和应用

1.本发明属于药物化学技术领域，涉及一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针及其合成方法和应用。


背景技术：

2.硝基还原酶(ntr)是具有还原性的内源性黄素蛋白酶，在辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)作用下，代谢细胞内的硝基化合物，硝基还原酶在大肠杆菌中表达量很高，但也会出现在哺乳类的脑组织、肝组织和肾组织等中，并且与生物体的实体肿瘤密切相关，硝基还原酶在缺氧状态的肿瘤细胞中会过高表达，如乳腺癌、肺癌细胞等。ugurbil等人基于磁共振基本理论使用高场磁共振扫描仪评估了缺氧活细胞内与正常细胞内的nad
+
和nadh的代谢产物的含量，并证明生物体组织的缺氧会导致细胞内的硝基还原酶的表达量升高。除此之外，大量研究证明肿瘤细胞内的硝基还原酶的表达水平会随着胞内氧气浓度的减少而增加。因此通过评估生物体组织或者肿瘤细胞内硝基还原酶的表达水平从而研究缺氧的产生和以及在生物体实体肿瘤中的发展规律，对临床防治组织缺氧引起的相关疾病具有重要指导意义。
3.溶酶体是真核细胞不可或缺的细胞器，具有吞噬消化、防御以及细胞自溶等功能。近年来研究还发现溶酶体在细胞信号传导、细胞迁移、胆固醇稳态、激活细胞凋亡与组织重塑等方面也发挥重要作用。而当溶酶体内环境被破坏时会导致细胞功能紊乱并引发各种疾病，如神经退行性疾病、类风湿性关节炎、帕金森症、阿兹海默症和癌症等。利用溶酶体内水解酶进行酶的激活和蛋白质等大分子的降解，在细胞癌变过程中溶酶体的位置和膜透性发生改变，促使大量组织蛋白酶分泌到细胞质，与血纤维蛋白等酶原激活系统共同参与降解，从而提高癌细胞的运动性和入侵性，促进肿瘤的生长。因此，监测细胞中溶酶体的活动对于研究溶酶体生理功能以及器官的存活和生长至关重要，同时也为临床诊断溶酶体功能障碍的相关疾病提供更为有效的手段。
4.近年来溶酶体成像技术发展迅速，常见的有核磁共振成像、电子计算机断层扫描、正电子发射断层成像和单光子发射计算机断层成像超声成像等。然而，放射性成像手段不仅具有难以避免的放射性风险，而且在特异性、灵敏度、分辨率等方面有一定的不足。以荧光成像为代表的光学成像作为一种非入侵性的技术手段，对人体的危害风险更小、灵敏度更高、响应时间更短，越来越受到科研工作者的密切关注。与这些传统的分析方法相比，荧光检测技术因其易于操作、响应快速和灵敏度高等优点，近年来，研究者们修饰各类小分子染料探究了溶酶体内的ph值、粘度、各种金属离子、阴离子、生物小分子,大分子等多种物质，都有较高的空间分辨率、低生物毒性、高荧光量子收率和良好的光稳定性等优点，但目前为止很少报道溶酶体靶向硝基还原酶响应的荧光探针。
5.中国专利申请文件(公开号：cn109456264a)公开了检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用，但是该探针属于工业分析检测技术领域，只能在酶促反应
中检测分析ntr的活性。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针，实现对细胞内硝基还原酶的检测和溶酶体活动的实时成像。
7.本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针，荧光探针包括如下所示的结构：
[0008][0009]
在上述的一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针中，荧光探针以荧光分子三苯胺衍生物tpa为母体通过化学合成反应连接硝基还原酶识别基团和溶酶体靶向基团。
[0010]
本发明基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针是一种用于溶液和细胞中检测ntr活性的荧光探针，同时还具有靶向细胞中溶酶体的功能，从而可以应用于细胞中溶酶体活动和ntr响应性生物成像。
[0011]
在上述的一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针中，硝基还原酶识别基团为对硝基苄溴，溶酶体靶向基团为n-(2-氯乙基)吗啡盐酸盐。
[0012]
本发明还提供了一种上述基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法，所述方法包括如下步骤：
[0013]
s1、将4-溴苯酰氯和噻吩在氯化铝催化下发生friedels-crafts反应制得中间物1；
[0014]
s2、采用suzuki偶联方法，以金属钯配合物为催化剂在碱性环境中以中间物2和中间物1为反应物，四氢呋喃和水为溶剂，制得中间物3；
[0015]
s3、通过克脑文盖尔缩合(knoevenagel condensation)反应，将中间物3与丙二腈在四氯化钛作用下生成中间物4；
[0016]
s4、将中间物4和三溴化硼置于冰浴中，将甲氧基水解得到含有两个羟基的中间物5；
