一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针的制备和应用

1.本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针的制备和应用。


背景技术：

2.肼(n2h4)是一种具有强还原性和亲核性的试剂，并广泛用于光敏剂、药物、农药、染料及其他化学品的制造(s.d.zelnick,d.r.mattie,p.c.stepaniak,aviat.space.environ.med.,2003,74,1285-1291；u.ragnarsson,chem.soc.rev.,2001,30,205-213；k.yamada,k.yasuda,n.fujiwara,z.siroma,h.tanaka,y.miyazaki,t.kobayashi,electrochem.commun.,2003,5,892-896)。肼可以广泛运用在不同领域，由于具有良好的水溶性，极容易通过皮肤和口腔被人体所吸收。作为一种神经毒素，若人体过量接触肼，可能导致肝、肺、肾和神经系统严重损伤(s.garrod,m.e.bollard,a.w.nicholls,s.c.connor,j.connelly,j.k.nicholson,e.holmes,chem.res.toxicol.,2005,18,115-122；k.kucukoglu,h.i.gul,p.taslimi,i.gulcin,c.t.supuran,bioorg.chem.,2019,86,316-321)。据报道，n2h4已被美国环境保护署(epa)列为可能致癌物质，并建议将10ppb列为阈值。因此，需要寻求一种既简便又高效的检测手段来检测肼。
3.荧光方法具有灵敏度高、操作简单和响应速度快等优点而显示出很大的应用潜力(y.q.tan,j.c.yu,j.k.gao,y.j.cui,y.yang,g.d.qian,dyes pigment,2013,99,966-971；l.q.yan,s.q.zhang,y.xie,x.y.mu，j.b.zhu,crit.rev.anal.chem.,2022,52,210-229)。到目前为止，已经开发了一些检测肼的荧光探针，用于实时检测环境和细胞的浓度(x.dai,z.y.wang,z.f.du,j.y.miao,b.x.zhao,sens.actuators b chem.,2016,232,369-374；r.chen,g.j.shi,j.j.wang,h.f.qin,q.zhang,s.j.chen,y.g.wen,j.b.guo,k.p.wang,z.q.wang,y.wang,spectrochim.acta a mol.biomol.spectrosc.,2021,252,119510；x.l.xue,q.zhang,k.p.wang,s.j.chen,l.s.tang,z.q.hu,spectrochim.acta a mol.biomol.spectrosc.,2022,279,121406)。但是，这些探针存在一些问题：(1)荧光探针的灵敏度较差；(2)这些荧光探针具有相对较长的响应时间，反应时间在30分钟以上。因此，设计和合成具有灵敏度高和响应速度快的荧光探针是十分迫切的。
4.吡喃-香豆素染料是目前荧光探针领域中应用比较广泛的一类染料，它具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优势。据报道，利用吡喃-香豆素荧光探针已经检测了许多目标物，如：cys,hclo,h2o2和hg
2+
等(j.liu,y.q.sun,p.wang,j.zhang,w.guo,analyst,2013,138,2654-2660；h.lv,x.f.yang,y.zhong,y.guo,z.li,h.li,anal.chem.,2014,86,1800-1807；s.ding,q.zhang,s.xue,g.feng,analyst,2015,140,4687-4693；b.dong,x.song,x.kong,c.wang,y.tang,y.liu,w.lin,adv.mater.,2016,28,8755-8759)。但是，到现在为止，还没有以吡喃-香豆素为染料，乙酰丙酸为识别基团的荧光探针来灵敏且快速检测n2h4。因此，设计和合成一种基于吡喃-香豆素染料的荧光探针来检测n2h4是非常有必要的。


