一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合、试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.秋刀鱼(cololabis saira)属于脊索动物门(chordata)、颌针鱼目(beloniformes)、竹刀鱼科(scomberesocidae)秋刀鱼属(cololabis)，是秋刀鱼属的唯一一种，也是重要的食用鱼类之一。秋刀鱼体内含有丰富的蛋白质、脂肪以及微量元素等，还含有人体所需的多种氨基酸、维生素以及锰、铁、锌等丰富的微量元素，是一种优质的动物性蛋白鱼类。除了含有人体所需的高消化吸收率的蛋白质之外，它所含有的dha成分具有抑制乳腺癌、大肠癌、肺癌等功效，还具有提高人体学习机能及防止老年性痴呆症的效果，具有“脑黄金”的美誉。且秋刀鱼肉质细致，味道鲜美，深受人们的喜爱。
3.秋刀鱼目前主要以鲜销为主，其加工制品主要集中在加工成咸干品、休闲食品、调味品、鱼糜制品等。但是，秋刀鱼体内存在产组胺的微生物，在适宜条件下极易产生组胺，属于高组胺鱼类。食用高组胺鱼肉后，敏感人群会表现出皮疹、荨麻疹、呕吐、头痛等不适症状，也即出现组胺中毒问题。因此，建立一种准确定量检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分的方法，对于防止敏感人群食入秋刀鱼肉制品后过敏现象的发生具有重要意义。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明提供一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用，利用该检测秋刀鱼的引物和探针可快速准确地检测出鱼肉制品中是否含有秋刀鱼源性成分，且特异性好，灵敏度高，具有较高的实用价值。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.第一方面，本发明提供一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的序列如下：
7.上游引物-f:5
′‑
tattgcaacagccttctcatcag-3
′
(seq id no:1)，
8.下游引物-r:5
′‑
ttgcatgcatatttcggataagtc-3
′
(seq id no:2)；
9.所述探针p的序列为:5
′‑
cgcccatatctgccgagacgtga-3
′
(seq id no:3)。
10.本发明以秋刀鱼线粒体细胞色素b(cytb)基因序列为基础设计引物对和探针，提供的引物和探针组合可以特异性地扩增出秋刀鱼源性成分的dna，准确检测出秋刀鱼源性成分；且与鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼和低眼巨鲶等均无交叉扩增反应，特异性强；且上述引物和探针的灵敏度高，对秋刀鱼源性成分dna的最低检测限为10pg/μl，能够实现秋刀鱼源性成分的快速检测，同时，检测的准确度高，用时短，填补了秋刀鱼检测的空白，对于保障大众的饮食健康具有重要的意义，在鱼肉制品的快速检测领域具有良好的应用前景。
11.优选的，所述探针的5
′
端标记有荧光素，3
′
端标记有荧光猝灭基团。
12.进一步地，所述荧光素为fam，所述荧光猝灭基团为eclipse。
13.进一步地，所述探针p为：5
′‑
fam-cgcccatatctgccgagacgtga-eclipse-3
′
。
14.第二方面，本发明还提供了上述任一项所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合在非诊断性检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分中的应用。
15.第三方面，本发明还提供了一种用于检测秋刀鱼源性成分的试剂盒，包含上述任一项所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合。
16.优选的，所述试剂盒还包括perfectstart ii probe qpcr supermix和ddh2o。
17.第四方面，本发明还提供利用上述试剂盒检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分的方法，具体操作为：提取待测物的基因组dna为模板，用所述试剂盒进行real-time pcr扩增，扩增完成后收集荧光信号。
18.上述检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分的方法，耗时短、操作简单、反应结果直观，能够快速准确的从众多鱼肉中检测出秋刀鱼，对秋刀鱼的准确快速鉴别和食品安全保障具有重要的意义。