[0017]
s5、将中间物5和对硝基苄溴在碱性环境中反应得到对硝基苄基单取代的中间物6；
[0018]
s6、将中间物6与n-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，在含有碱和催化剂的溶剂中，通过亲
核取代反应制得响应性荧光探针；
[0019]
其中原料1、中间物2、中间物3、中间物4、中间物5和中间物6的结构式依次为：
[0020][0021]
作为优选，步骤s1中中间物1和中间物2的摩尔比为1：(1.5-2.5)。
[0022]
在上述的一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法中，步骤s2中金属钯配合物为四(三苯基膦)钯。
[0023]
作为优选，步骤s2中四氢呋喃和水的体积比为(2-4)：1。
[0024]
在上述的一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法中，步骤s3中中间物3与丙二腈的摩尔比为1：(8-15)。
[0025]
作为优选，步骤s4中中间物4和三溴化硼的摩尔比为1：(2-5)。
[0026]
在上述的一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法中，步骤s5中应过程加入缚酸剂。
[0027]
作为优选，缚酸剂为无机碱和有机碱中的至少一种，其中无机碱包括碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠中的至少一种，有机碱包括三乙胺、吡啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯中的至少一种。
[0028]
作为优选，步骤s5中中间物5和对硝基苄溴的摩尔比为1：(1-1.5)。
[0029]
在上述的一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法中，步骤s6中间物6与n-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐的摩尔比为1：(1.1-1.5)。
[0030]
在上述的一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法中，步骤s6催化剂为碘化钾或碘化钠。
[0031]
作为优选，步骤s6碱为碳酸铯。
[0032]
作为优选，步骤s6在乙腈为溶剂下加热回流，并通过柱层析分离制得。
[0033]
本发明还提供了一种上述基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针在监测和跟踪活细胞中溶酶体动态运动中的应用。
[0034]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的基于三苯胺衍生物溶酶体靶向硝基还原酶响应的荧光探针，探针刚进入细胞时内不发光，但在癌细胞中培养一
段时间后，经由细胞内硝基还原酶还原吸电子基团硝基，在激光照射下，荧光团内的电荷移动从而致使荧光产生。本发明还提供了合成该溶酶体靶向硝基还原酶响应的荧光探针的方法，以及其在生物成像中的用途。
附图说明
[0035]
图1为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn路径图。
[0036]
图2为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn的核磁氢谱图(500mhz,chloroform-d)；
[0037]
图3为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn的核磁碳谱(126mhz,chloroform-d)；
[0038]
图4为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn的高分辨质谱(esi-hrms)；
[0039]
图5为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn在不同浓度的二甲基亚砜/水溶液中的荧光发射光谱图(a)和不同浓度tpa-mp-pbn的荧光发射光谱图(b)；
[0040]
图6为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn的细胞存活率，(a)结肠癌细胞(ct26)与不同浓度tpa-mp-pbn共孵育后的存活率，(b)肾小管上皮细胞(hk-2)与不同浓度tpa-mp-pbn共孵育后的存活率。
[0041]
图7为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn的硝基还原酶响应性能，(a)tpa-mp-pbn在正常肾小管上皮细胞(hk-2)中的荧光信号图，(b)tpa-mp-pbn在血管内皮细胞(huvec)中的荧光信号图。
