一种D-果糖及稀少糖的高通量检测方法

一种d-果糖及稀少糖的高通量检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种d-果糖及稀少糖的高通量检测方法，属于生物技术领域。


背景技术：

2.在碳水化合物研究领域中，稀少糖是一类重要的研究内容。国际糖协会(isrs)对稀少糖的定义为：在自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。尽管在自然界中含量极少，这些物质却在膳食、保健、医药等领域中发挥着非常重要的功能。例如，d-阿洛酮糖是一种低能量、不被人体消化的蔗糖替代品；d-塔格糖具有低热量、低吸收、抗龋齿、降血糖、改善肠道菌群及良好的理化性质等优点；d-阿洛糖具有抑制活性氧、抑制癌细胞增殖等功能；l-系列糖可以作为各种化学产品、药品的生产原料。
3.随着全球肥胖患者的不断增加，人们对低卡路里甜味剂的重视与需求与日俱增，天然健康的稀少糖作为一种低卡路里甜味剂已成为当下的研究热点。目前已工业制备的稀少糖主要有d-阿洛酮糖、d-塔格糖等。
4.d-阿洛酮糖是d-果糖c-3位的差向异构体，它是一种六碳还原性酮糖。d-阿洛酮糖的甜度相当于蔗糖的70％，但热量仅为0.4kcal
·
g-1
，比蔗糖低了90％。美国食品药品监督管理局(food and drug administration,fda)2014年6月发布认证，认定d-阿洛酮糖为“一般认定安全”(generally recognized as safe,gras)级别食品，2019年又将d-阿洛酮糖从食品营养和添加剂标签上“总糖”和“添加糖”部分中剔除，因此d-阿洛酮糖是一种潜在的蔗糖替代品。d-阿洛酮糖与糖醇相比入口无涩味且不会引发腹泻等不耐受症状，与其他大多数现有甜味剂相比，性质稳定且在食品制备与加热过程中与食物中的氨基酸和蛋白质相互作用发生美拉德反应，为食物提供独特的色泽与风味。
5.d-塔格糖作为一种天然存在的己酮糖，是d-果糖在c-4位的差向异构体，相对分子量为180.16，为白色结晶性粉末且易发生焦糖化反应和美拉德褐变反应，其甜度为蔗糖的92％，但能量仅为蔗糖的30％，属于低热量甜味剂。d-塔格糖能够满足巧克力、口香糖、蛋糕、冰激凌等大量含糖产品对低卡路里甜味剂的需求，也能与一些高强度甜味剂产生协同作用。2001年，d-塔格糖被fda批准为食品添加剂，并通过“一般公认安全(gras)”认证，世界卫生组织联合食品添加剂委员会在同年推荐d-塔格糖为一种新的低热量甜味剂，可以作为食品添加剂使用。2014年，中国批准d-塔格糖为新食品原料，可以用在除婴幼儿食品以外的食品中，并且对其摄入量没有限制。
6.稀少糖在自然界中含量较低，通常通过化学或生物法进行大量生产。化学法生产有一定的缺点，如反应条件剧烈不易控制、副产物较多不利于分离纯化等。相对来说生物法具有转化效率高、专一性强、副产物少，分离纯化简单等优点，因此成为稀少糖合成的主要方法。d-阿洛酮糖制备关键用酶是d-阿洛酮糖3-差向异构酶，可以d-果糖为原料经过差向异构化反应制备d-阿洛酮糖。shin等人以来源于石油热袍菌(thermotoga petrophila)的塔格糖酮酸3-差向异构酶(tagaturonate 3-epimerase)为研究材料，通过分子改造获得最优突变体s125d/n129t/l140p/t181a/h362l，其以d-果糖为底物制备d-塔格糖活性提高了
184倍，该突变体被命名为塔格糖4-差向异构酶(tagatose 4-epimerase，t4e)(acs catalysis,2020,10(20):12212-12222)。但t4e仍存在热稳定性及比活力较差的问题，限制了工业应用。
7.在d-果糖与d-阿洛酮糖以及d-果糖与d-塔格糖的混合体系中，由于d-果糖和d-塔格糖/d-阿洛酮糖均为酮糖，常规的酮糖检测方法无法对二者进行区分，而现有通过d-果糖-脱氢酶检测d-果糖的方法而存在成本较高的缺陷，因此d-阿洛酮糖及d-塔格糖的检测手段匮乏。


