高产ApxI毒素的APP菌株、其构建方法及应用

高产apxi毒素的app菌株、其构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，具体涉及高产apxi毒素的app菌株、其构建方法及应用。


背景技术：

2.胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae，app)是引起猪传染性胸膜肺炎的主要病原，它是一种革兰氏阴性短杆菌，具有荚膜和菌毛，无运动性，不能形成芽孢。app通过呼吸道进入猪体内，然后直接通过气管和支气管进入肺泡，引发出血性和坏死性肺炎、纤维素性胸膜炎。根据app表面可溶性抗原(主要为荚膜多糖和脂多糖)的差异性，将app分为15个血清型，不同血清型菌株的毒力存在显著的差异。
3.鉴于猪传染性胸膜肺炎在世界各地广泛流行和传播并造成较大的经济损失，采取积极防治措施控制该病极为必要。虽然抗生素药物防治对控制该病具有重要作用，但app对许多抗生素易产生耐药性，因此疫苗免疫仍是防治该病的有效手段。研制安全有效的app疫苗成为研究领域关注的焦点。近年来，针对猪传染性胸膜肺炎研发的疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗。app全菌灭活疫苗是应用最广泛、最成熟的一种防治猪传染性胸膜肺炎的疫苗，但是灭活疫苗的效果并不十分理想，不能刺激机体产生高滴度的抗体。当免疫过的猪只受到感染后，也会出现临床症状和肺部损伤。并且app各血清型的灭活疫苗之间不能提供有效的交叉保护。商品化的胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗主要以从培养上清中提取的apx毒素为主要成分，使用后能对多种血清型产生比较显著的免疫效果。由于常规亚单位疫苗制备需要从胸膜肺炎放线杆菌培养上清中提取抗原，但抗原分泌表达量少，生产成本较高，进而影响了其价格和应用性。而以基因工程方法原核表达纯化的抗原，由于抗原自身分子量较大，不能可溶性表达，制备的抗原并非天然构象，进而影响免疫效果。


技术实现要素：

4.为满足上述领域的需求，本发明提供一株胸膜肺炎放线杆菌，其保藏编号为cgmcc no.25495，名称为4074-oxyr。
5.所述胸膜肺炎放线杆菌(4074-oxyr)是以野生型app血清1型参考菌株(4074)为出发菌株，经oxyr基因突变并导入apxia基因表达载体而获得的高产apxi毒素的菌株，其apxi毒素产量为2.367
±
0.25mg/l，是野生型菌株apxi毒素产量的3倍多。
6.本发明还提供一种菌剂，其包含上述胸膜肺炎放线杆菌(4074-oxyr)。
7.所述菌剂可为固体菌剂或液体菌剂。
8.所述胸膜肺炎放线杆菌(4074-oxyr)在制备apxi毒素中的应用也属于本发明的保护范围。
9.所述胸膜肺炎放线杆菌(4074-oxyr)在制备胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
10.本发明还提供一种构建高产apxi毒素的胸膜肺炎放线杆菌的方法，其特征在于，
包括如下步骤：
11.a)使胸膜肺炎放线杆菌中的oxyr基因失活，获得oxyr基因突变菌株；
12.b)构建所述胸膜肺炎放线杆菌的apxia基因的表达载体并将所述表达载体导入所述oxyr基因突变菌株中，获得高产apxi毒素的基因工程菌株。
13.在所述方法的一些实施例中，所述步骤a)包括：
14.a1)将核苷酸序列如seq id no：2所示的目的片段1导入接合转移质粒pemoc2中，得到第一重组质粒；
15.a2)将核苷酸序列如seq id no：4所示的目的片段2导入所述第一重组质粒中，得到第二重组质粒；
16.a3)将所述第二重组质粒导入大肠杆菌β2155中，得到供体菌；
17.a4)通过接合转移将所述第二重组质粒从所述供体菌导入所述胸膜肺炎放线杆菌中。
18.在所述方法的一些实施例中，所述第二重组质粒的核苷酸序列如seq id no：5所示。
19.在所述方法的一些实施例中，所述apxia基因的核苷酸序列如seq id no：10所示。
20.在所述方法的一些实施例中，所述胸膜肺炎放线杆菌为胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株。
21.本发明为高产apxi毒素菌株的构建提供了一种新的思路和方法，为胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗的生产提供了新的菌株资源。
22.本发明提供的高产apxi毒素的胸膜肺炎放线杆菌的专利保藏信息如下：
23.生物材料(株)：4074-oxyr
24.分类命名：actinobacillus pleuropneumoniae
25.保藏日期：2022年08月05日