[0042]
图8为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn在ct26细胞中的荧光信号图，(a)不同浓度(5,20,50,100μg/ml)tpa-mp-pbn在不同时间(1h,6h,24h)荧光图，(b)荧光半定量分析柱状图。
[0043]
图9为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn在肝癌细胞(hepg2)中的荧光信号图，(a)不同浓度(5,20,50,100μg/ml)tpa-mp-pbn在不同时间(1h,6h,24h)荧光图，(b)荧光半定量分析柱状图。
[0044]
图10为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn在乳腺癌细胞(mcf-7)中的荧光信号图，(a)不同浓度(5,20,50,100μg/ml)tpa-mp-pbn在不同时间(1h,6h,24h)荧光图，(b)荧光半定量分析柱状图。
[0045]
图11为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn在肝癌肿瘤球中的渗透与成像性能。
[0046]
图12为实施例1制备的荧光探针tpa-mp-pbn与溶酶体共定位荧光信号图和分析结果。
具体实施方式
[0047]
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
[0048]
本发明设计了一种基于三苯胺衍生物溶酶体靶向硝基还原酶响应荧光探针tpa-mp-pbn，结构如式(1)所示
[0049][0050]
上述溶酶体靶向硝基还原酶响应探针包含荧光分子tpa、溶酶体靶向基团n-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(mp)和硝基还原酶识别基团对硝基苄溴，三者通过化学反应合成。该探针在正常细胞中几无荧光，但在肿瘤细胞中可产生较强的荧光信号，可利用荧光成像监测细胞中溶酶体的动态活动以及探究硝基还原酶的表达水平。
[0051]
下面通过实施例说明该溶酶体靶向探针的制备过程和技术效果。
[0052]
实施例1：
[0053]
荧光探针tpa-mp-pbn的合成方法如图1所示，具体包括如下步骤：
[0054]
s1、向100ml干燥的圆底烧瓶中加入4-溴苯酰氯(1.6g，7.29mmol)和氯化铝(2.0g，15mmol)，在氩气保护下，用10ml无水二氯甲烷溶解并冷却至0℃，滴加575μl噻吩,室温下搅拌反应3h，待反应结束后，冰水淬灭，加入5.87ml的3m盐酸搅拌20分钟，反应液用二氯甲烷萃取，有机相用水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析分离，得1.4g乳白色固体，即中间物2，收率89.7％，采用核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱进行结构表征。1h nmr(500mhz,chloroform-d):δ(ppm)7.77(dd,j＝6.6hz,j＝1.85hz,3h),7.67(d,j＝8.2hz,2h),7.65(d,j＝8.75hz,1h),7.20(t,j＝9.55hz,1h)；
13
c nmr(125mhz,chloroform-d):δ(ppm)187.1,143.3,136.9,134.8,134.6,131.8,130.7,128.1,127.3；hrms(esi):c
11
h8bros[m+h]
+
m/z 266.9473,found266.9479。
[0055]
s2、将4,4'-二甲氧基-4
”‑
硼酸三苯胺(1.0g，2.86mmol)即原料1和中间物2(1.52g，5.72mmol)、碳酸钾(3.95g，28.6mmol)、四(三苯基膦)钯(0.165g，0.143mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入四氢呋喃/水(3/1，v/v)16ml混合溶剂溶解，在氩气保护下，60℃回流搅拌24h，用乙酸乙酯萃取、有机相用水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析分离得1.2g黄色泡沫状固体，即中间物3，收率88.7％，采用核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱进行结构表征。1h nmr(500mhz,chloroform-d):δ(ppm)7.95(dt,j＝8.45hz,j＝2.10hz,2h),7.74(m,2h),7.69(dt,j＝8.45hz,j＝1.7hz,2h),7.50(dt,j＝8.80hz,j＝2.75hz,2h),7.20(q,j＝13.70hz,1h),7.13(td,j＝8.95hz,j＝3.45hz,4h),7.02(td,j＝8.75hz,j