技术实现要素：

5.根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针。
6.本发明的技术方案是，一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针，其结构式如下：
[0007][0008]
一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针的制备方法。步骤如下：
[0009]
在100ml的圆底烧瓶中，将1当量的化合物cp-oh，3～5当量的乙酰丙酸、1.5当量的4-二甲氨基吡啶和1.5当量1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶解到15～25ml二氯甲烷中，反应混合物室温下搅拌8～12h，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为100/1～100/3的ch2cl2/ch3oh作洗脱剂进行柱层析，得到紫色固体产物，即为所述的荧光探针cpn。
[0010]
本发明的有益效果是，一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究该探针的荧光光谱性质。探针本身在676nm处没有明显的荧光发射；加入n2h4后，在676nm处出现了明显的发射。并且，随着n2h4浓度的增大，探针近红外荧光不断增强。当加入20μm的n2h4时，荧光强度增强4倍。该探针的检测范围从2μm到20μm，检测限为0.67μm，这说明该探针可以高灵敏的检测n2h4。接着，研究探针的紫外吸收光谱。探针本身在620nm附近无吸收带，加入n2h4后，620nm附近出现新吸收峰。然后，研究探针的选择性。考察了探针与无机离子(na
+
、mg
2+
、k
+
、cu
2+
、zn
2+
、nh
4+
、cl-、br-、i-、hco
3-、no
3-、so
42-)，活性氧(h2o2、clo-)，活性硫(hs-、hso
3-)，生物硫醇(cys、gsh)，氨基酸(leu、thr、trp、lys、phe、met、val、ile)，有机胺(二甲胺、对硝基苯胺)以及检测物肼(n2h4)的荧光响应情况。结果发现，只有n2h4引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。最后，研究了ph值对荧光探针测定n2h4的影响，当ph值在7.0到8.0之间时，不影响荧光探针对n2h4的测定。此外，该荧光探针响应比较迅速，响应时间在15分钟以内。
[0011]
一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针的应用。n2h4一般存在于水中，湖水和自来水被用来评估荧光探针在实际样品中的应用。为了确保实验的准确性，将取得的湖水和自来水样本先静置2小时，然后将两者ph调至7.4备用。接着，配制成含有不同浓度的n2h4样品，进行荧光测试，在湖水中获得了98.81％～106.35％的回收率，在自来水中获得了95.00％～106.75％的回收率。这些结果说明，探针能够检测实际样品中的n2h4，为监测水中的n2h4提供了一种可靠的手段。
附图说明
[0012]
图1为荧光探针的合成路线。
[0013]
图2为荧光探针与不同浓度的n2h4作用后的荧光光谱图。
[0014]
横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度为10.0μm，n2h4的浓度分别为：0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0μm。发射波长范围为640-740nm，对应的激发波长为620nm。
[0015]
图3为荧光探针对不同n2h4浓度的荧光线性响应图。
[0016]
图4为荧光探针及荧光探针与n2h4作用后的紫外可见吸收光谱图。
[0017]
横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度为10.0μm，n2h4浓度为20.0μm。
[0018]
图5为荧光探针的选择性图。
[0019]
荧光探针的浓度为10.0μm，n2h4浓度为20.0μm，其它分析物浓度均为20.0μm。
[0020]
图6为ph对荧光探针的影响图。
[0021]
图7为荧光探针与n2h4作用后荧光强度随时间变化的曲线图，n2h4浓度为10.0,15.0,20.0μm。
具体实施方式
[0022]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
[0023]
实施例1：
[0024]
荧光探针的合成
[0025]
合成路线如图1。在100ml的圆底烧瓶中，将1当量的化合物cp-oh，3当量的乙酰丙酸、1.5当量的4-二甲氨基吡啶和1.5当量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶解到25ml二氯甲烷中，反应混合物室温下搅拌2h，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为100/1～100/3的ch2cl2/ch3oh作洗脱剂进行柱层析，得到紫色固体产物(产率为40％)，即为所述的荧光探针。1h nmr(400mhz,cdcl3,δ,ppm)δ7.96(d,j＝7.5hz,1h),7.63(d,j＝7.5hz,1h),7.24(s,2h),7.11(t,j＝3.9hz,2h),6.76(s,2h),6.50(s,1h),6.31(s,2h),5.4(s,1h),3.34(q,j＝12.0hz,4h),2.88
–
2.83(t,j＝8.0hz,4h),2.23(s,3h),1.18(t,j＝8.0hz,6h).
13
c nmr(101mhz,cdcl3,δ,ppm)δ206.80,171.28,170.20,158.05,154.32,154.17,153.87,153.01,149.83,146.26,139.82,135.00,131.39,130.15,129.91,128.97,126.98,125.50,124.41,119.27,118.65,117.01,110.18,109.71,105.18,104.11,97.74,44.90,38.30,30.14,28.08,13.00.ms(tof):579.19
[0026]
实施例2：
[0027]
荧光探针和n2h4溶液配制
[0028]
称取一定量荧光探针cpn固体溶解在dmso中来制备1.0
×
10-3
mol
·
l-1
的cpn备用溶液。n2h4溶液的配制：将一定量的n2h4溶解在二次蒸馏水中，转移到10ml的容量瓶中，加水至刻度线，得到浓度为1.0
×
10-2
mol
·
l-1
的n2h4。将50μl cpn备用溶液，1.2ml dmso和不同体积的n2h4备用溶液加入5ml的容量瓶，最终通过hepes缓冲溶液来定容，得到浓度为1.0
×
10-5
mol
·
l-1
的荧光探针和2.0
×
10-6
～2.0
×
10-5
mol
·
l-1
的n2h4混合待测溶液。
[0029]
实施例3：
[0030]
荧光探针与n2h4作用的荧光光谱的测定
[0031]
图2为荧光探针与n2h4作用的荧光光谱，荧光探针的浓度为10μm，n2h4的浓度依次为0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0μm。实验所用激发波长为620nm，发射波长范围为640～740nm。狭缝宽度为10.0nm/10.0nm，所用的荧光测定仪器为日立
f4600荧光分光光度计。从图2可以看出，加入n2h4之前，由于乙酰丙酯基团的淬灭作用，探针本身几乎没有发射峰；随着n2h4的加入，在676nm处发射峰增强。并且，随着n2h4浓度的增大，探针的荧光强度不断增强。图3为探针对不同n2h4浓度的线性响应图。荧光强度跟n2h4的浓度呈现线性关系，该探针的检测范围从2.0μm到20.0μm，检测限为0.67μm。这说明该探针可以高灵敏的检测n2h4。
[0032]
实施例4：
[0033]
荧光探针与n2h4作用的紫外可见吸收光谱的测定
[0034]
图4为荧光探针与n2h4作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10.0μm，n2h4的加入量为20.0μm。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，探针本身在620nm处无吸收带；加入n2h4之后，620nm处的出现新的吸收峰。
[0035]
实施例5：
[0036]
荧光探针对n2h4测定的选择性
[0037]
图5为荧光探针对n2h4测定的选择性图。考察在浓度为10.0μm的荧光探针中加入n2h4(20.0μm)以及无机离子(na
+
、mg
2+
、k
+
、cu
2+
、zn
2+
、nh
4+
、cl-、br-、i-、hco
3-、no
3-、so
42-)，活性氧(clo-、h2o2)，氨基酸(leu、thr、trp、lys、phe、met、val、lle))，活性硫(hs-、hso
3-)，生物硫醇(cys、gsh)，有机胺(p-nitroaniline、dimethylamine)的荧光响应情况。从图5可以看出，只有n2h4能引起荧光光谱的明显增强，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对n2h4有良好的选择性。
[0038]
实施例6：
[0039]
溶液ph值对荧光探针测定n2h4的荧光性质的影响
[0040]
考察ph值对荧光探针测定n2h4的荧光光谱的影响，其结果如图6。我们研究的ph范围为6.0-9.5，荧光探针的浓度为10.0μm，n2h4的浓度为20.0μm。从图中可以看出，荧光探针随着ph的变化，荧光强度基本不变，说明ph对探针本身没有影响。然而，加入n2h4之后，在ph在7.0～8.0范围内，荧光强度比值显著增强。综上所述，当ph值在7.0到8.0之间时，不影响荧光探针对n2h4的测定，是比较合适的ph值范围，这非常有利于该探针用于实际样品中n2h4的测定。
[0041]
实施例7：
[0042]
荧光探针与n2h4作用的响应时间的测定
[0043]
我们研究了荧光探针对n2h4的响应时间，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对n2h4的响应时间为15min，这能够满足在实际样品中进行监测的要求。从图7还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。
[0044]
实施例8：
[0045]
荧光探针应用于湖水样品的检测
[0046]
湖水样本取自湘潭大学画眉潭，样品静置2小时，将静置后的湖水ph调至7.4。由于湖水样本不含有n2h4，因此需要外加n2h4配制成待测混合溶液，然后进行荧光检测，结果列于表1。从表中可以看出，探针对湖水中n2h4的回收率为98.81％～106.35％。
[0047]
表1湖水中n2h4加标回收率的测定
[0048][0049]
实施例9：
[0050]
荧光探针应用于自来水样品的检测
[0051]
湖水样本取自湘潭大学化学化工大楼自来水水龙头，将自来水的ph调至7.4。由于自来水样本不含有n2h4，因此需要外加n2h4配制成待测混合溶液，然后进行荧光检测，结果列于表2。从表中可以看出，探针对自来水中n2h4的回收率为95.00％～106.75％。
[0052]
表2自来水中n2h4加标回收率的测定
[0053]