26.保藏编号：cgmcc no.25495
27.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)
28.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
29.图1为4074-oxyr菌株的pcr验证结果。其中，m为dna分子量标准，从上到下依次为2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；4074-oxyr表示4074-oxyr菌株的pcr产物，条带大小为944bp；app1表示野生型app血清1型参考菌株(4074)的pcr产物，条带大小为196bp；所使用的pcr引物为oxyr-yf-944/oxyr-yr-196；结果显示，野生型菌株不含oxyr序列插入失活区域，而4074-oxyr菌株包含oxyr序列插入失活区域。
30.图2为westernblotting鉴定4074-oxyr菌株中oxyr蛋白表达情况的结果。其中，m为蛋白质分子量标准，图中显示的条带从上到下依次为180kda、130kda、100kda、70kda、55kda、40kda、35kda、25kda、15kda；app1表示野生型app血清1型参考菌株(4074)的全菌蛋白；4074-oxyr表示4074-oxyr菌株的全菌蛋白；结果显示，野生型菌株表达oxyr蛋白，而4074-oxyr菌株不表达oxyr蛋白。
31.图3为western blotting鉴定4074-oxyr菌株中apx毒素表达情况的结果；其中a图
显示apxi毒素蛋白的表达情况，b图显示apxii毒素蛋白的表达情况；其中m为蛋白质分子量标准，图中显示的条带从上到下依次为130kda、100kda、70kda；app1表示野生型app血清1型参考菌株(4074)；4074-oxyr表示4074-oxyr菌株；结果显示，与野生型菌株相比，4074-oxyr菌株的apxi毒素分泌量显著增加，而apxii毒素分泌量无变化。
具体实施方式
32.下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
33.以下实施例中使用的菌株：
34.野生型app血清1型参考菌株(4074)(本文中简称为野生型菌株)，由澳大利亚pat blackall博士惠赠，属于已知菌株，已在nielsen.r.new diagnostic techniques：a review of the hap group of bacteria.can.j.vet.res.，1990，54：68-71.和blackall pj，klaasen hl，bosch h，et al.proposal of a new serovar of actinobacillus pleuropneumoniae：serovar 15.vet microbiol，2002，84：47～52.文献中公开。公众可从北京市农林科学院获得该菌株。
35.大肠杆菌β2155：dap营养缺陷型菌株，由华中农业大学陈焕春教授惠赠。该菌株可商购获得。
36.大肠杆菌dh5a：克隆菌株，购自宝生物工程(大连)有限公司。
37.大肠杆菌bl21(de3)：表达菌株，购自宝生物工程(大连)有限公司。
38.以下实施例中使用的质粒：
39.pemoc2质粒：一种接合转移质粒，由华中农业大学陈焕春教授惠赠。该质粒可商购获得。
40.pbbr1-ms2质粒：一种广宿主质粒，购自淼灵生物。
41.以下实施例中使用的引物：
[0042][0043]
以下实施例中使用的培养基及添加成分：
[0044]
胰酶大豆琼脂(tryptic soy agar，tsa)和胰酶大豆肉汤(tryptic soy broth，tsb)购自bd difco公司，按说明书配制后用于培养胸膜肺炎放线杆菌(app)。
[0045]
新生牛血清(newborn calf serum)，购自兰州民海生物公司，按质量体积百分比5％加入到tsa或tsb中用于培养app感受态细胞。
[0046]
tsa+nad：在tsa中按质量体积百分比加入0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad)，购自roche公司，用于app的培养。
[0047]
tsb+nad：在tsb中按质量体积百分比加入0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad)，购自roche公司，用于app的培养。
[0048]
lb培养基：每1000ml中含胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，nac1 10g。按常规方法配制后用于大肠杆菌(e.coli)的培养。
[0049]