19.优选的，所述real-time pcr扩增的反应体系包括以下试剂及用量：2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix 12.5μl，上游引物和下游引物各1μl，探针1μl，dna模板1μl，ddh2o补足至25μl；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l，所述探针的浓度为10μmol/l，所述dna模板的浓度为100ng/μl。
20.优选的，所述real-time pcr扩增的条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环。
21.上述优选的反应条件可进一步提高秋刀鱼源性成分的检测效率。
22.本发明提供的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速鉴别出鱼肉制品中是否含有秋刀鱼源性成分，对于防止敏感人群食入含秋刀鱼鱼肉制品后过敏现象的发生具有重要意义，并且能够从含有多种鱼源性成分的鱼肉制品中特异性扩增出秋刀鱼源性成分的dna，为鉴定秋刀鱼制品真伪提供了有效手段，填补了秋刀鱼检测的空白，在鱼肉制品检测领域具有较高的实用价值。
附图说明
23.图1是本发明实施例2中以cytb基因设计的引物(f1/r1)和探针(p1)的特异性检测结果，其中，1：秋刀鱼；2：金枪鱼；3：巴沙鱼；4：鲤鱼；5：三文鱼；6：低眼巨鲶；7：虹鳟；8：大马哈鱼；9：鲶鱼；10：鳕鱼；11：罗非鱼；12：鲅鱼；
24.图2是本发明实施例2中以atp-6基因设计的引物(f2/r2)和探针(p2)的特异性检测结果，其中，1：秋刀鱼；2：金枪鱼；3：巴沙鱼；4：鲤鱼；5：三文鱼；6：低眼巨鲶；7：虹鳟；8：大马哈鱼；9：鲶鱼；10：鳕鱼；11：罗非鱼；12：鲅鱼；
25.图3是本发明实施例3中real-time pcr方法的灵敏度试验结果图；其中，1的模板浓度为1.0
×
105pg/μl，2的模板浓度为1.0
×
104pg/μl，3的模板浓度为1.0
×
103pg/μl，4的模板浓度为1.0
×
102pg/μl，5的模板浓度为1.0
×
101pg/μl，6的模板浓度为1.0pg/μl，7的模板浓度为1.0
×
10-1
pg/μl，8的模板浓度为1.0
×
10-2
pg/μl；
26.图4为本发明实施例4中的检出限分析图，其中，1-7依次代表秋刀鱼肉样质量占比
分别为50％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％，0.01％；8代表ddh2o。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。
29.实施例1
30.1.材料与方法
31.1.1材料
32.秋刀鱼、鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼、低眼巨鲶、虹鳟、大马哈鱼、鲶鱼，均由本实验室保存。
33.dna提取试剂盒wizard genomic dna purification kit和2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix，购于北京全式金生物技术有限公司；引物和探针由北京擎科生物有限公司合成。
34.混合型球磨仪mm400，购于德国莱驰公司；nanodrop 2000c超微量分光光度计，购于美国thermo scientific公司；quantstudio5实时荧光pcr仪，购于美国abi公司。
35.1.2方法
36.1.2.1引物和探针的设计
37.秋刀鱼与其他同科物种的基因序列同源性较高，根据线粒体设计引物探针较为困难，设计得到的多组引物和探针的扩增结果都不理想，同科物种间的扩增特异性较差，无法准确的检测出秋刀鱼。
38.在秋刀鱼线粒体细胞色素b(cytb)基因序列和线粒体atp-6基因序列的基础上，选择其中的特区域设计引物和探针，如表1所示。
39.表1引物和探针
[0040][0041]
其中，80bp的cytb基因扩增片段的碱基序列如下：
[0042]
tattgcaacagccttctcatcagtcgcccatatctgccgagacgtga attacggatgacttatccgaaatatgcatgcaa(seq id no:4)。
[0043]
72bp的atp-6基因扩增片段的碱基序列如下：
[0044]
cccttagcctcccatgaattctttacccccaaccctctgcccgatga ttaaataaccgcccactaactcttc(seq id no:5)。
[0045]
1.2.2.样品处理和基因组dna的提取
[0046]
取鱼肉放于料理机中制成肉泥，于65℃烘箱中放置16h烘干，然后放于球磨仪中研磨成粉末，过60目筛，于4℃密封保存，不同样品的制备过程中应该避免交叉污染。
[0047]