＝2.55hz,2h),6.89(td,j＝8.95hz,j＝3.45hz,4h),3.84(s,6h)；
13
c nmr(125mhz,chloroform-d):δ(ppm)187.7,156.2,149.1,144.9,143.9,140.5,135.9,134.5,133.9,131.1,130.0,127.9,127.7,127.0,126.2,114.2,55.5；hrms(esi):c
31h26
no3s[m+h]
+
m/z 492.1633,found 492.1620。
[0056]
s3、向干燥的100ml双口烧瓶加入中间物3(1.2g，2.86mmol)，在氩气保护下加入20ml无水二氯甲烷溶解，冰浴下加入丙二腈(16.99g，25.74mmol)，20分钟后加入1.34ml ticl4，30分钟后，再加入2.12ml吡啶，35℃下搅拌反应24h。反应结束后，加20ml冰水淬灭、分液，二氯甲烷萃取有机相、饱和食盐水洗、无水无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析分离得1.17g红棕色固体,即中间物4，收率88.6％，采用核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱进行结构表征。1h nmr(500mhz,chloroform-d):δ(ppm)7.84(t,j＝9.80hz,2h),7.70(d,j＝8.35hz,2h),7.51(dd,j＝21.35hz,j＝8.30hz,4h),7.27(t,j＝4.90hz,1h),7.14(d,j＝8.90hz,4h),7.02(d,j＝8.75hz,2h),6.89(d,j＝8.85hz,4h),3.84(s,6h)；
13
c nmr(125mhz,chloroform-d):δ(ppm)165.0,156.3,144.8,140.4,138.8,136.4,135.8,133.7,130.6,128.9,127.7,127.0,126.3,120.0,114.8,114.2,77.2,55.5；hrms(esi):c
34h25
n3o2s[m]m/z 539.1667,found 539.1655。
[0057]
s4、向干燥双口100ml烧瓶加入中间物4(425mg，0.788mmol)，氩气保护下，10ml无水二氯甲烷溶解，冰浴下缓慢滴加2ml的1m三溴化硼的二氯甲烷溶液，滴加完毕后室温下搅拌反应16小时，待反应结束后，加入20ml水淬灭、分液、有机相用水洗、饱和食盐水洗、无水无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析分离得400mg红棕色固体，即中间物5，收率99.3％，采用核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱进行结构表征。1h nmr(500mhz,chloroform-d):δ(ppm)7.83(m,2h),7.67(d,j＝8.35hz,2h),7.52(d,j＝8.35hz,2h),7.45(d,j＝8.30hz,2h),7.26(m,1h),7.04(d,j＝7.60hz,4h),6.97(d,j＝7.80hz,2h),6.81(m,4h)；
13
c nmr(125mhz,chloroform-d):δ(ppm)156.2,152.3,144.7,140.1,138.7,136.5,136.0,133.7,132.4,128.6,131.0,130.6,128.9,127.7,127.2,126.3,120.4,114.5,119.9,116.3,114.6,114.3,77.3,68.3；hrms(esi):c
32h20
n3o2s[m-h]-m/z 510.1276，found 510.1277。
[0058]
s5、向干燥的两口烧瓶中加入上述中间物5(270mg，0.528mmol)、4-硝基苄溴(150mg，0.687mmol分3批次加入)、碳酸钾(59mg，0.4224mmol)，氩气保护下，加入15ml无水dmf溶解，60℃回流搅拌2h。待反应结束，加40ml水淬灭反应，萃取分液、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析分离得145mg酒红色固体，即中间物6，收率42.5％，采用核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱进行结构表征。1h nmr(500mhz,chloroform-d):δ(ppm)8.28(d,j＝8.60hz,2h),7.84(m,2h),7.67(dd,j＝20.15hz,j＝8.35hz,4h),7.54(d,j＝8.35hz,2h),7.49(d,j＝8.40hz,2h,)7.27(t,j＝4.45hz,1h),7.13(d,j＝8.50hz,2h),7.07(d,j＝8.65hz,2h),7.02(d,j＝8.25hz,2h),6.93(d,j＝8.70hz,2h),6.82(d,j＝7.95hz,2h),5.18(s,2h)；