氯霉素(chloramphenicol，cm)：购自sigma公司。使用浓度分别为34μg/ml(重组质
粒筛选)和5μg/ml(app突变菌株筛选)。
[0050]
二氨基庚二酸(dap)：购自sigma公司。
[0051]
以下实施例中使用的分子生物学试剂：
[0052]
细菌全基因组提取试剂盒购自promega公司。
[0053]
pcr反应试剂，例如2
×
taq mix，均购自takara公司。
[0054]
限制性内切酶均购自thermo公司。
[0055]
质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、t4 dna连接酶和预染蛋白marker均购自neb公司。
[0056]
western-blot用immobilon-p pvdf(polyvinylidene fluoride)膜购自millipore公司。
[0057]
苯酚、氯仿、异戊醇及其他常用化学试剂均购自北京市化学试剂公司。
[0058]
若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
[0059]
实施例1.高产apxi毒素的app菌株的构建
[0060]
以app血清1型参考菌株(4074)为出发菌株，制备oxyr基因失活的突变菌株。app血清1型参考菌株(4074)的oxyr基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0061]
1.p-ea-oxyr质粒的构建
[0062]
以pemoc2质粒(接合转移质粒)作为骨架质粒。根据pacd4k质粒的序列信息设计得到目的片段1，所述目的片段1的核苷酸序列如seq id no：2所示。委托北京博迈德生物技术有限公司合成所述目的片段1并通过无缝克隆技术重组到pemoc2质粒上，构建成内含子载体，命名为pea质粒。
[0063]
根据app血清1型参考菌株(4074)的oxyr基因的核苷酸序列(seq id no：1)设计内含子插入位点，最终选取位点138|139作为靶定位点。所述位点138|139s的核苷酸序列如下：
[0064]
位点138|139s：5
’‑
cgcaaactagaggacgaattaggtacggta gtgc...tcac ttacttgaacgtacc-3’(seq id no：3)
[0065]
根据内含子插入位点序列设计靶点gdna序列(目的片段2)如下：
[0066][0067]
委托北京博迈德生物技术有限公司合成所述目的片段2并插入至上述pea质粒的
hindiii和bsrgi两个酶切位点之间，得到重组质粒，命名为p-ea-oxyr，用于oxyr基因的失活。质粒p-ea-oxyr的核苷酸序列如seq id no：5所示。
[0068]
2.转化大肠杆菌β2155
[0069]
利用常规cacl2法制备大肠杆菌β2155感受态细胞，然后通过热激转化法将重组质粒p-ea-oxyr转入大肠杆菌β2155感受态细胞中。通过氯霉素(cm)抗性筛选转化子。挑取单克隆，利用引物pea-f和pea-r进行菌液pcr，鉴定阳性克隆。得到了携带重组质粒p-ea-oxyr的大肠杆菌β2155。
[0070]
引物pea-f和pea-r的扩增产物为cm基因片段，产物大小为634bp。引物的核苷酸序列如下：
[0071][0072]
pcr体系：纯水12.5μl，2
×
taq mix 15μl，pea-f引物(10μm)1μl，pea-r引物(10μm)1μl，细菌基因组dna 1μl。
[0073]
pcr程序：首先95℃变性5min，然后进行30个循环(94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸2min)，最后72℃延伸10min。
[0074]
3.基因突变菌株的获得
[0075]
参考dehio c，meyer m.maintenance of broad-host-range incompatibility group p and group q plasmids and transposition of tn5in bartonella henselae following conjugal plasmid transfer from escherichia coli.journal of bacteriology.1997，179(2)：538-540.中记载的方法，将重组质粒p-ea-oxyr通过接合转移从供体菌(携带重组质粒p-ea-oxyr的大肠杆菌β2155)转入受体菌[野生型app血清1型参考菌株(4074)]中。
[0076]
接合转移的步骤如下：
[0077]