技术特征：
1.一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针，即cpn，其特征在于，结构如下：2.根据权利要求1所述的一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：在100ml的圆底烧瓶中，将1当量的化合物cp-oh，3～5当量的乙酰丙酸、1.5当量的4-二甲氨基吡啶和1.5当量1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶解到15～25ml二氯甲烷中，反应混合物室温下搅拌1～2h，停止反应，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为100/1～100/3的ch2cl2/ch3oh作洗脱剂进行柱层析，得到紫色固体产物，即为所述的荧光探针cpn。3.根据权利要求1所述的一种基于吡喃-香豆素染料的肼荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针可应用于实际水样中肼含量的检测。

技术总结
本发明涉及了一种基于吡喃-香豆素的肼(N2H4)荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构式为：本发明提供了以3-乙酰基-7-羟基香豆素、4-二乙氨基-2-羟基-苯甲酰苯甲酸、乙酰丙酸等为原料合成该荧光探针的制备方法；首先，该荧光探针对N2H4表现出较高的灵敏度，探针与N2H4反应之后荧光显著增强；其次，该荧光探针对N2H4表现出很高的选择性，不受其他活性氧，活性硫，生物硫醇，氨基酸，有机胺的干扰；并且，该荧光探针与N2H4作用迅速，响应时间在15分钟以内；此外，该荧光探针可应用于实际水样中N2H4的检测。的检测。的检测。


技术研发人员：李春艳 张会
受保护的技术使用者：湘潭大学
技术研发日：2023.03.24
技术公布日：2023/8/1