13
c nmr(125mhz,chloroform-d):δ(ppm)165.0,154.6,152.5,147.6,144.6,141.3,140.3,138.1,136.4,136.0,133.8,130.6,129.0,127.8,127.6,127.4,126.7,126.3,123.9,120.4,116.4,115.8,114.6,114.2,77.1,69.0；hrms(esi):c
39h25
n4o4s-[m-h]-m/z 645.1602,found 645.1604。
[0059]
s6、向干燥的双口50ml烧瓶加入中间物6(46mg，0.071mmol)，在氩气保护下，用10ml无水乙腈溶解，依次加入n-(2-氯乙基)吗啡盐酸盐(15.9mg，0.085mmol)、碳酸铯
(36.5mg，0.112mmol)、ki(11mg，0.066mmol)，80℃回流24h，待反应结束，旋干反应液，加入20ml二氯甲烷和20ml水，萃取分液、有机相用水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析分离得16mg酒红色固体，即tpa-mp-pbn，收率29.6％，采用核磁氢谱、碳谱和高分辨质谱进行结构表征。1h nmr(600mhz,chloroform-d):δ(ppm)8.30(d,j＝10.35hz,2h),7.86(m,2h),7.68(q,j＝10.10hz,4h),7.53(m,4h),7.28(m,1h),7.14(t,j＝9.75hz,4h),7.04(d,j＝10.40hz,2h),6.93(dd,j＝12.85hz,j＝10.60hz,4h),5.20(s,2h),4.17(t,j＝7.20hz,2h),3.80(t,j＝7.20hz,4h),2.90(t,j＝6.55hz,2h),2.69(s,4h)；
13
c nmr(200mhz,chloroform-d):δ(ppm)164.9,155.3,154.6,149.0,144.6,144.5,141.3,140.6,138.7,136.4,135.9,130.9,130.6,128.9,128.8,127.8,127.6,127.0,126.7,126.3,123.9,120.5,115.8,115.5,114.2,77.3,77.1,76.9,69.1,68.2,66.6,65.7,57.6,53.9；hrms(esi):c
45h37
n5o5s[m+h]
+
m/z760.2594,found760.2575。
[0060]
图2为实施例中tpa-mp-pbn的核磁氢谱图(500mhz,chloroform-d)；从图中可知，本发明探针化合物tpa-mp-pbn纯度很高，几乎没有杂质，并在2.5-5.5之间显现7个亚甲基的峰。
[0061]
图3为实施例中tpa-mp-pbn的核磁碳谱(126mhz,chloroform-d)；从图中可知，本发明探针化合物tpa-mp-pbn纯度很高，几乎没有杂质。
[0062]
图4为实施例中tpa-mp-pbn的高分辨质谱(esi-hrms)；从图中可知，本发明探针化合物tpa-mp-pbn在760.2575显示[m+h]
+
正离子峰。
[0063]
将上述制得的tpa-mp-pbn溶于不同比例的二甲基亚砜/水混合溶液，随着混合溶液中水的的比例不断增加，探针化合物tpa-mp-pbn因为聚集诱导发光效应，荧光强度也随之增强(图5a)，且荧光呈浓度依赖性(图5b)。
[0064]
以乳腺癌细胞(mcf-7)和血管内皮细胞(huvec)为模型细胞，通过与tpa-mp-pbn共孵育以考察tpa-mp-pbn的细胞安全性。mcf-7细胞与huvec细胞经不同浓度tpa-mp-pbn(5,20,50,100μg/ml)共孵育后，采用mtt法检测细胞存活率。结果如图6所示，各个浓度的细胞存活率都在90％以上。结果表明，tpa-mp-pbn有较好的细胞安全性。
[0065]
以hk-2细胞和huvec为模型细胞，考察tpa-mp-pbn的硝基还原酶响应性能。加入tpa-mp-pbn和未有硝基还原酶响应特性的tpa-mp-oh共孵育24h后，dapi染色，荧光显微镜观察。如图7所示，tpa-mp-pbn在正常细胞中的荧光信号很弱，而tpa-mp-oh具有明显的荧光信号，说明正常细胞不存在亚硝基还原酶水平较低，tpa-mp-pbn中的对硝基芳苄基无法脱去，导致其荧光信号较弱。
[0066]
以ct26细胞、mcf-7细胞、肝癌细胞(hepg2)为模型细胞，检测tpa-mp-pbn的亚硝基还原酶响应荧光表达。如图8、9、10所示，tpa-mp-pbn在三种肿瘤细胞的荧光信号均以时间和浓度依赖性方式增强；此外，以hepg2细胞培养而成的肿瘤球内可见明显的荧光信号(图11)，进一步证明其具有较好的硝基还原酶响应性能。
[0067]