将供体菌和受体菌分别培养至长满平板后，用胰酶大豆肉汤(tsb培养基)将菌体洗下，洗涤两次，调整供体菌液和受体菌液的od600至1.0。将供体菌的菌液和受体菌的菌液按照1：1体积比混合后，滴加到贴有nc膜的37℃预热的tsa+nad+dap平板上，该平板中dap(二氨基庚二酸)的浓度为50mg/ml，37℃孵育8h。同时设置对照组，对照组只滴加受体菌的菌液。将孵育后平板上的细菌用tsb培养基洗下，洗涤两次，适当稀释后均匀涂布到tsa+nad+cm平板上，该平板中氯霉素(cm)的浓度为17μg/ml，37℃孵育24h-48h。将长出的单个菌落在tsb培养基中培养至od600为0.2后加入终浓度为1mm的iptg诱导1小时，将菌液适当稀释后均匀涂布到tsa+nad+cm平板上，该平板中氯霉素(cm)的浓度为17μg/ml，37℃培养至平板上长出单菌落。使用引物oxyr-yf-944和oxyr-yr-196(用于扩增oxyr序列插入失活区域)对长出的单菌落进行pcr验证，阳性克隆的扩增片段大小为944bp，阴性克隆的扩增片段大小为196bp。得到了携带重组质粒p-ea-oxyr的app血清1型参考菌株(4074)，称为oxyr基因突变菌株。
[0078]
引物序列如下：
[0079]
oxyr-yf-944(5
’‑3’
)：cagccgacactaagcggtca(seq id no：8)
[0080]
oxyr-yr-196(5
’‑3’
)：gcagcggtccggacatttct(seq id no：9)
[0081]
pcr体系：纯水12.5μl，2
×
taq mix 15μl，oxyr-yf-944引物(10μm)1μl，oxyr-yr-196引物(10μm)1μl，细菌基因组dna 1μl。
[0082]
pcr程序：首先95℃变性5min，然后进行30个循环(94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。
[0083]
4.构建高产apxi毒素的基因工程菌株
[0084]
使用细菌全基因组提取试剂盒(promega)提取野生型app血清1型参考菌株(4074)的基因组dna。以所述基因组dna为模板，利用引物apxia-f和apxia-r进行pcr，获得两端分别带xhoi和bamhi酶切位点的apxia基因片段。apxia基因的核苷酸序列如seq id no：10所示。通过酶切和连接反应将apxia基因片段插入pbbr1-ms2质粒(广宿主质粒)的xhoi和bamhi酶切位点之间，得到重组质粒pbbr1-apxi。将重组质粒pbbr1-apxi电击转化到上述3中获得的oxyr基因突变菌株中，经卡那霉素抗性筛选和菌落pcr验证后获得了apxi基因工程菌株。
[0085][0086]
pcr体系：纯水12.5μl，2
×
taq mix 15μl，apxia-f引物(10μm)1μl，apxia-r引物(10μm)1μl，细菌基因组dna 1μl。
[0087]
pcr程序：首先95℃变性5min，然后进行30个循环(94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸3min)，最后72℃延伸10min。
[0088]
5.基因工程菌株的筛选
[0089]
将野生型app血清1型参考菌株(4074)和上述4中获得的apxi基因工程菌株分别接种于tsb培养基中，于37℃培养6h后取菌株培养物，离心后收取培养物上清，检测上清中apxi毒素含量，并计算各菌株的apxi毒素产量。检测方法如下：
[0090]
将离心收取的培养物上清使用50kd孔径的超滤离心管浓缩，将1l上清浓缩至20ml后，使用离子脱盐柱(cytiva)将总蛋白样品的缓冲液置换成ph7-8、10-30mmol/l的tris-hcl缓冲液，然后使用sephacryls-200hr凝胶层析柱(泽叶生物)进行洗脱，洗脱剂为ph7-8、10-30mmol/l的tris-hcl缓冲液，洗脱剂的流速为0.5-lml/min，根据uv280紫外吸收曲线收集第一个洗脱蛋白峰，即得纯化的apxi毒素溶液。使用bca蛋白定量试剂盒(pierce)检测纯化的apxi毒素溶液中apxi毒素的浓度(mg/ml)，再用apxi毒素的浓度(mg/ml)乘以apxi毒素溶液的体积(ml)，得到apxi毒素的总量(mg)，然后利用公式1计算出菌株的apxi毒素产量。
[0091]
公式1：菌株的apxi毒素产量(mg/l)＝apxi毒素的总量(mg)/用于检测apxi毒素含量的菌株培养物的体积(l)。
[0092]
结果如表1所示，野生型app血清1型参考菌株(4074)的apxi毒素产量为0.76
±
0.12mg/l；5株apxi基因工程菌株的apxi毒素产量分别为2.367
±
0.25mg/l、2.086
±
0.18mg/l、2.137
±
0.22mg/l、1.975
±
0.13mg/l、1.886
±
0.17mg/l，其中1号apxi基因工程菌株的apxi毒素产量是野生型菌株的3倍多。