称取秋刀鱼、鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼、低眼巨鲶、虹鳟、大马哈鱼、鲶鱼肉粉样本，每份样本总量为50mg，参照美国promega公司wizard genomic dna purification kit试剂盒操作说明，进行肉粉样品基因组dna的提取，使用nanodrop 2000c超微量分光光度计测定dna浓度，-20℃保存备用。
[0048]
1.2.3实时荧光pcr方法的建立
[0049]
上述试剂盒包括上游引物、下游引物、探针、perfectstart ii probe qpcrsupermix和ddh2o。
[0050]
以提取的秋刀鱼基因组dna为模板，配制25μl反应体系：2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix 12.5μl，上游引物(10μmol/l)1μl，下游引物(10μmol/l)1μl，探针(10μmol/l)1μl，模板dna(100ng/μl)1μl，ddh2o补足至25μl。
[0051]
采用real-time pcr对上述反应体系进行扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。
[0052]
实施例2
[0053]
引物特异性检测：
[0054]
以提取的秋刀鱼、鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼、低眼巨鲶、虹鳟、大马哈鱼、鲶鱼基因组dna为模板，ddh2o为空白对照，分别以实施例1中设计的两组引物和探针组合，按照实施例1中1.2.3部分的条件进行real-time pcr检测，根据典型扩增曲线和反应体系循环阀(ct)值的不同确定最佳的引物探针组合。结果如图1-图2所示。
[0055]
结果显示，空白对照未出现扩增，说明反应体系未受到污染。图1中可以看出，以cytb基因设计的引物(f1/r1)和探针(p1)特异性好，只有秋刀鱼基因组dna出现典型的“s”型扩增曲线，而鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼、低眼巨鲶等其它物种均无扩增曲线，表明所建立的real-time pcr方法具有良好的特异性。而图2中，以atp-6基因设计的引物(f2/r2)和探针(p2)中，金枪鱼和巴沙鱼均有扩增，说明该引物和探针针对秋刀鱼不具有特异性。综上所述，本发明选择以cytb基因设计的引物(f1/r1)和探针(p1)。
[0056]
实施例3
[0057]
灵敏度试验：
[0058]
将提取的秋刀鱼基因组dna浓度稀释至1.0
×
105pg/μl，进行10倍倍比稀释至1.0
×
10-2
pg/μl，以1μl不同浓度的基因组dna作为模板，采用实施例1中1.2.3部分的试剂盒进行real-time pcr荧光检测，每次试验设3个平行，检测结果如图3所示。
[0059]
结果显示，当反应体系中模板量为10pg时，出现典型扩增曲线，ct值为33.81；当反应体系中模板量低于10pg时，均没有出现扩增曲线，表明本发明所建立的秋刀鱼源性成分
real-time pcr方法的灵敏度为10pg/μl。
[0060]
根据不同浓度扩增的ct值与基因组dna浓度(pg/μl)的对数值建立秋刀鱼实时荧光pcr方法的标准曲线，以秋刀鱼基因组dna浓度(pg/μl)的对数值为横坐标，以ct值为纵坐标，建立二者的线性关系，得到的线性回归方程为：y＝-3.73x+39.96，r2＝0.998，扩增效率为1.08。由此可知，本技术提供的引物和探针组合、试剂盒对检测鱼肉制品中的秋刀鱼源性成分检测具有较高的灵敏度。
[0061]
实施例4
[0062]
检出限分析：
[0063]
将秋刀鱼肉样与鳕鱼肉按照一定质量比混合，制成秋刀鱼肉样含量分别为50％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％，0.01％的混合样品，按照实施例1的方法提取样品dna，以1μl为模板，依照上述实施例1中1.2.3部分的real-time pcr反应体系和扩增条件进行秋刀鱼源性成分检测，每次试验设3个平行，对该方法的检出限进行分析。如图4所示。
[0064]
结果显示，当秋刀鱼混合占比为0.1％时，可检测到秋刀鱼源性成分(ct值为32.65)；当秋刀鱼混合比例为0.01％时，未检测到秋刀鱼源性成分。表明建立的real-time pcr方法的检出限为0.1％。
[0065]
实施例5
[0066]
市售鱼肉制品的检测：
[0067]
从不同超市和集贸市场购买不同品牌的烤鱼片、鱼肉肠、鱼罐头等鱼肉制品，共计36份，根据实施例1中1.2.2中公开的样品处理和基因组dna的提取方法进行提取，然后采用实施例1中1.2.3中所述的试剂盒进行real-time pcr荧光检测，real-time pcr的反应体系为：2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix 12.5μl，上游引物(10μmol/l)1μl，下游引物(10μmol/l)1μl，探针(10μmol/l)1μl，模板dna(100ng/μl)1μl，ddh2o补足至25μl。采用real-time pcr对上述反应体系进行扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。每次试验设2个平行。