以mcf-7细胞、hepg2细胞为模型细胞，考察tpa-mp-pbn的溶酶体靶向分布特性。结果如图12所示，tpa-mp-pbn的荧光信号与市售溶酶体探针的荧光信号高度重合，采用imagej软件进行共定位分析，得到两者的共定位相关系数值分别为0.99和0.97，证明tpa-mp-pbn具有较好的溶酶体靶向分布特性。
[0068]
综上所述，本发明提供的基于三苯胺衍生物溶酶体靶向硝基还原酶响应的荧光探
针，探针刚进入细胞时内不发光，但在癌细胞中培养一段时间后，经由细胞内硝基还原酶还原吸电子基团硝基，在激光照射下，荧光团内的电荷移动从而致使荧光产生。本发明还提供了合成该溶酶体靶向硝基还原酶响应的荧光探针的方法，以及其在生物成像中的用途。
[0069]
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
[0070]
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0071]
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

技术特征：
1.一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针，其特征在于，荧光探针包括如下所示的结构：2.根据权利要求1所述的一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针，其特征在于，荧光探针以荧光分子三苯胺衍生物tpa为母体通过化学合成反应连接硝基还原酶识别基团和溶酶体靶向基团。3.根据权利要求2所述的一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针，其特征在于，硝基还原酶识别基团为对硝基苄溴，溶酶体靶向基团为n-(2-氯乙基)吗啡盐酸盐。4.根据权利要求1-3任意一项所述一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：s1、将4-溴苯酰氯和噻吩在氯化铝催化下发生friedels-crafts反应制得中间物1；s2、采用suzuki偶联方法，以金属钯配合物为催化剂在碱性环境中以中间物2和中间物1为反应物，四氢呋喃和水为溶剂，制得中间物3；s3、通过克脑文盖尔缩合反应，将中间物3与丙二腈在四氯化钛作用下生成中间物4；s4、将中间物4和三溴化硼置于冰浴中，将甲氧基水解得到含有两个羟基的中间物5；s5、将中间物5和对硝基苄溴在碱性环境中反应得到对硝基苄基单取代的中间物6；s6、将中间物6与n-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐，在含有碱和催化剂的溶剂中，通过亲核取代反应制得响应性荧光探针；其中原料1、中间物2、中间物3、中间物4、中间物5和中间物6的结构式依次为：
5.根据权利要求4所述一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤s2中金属钯配合物为四(三苯基膦)钯。6.根据权利要求4所述一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤s3中中间物3与丙二腈的摩尔比为1：(8-15)。7.根据权利要求4所述一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤s5中应过程加入缚酸剂。8.根据权利要求4所述一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤s6中间物6与n-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐的摩尔比为1：(1.1-1.5)。9.根据权利要求4所述一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤s6催化剂为碘化钾或碘化钠。10.一种如权利要求1所述基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针在监测和跟踪活细胞中溶酶体动态运动中的应用。

技术总结
本发明属于药物化学技术领域，涉及一种基于三苯胺骨架的溶酶体靶向硝基还原酶响应性荧光探针及其合成方法和应用。本发明提供的基于三苯胺衍生物溶酶体靶向硝基还原酶响应的荧光探针，探针刚进入细胞时内不发光，但在癌细胞中培养一段时间后，经由细胞内硝基还原酶还原吸电子基团硝基，在激光照射下，荧光团内的电荷移动从而致使荧光产生。本发明还提供了合成该溶酶体靶向硝基还原酶响应的荧光探针的方法，以及其在生物成像中的用途。以及其在生物成像中的用途。以及其在生物成像中的用途。


技术研发人员：李瑶瑶 吴海霞 王金辉 李艺萱 白文军 胡静波
受保护的技术使用者：宁波大学附属第一医院
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/8/1