[0093]
表1
[0094][0095]
将上述1号apxi基因工程菌株送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)进行专利保藏，其保藏名称为4074-oxyr，保藏编号为cgmcc no.25495，保藏日期为2022年8月5日。所述1号apxi基因工程菌株在本文中简称为4074-oxyr菌株。
[0096]
6.western blotting鉴定4074-oxyr菌株中oxyr蛋白的表达情况
[0097]
挑取4074-oxyr菌株和野生型菌株[野生型app血清1型参考菌株(4074)]的单菌落，分别接种于5ml tsb+nad培养基中，于37℃振摇培养12～16h，取出培养菌液并按1∶50体积比接种于100ml tsb+nad培养基中，37℃继续振摇培养至od600达到0.8，取出培养菌液并于12000g离心15min，收集菌沉淀，将菌沉淀适当稀释后进行超声破碎，收集超声上清并进行sds-page电泳检测。
[0098]
western blotting分析：
[0099]
sds-page电泳结束后取出凝胶，切去多余部分，按照常规转印方法进行转印。通过预染蛋白marker的转印情况初步判断蛋白的转印效果。将转印后的pvdf膜浸入100％甲醇中约10s，然后放在滤纸上自然干燥约15min。将完全干燥的pvdf膜浸入100％甲醇中约10s，取出后置于去离子水中2min，然后转移至封闭液(含5％脱脂奶的pbst溶液)中，于37℃封闭1h或4℃封闭过夜；将oxyr多抗血清按1∶200体积比加入封闭液中，于37℃反应1h；用封闭液洗膜3次，每次10min；然后加入1∶10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg(sigma-aldrich，a9169)，于37℃反应1h；用封闭液洗膜3次，每次10min；最后将膜置于辣根过氧化物酶底物(sigma-aldrich)溶液中显色，条带清晰后迅速用蒸馏水终止显色反应。
[0100]
其中oxyr多抗血清的制备过程如下：利用细菌全基因组提取试剂盒(promega)提取野生型app血清1型参考菌株(4074)的基因组dna。以所述基因组dna为模板，用引物pet28-oxyr-f和pet28-oxyr-r扩增得到两端分别带ndei和xhoi酶切位点的oxyr基因片段。oxyr基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。通过酶切和连接反应将oxyr基因片段插入pet28a载体的ndei和xhoi酶切位点之间，获得连接产物。用所述连接产物转化大肠杆菌dh5a并进行阳性克隆鉴定，获得插入序列正确的原核表达质粒pet28a-oxyr。将pet28a-oxyr质粒转化大肠杆菌bl21(de3)并进行蛋白表达和纯化，获得oxyr蛋白。用纯化的oxyr蛋白免疫兔，获得oxyr多抗血清。
[0101][0102]
western blotting结果如图2所示，app1表示野生型app血清1型参考菌株(4074)
的全菌蛋白；4074-oxyr表示4074-oxyr菌株的全菌蛋白。oxyr天然蛋白的分子量大约为33kda。结果显示，野生型菌株表达oxyr蛋白，而4074-oxyr菌株不表达oxyr蛋白。因此，4074-oxyr菌株中的oxyr基因已失活。
[0103]
7.western blotting鉴定4074-oxyr菌株中apx毒素的表达情况
[0104]
挑取4074-oxyr菌株和野生型菌株[野生型app血清1型参考菌株(4074)]的单菌落，分别接种于5ml tsb+nad培养基中，于37℃振摇培养12～16h，取出培养菌液并按1：50体积比接种于100ml tsb+nad培养基中，37℃继续振摇培养6h，取出培养物并于12000g离心5min，收集培养物上清，使用50kd孔径的超滤离心管将20ml上清浓缩至500μl，进行sds-page电泳检测。
[0105]
western blotting分析：
[0106]
sds-page电泳结束后取出凝胶，切去多余部分，按照常规转印方法进行转印。通过预染蛋白marker的转印情况初步判断蛋白的转印效果。将转印后的pvdf膜浸入100％甲醇中约10s，然后放在滤纸上自然干燥约15min。将完全干燥的pvdf膜浸入100％甲醇中约10s，取出后置于去离子水中2min，然后转移至封闭液(含5％脱脂奶的pbst溶液)中，于37℃封闭1h或4℃封闭过夜；将apxian多抗血清或apxiian多抗血清按1∶500体积比加入封闭液中，于37℃反应1h；用封闭液洗膜3次，每次10min；然后加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg(sigma-aldrich，a9169)，于37℃反应1h；用封闭液洗膜3次，每次10min；最后将膜置于辣根过氧化物酶底物(sigma-aldrich)溶液中显色，条带清晰后迅速用蒸馏水终止显色反应。