[0068]
表2鱼肉制品中秋刀鱼源性成分检测结果
[0069][0070][0071]
结果显示：其中6份样品出现典型的“s”型扩增曲线，表明其含有秋刀鱼源性成分，样品的ct值在14.21-24.62之间，如表2所示。其余样品未检出秋刀鱼源性成分。
[0072]
综上所述，本发明通过设计的引物和探针组合，建立了一种针对秋刀鱼源性成分
的实时荧光pcr检测方法，该方法的特异性强、灵敏度高、最低检测限可达10pg/μl，准确度好，对秋刀鱼的准确快速鉴别和食品安全保障具有重要的意义。
[0073]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，其特征在于，包括引物对和探针，所述引物对的序列如下：上游引物-f：5
′‑
tattgcaacagccttctcatcag-3
′
,下游引物-r：5
′‑
ttgcatgcatatttcggataagtc-3
′
；所述探针p的序列为：5
′‑
cgcccatatctgccgagacgtga-3
′
。2.如权利要求1所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5
′
端标记有荧光素，3
′
端标记有荧光猝灭基团。3.如权利要求2所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，其特征在于，所述荧光素为fam，所述荧光猝灭基团为eclipse。4.如权利要求3所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合，其特征在于，所述探针p为：5
′‑
fam-cgcccatatctgccgagacgtga-eclipse-3
′
。5.权利要求1-4任一项所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合在非诊断性检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分中的应用。6.一种用于检测秋刀鱼源性成分的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合。7.如权利要求6所述的用于检测秋刀鱼源性成分的试剂盒，其特征在于，还包括perfectstart ii probe qpcr supermix和ddh2o。8.利用权利要求7所述的试剂盒检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分的方法，其特征在于，具体操作为：提取待测物的基因组dna为模板，用所述试剂盒进行real-time pcr扩增，扩增完成后收集荧光信号。9.如权利要求8所述的检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分的方法，其特征在于：所述real-time pcr扩增的反应体系包括以下试剂及用量：2
×
perfectstart ii probe qpcr supermix 12.5μl，上游引物和下游引物各1μl，探针1μl，dna模板1μl，ddh2o补足至25μl；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/l，所述探针的浓度为10μmol/l，所述dna模板的浓度为100ng/μl。10.如权利要求8所述的检测鱼肉制品中秋刀鱼源性成分的方法，其特征在于：所述real-time pcr扩增的条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环。

技术总结
本发明涉及基因检测技术领域，具体公开一种用于秋刀鱼源性成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用。所述检测秋刀鱼源性成分的引物和探针中，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明通过设计的引物和探针组合，建立了一种针对秋刀鱼源性成分的实时荧光PCR检测方法，该方法的特异性强，与鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼和低眼巨鲶等均无交叉扩增反应，灵敏度高、最低检测限可达10pg/μL，准确度好，对秋刀鱼的准确快速鉴别和食品安全保障具有重要的意义。义。义。


技术研发人员：刘立兵 王建昌 项佳林 付琦 王金凤 孙晓霞 艾连峰
受保护的技术使用者：石家庄海关技术中心
技术研发日：2023.02.22
技术公布日：2023/8/1