[0107]
其中apxian多抗血清和apxiian多抗血清的制备过程如下：利用细菌全基因组提取试剂盒(promega)提取野生型app血清1型参考菌株(4074)的基因组dna。以所述基因组dna为模板，用引物pet28-apxian-f和pet28-apxian-r扩增得到两端分别带ndei和xhoi酶切位点的apxian基因片段。apxian基因的核苷酸序列如seq id no：19所示。以所述基因组dna为模板，用引物pet28-apxiian-f和pet28-apxiian-r扩增得到两端分别带ndei和xhoi酶切位点的apxiian基因片段。apxiian基因的核苷酸序列如seq id no：20所示。通过酶切和连接反应将扩增得到的apxian基因片段和apxiian基因片段分别插入pet28a载体的ndei和xhoi酶切位点之间，获得连接产物。用连接产物转化大肠杆菌dh5a并进行阳性克隆鉴定，获得插入序列正确的原核表达质粒pet28a-apxian和pet28a-apxiian。将pet28a-apxian和pet28a-apxiian分别转化大肠杆菌bl21ide3)并进行蛋白表达和纯化，获得apxian蛋白和apxiian蛋白。用纯化的apxian蛋白和apxiian蛋白分别免疫兔，获得apxian多抗血清和apxiian多抗血清。
[0108][0109]
western blotting结果如图3所示，其中a图显示apxi毒素蛋白的表达情况，b图显示apxii毒素蛋白的表达情况；app1表示野生型app血清1型参考菌株(4074)；4074-oxyr表示4074-oxyr菌株。apxi毒素的分子量大约为110kda，apxii毒素的分子量大约为103kda。结果表明，与野生型菌株相比，4074-oxyr菌株的apxi毒素分泌量显著增加，而apxii毒素分泌量无变化。

技术特征：
1.一株胸膜肺炎放线杆菌，其保藏编号为cgmcc no.25495。2.一种菌剂，其特征在于，其包含权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。4.权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌在制备apxi毒素中的应用。5.权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌在制备胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗中的应用。6.构建高产apxi毒素的胸膜肺炎放线杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)使胸膜肺炎放线杆菌中的oxyr基因失活，获得oxyr基因突变菌株；b)构建所述胸膜肺炎放线杆菌的apxia基因的表达载体并将所述表达载体导入所述oxyr基因突变菌株中，获得高产apxi毒素的基因工程菌株。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤a)包括：a1)将核苷酸序列如seq id no：2所示的目的片段1导入接合转移质粒pemoc2中，得到第一重组质粒；a2)将核苷酸序列如seq id no：4所示的目的片段2导入所述第一重组质粒中，得到第二重组质粒；a3)将所述第二重组质粒导入大肠杆菌β2155中，得到供体菌；a4)通过接合转移将所述第二重组质粒从所述供体菌导入所述胸膜肺炎放线杆菌中。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第二重组质粒的核苷酸序列如seq id no：5所示。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述apxia基因的核苷酸序列如seq id no：10所示。10.根据权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述胸膜肺炎放线杆菌为胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株。

技术总结
本发明涉及微生物领域，具体涉及高产ApxI毒素的APP菌株、其构建方法及应用。本发明提供一株胸膜肺炎放线杆菌，其保藏编号为CGMCC No.25495。所述胸膜肺炎放线杆菌的ApxI毒素产量高达2.367


技术研发人员：郭芳芳 徐福洲 崔一芳 王菁
受保护的技术使用者：北京市农林科学院
技术研发日：2023.01.10
技术公布日：2023/8/2