技术实现要素：

8.本发明公开了一种区分检测d-果糖与d-阿洛酮糖以及d-果糖与d-塔格糖的混合体系中特定糖的方法，并且利用所述方法筛选热稳定性及d-果糖转化率提高的塔格糖-4差向异构酶突变体。通过向稀少糖混合体系中加入干酵母溶液，代谢反应体系中的d-果糖，然后通过间苯二酚试剂对体系中剩余糖进行特异性检测。
9.本发明提供了一种检测d-果糖与稀少糖混合体系中的稀少糖的方法，先利用酵母消化d-果糖，再应用间苯二酚试剂对体系中剩余糖进行检测，所述稀少糖包括d-塔格糖和d-阿洛酮糖。
10.本发明还提供了所述方法在高通量筛选稀少糖制备关键酶中的应用。
11.本发明还提供了一种高通量筛选稀少糖制备关键酶的方法，包括以下步骤：
12.(1)向酶液中加入含d-果糖的缓冲液；
13.(2)向步骤(1)所得产物中加入酵母；
14.(3)用间苯二酚试剂对体系中剩余糖进行检测。
15.在一种实施方式中，所述关键酶包括d-阿洛酮糖3-差向异构酶、d-塔格糖3-差向异构酶或d-塔格糖4-差向异构酶。
16.在一种实施方式中，步骤(2)所述酵母为酿酒或毕赤酵母，浓度为0.1-50g
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l-1
。
17.在一种实施方式中，将步骤(2)所得产物于25-40℃、200-800r
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min-1
下反应12-36h。
18.在一种实施方式中，步骤(1)所述含d-果糖的缓冲液中包括5-500mmol
·
l-1
d-果糖。
19.本发明还提供了所述方法筛选得到的d-塔格糖4-差向异构酶突变体，将seq id no.1所示的氨基酸序列进行以下任一突变：
20.(1)将第430位的异亮氨酸突变为脯氨酸；
21.(2)将第90位的甘氨酸突变为丝氨酸，将第272位的苏氨酸突变为丙氨酸，并将第430位的异亮氨酸突变为脯氨酸。
22.本发明还提供了表达所述突变体的宿主细胞。
23.本发明还提供了所述突变体，或所述宿主细胞在制备d-塔格糖或含d-塔格糖的产品方面的应用。
24.有益效果：
25.本发明提供了检测d-果糖与稀少糖混合体系中的稀少糖的方法，利用酵母对d-果糖进行消化处理，并用间苯二酚对剩余稀少糖进行检测，所述检测方法准确度高，成本低，
单次检测单个样品的成本不超过0.1元。
26.本发明将上述方法应用于高通量筛选稀少糖制备关键酶，筛选出热稳定性和比活力提高的d-塔格糖4-差向异构酶突变体，与野生型相比，突变体i430p的热稳定性提高了1.83倍，g90s/t272a/i430p突变体比活力提高了21.4％。
附图说明
27.图1为酵母消化d-果糖、d-塔格糖、d-阿洛酮糖效果检测图。
28.图2为酵母消化结果图；其中，(a)：d-果糖；(b)：d-塔格糖；(c)：混合糖。
29.图3为d-阿洛酮糖标准曲线。
30.图4为d-塔格糖标准曲线。
31.图5为塔格糖-4差向异构酶(t4e)高通量筛选图。
32.图6为摇瓶复筛过程中突变体i430p与g90s/t272a/i430的热稳定性。
33.图7为突变体i430p与g90s/t272a/i430合成d-塔格糖转化率结果。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
35.下述实施例中涉及的试剂如下：
36.下述实例中涉及的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(hepps)、d-阿洛酮糖、d-塔格糖、d-果糖均购于麦克林生化科技有限公司(上海)，间苯二酚购自阿达玛斯试剂有限公司(上海)，活性干酵母购自安琪酵母股份有限公司(上海)，d-果糖、d-阿洛酮糖、d-塔格糖标品购自维塔化学试剂有限公司(上海)。所用构建宿主为大肠杆菌jm109，所用表达宿主为大肠杆菌bl21(de3)，所用质粒载体为pet-24a，抗性为卡那霉素抗性。
37.高通量筛选过程中所使用的96浅孔板为无菌96浅孔板，所使用96深孔板需用报纸包扎后进行高温高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。灭菌后培养基的分装过程于超净工作台内进行，培养基分装前加入100μg/ml卡那霉素。种子培养基为lb培养基，于96浅孔板中添加量200μl；发酵培养基为tb培养基，96深孔板中添加量1ml。
38.下述实施例中涉及的培养基如下：
39.lb培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，nacl 10。
40.tb培养基(g/l)：蛋白胨12，酵母粉24，甘油10，k2hpo4·
3h2o 16.43，kh2po
4 2.3。
41.下述实施例中涉及的检测方法如下：
42.间苯二酚检测方法：
43.将消化后的浅孔板于4000r
·
min-1
下离心15min，取100μl离心上清于深孔板每孔中，并向每孔内加入100μl的seliwanoff试剂，密封后于沸水浴中精准反应10min，反应结束后冰浴冷却，随后取150μl于浅孔板中，使用酶标仪测定400nm处吸光度。
44.seliwanoff试剂(现配现用)的配制：称取一定质量的间苯二酚溶于12％的盐酸(浓盐酸稀释三倍)，间苯二酚终浓度为2g
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l-1
。
45.蛋白浓度检测方法：
46.依据bio-rad蛋白凝胶试剂盒的操作说明书制备蛋白凝胶。首先制备12％的分离凝胶，随后制备5％的浓缩凝胶。蛋白凝胶样品制备：20μl样品中添加5μl的sds-page蛋白上
样缓冲液(5
×
)。然后将处理完毕的样品置于100℃金属浴处理10min，8000g离心30s。使用tris-hcl buffer(ph 8.3)进行蛋白凝胶电泳。蛋白电泳结束后，进行凝胶染色，凝胶脱色，之后使用凝胶成像系统进行拍照，利用imagej软件进行图像分析，得到目的蛋白占总蛋白量比值。使用bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天beyotime)测定总蛋白浓度，并计算目的蛋白浓度。
47.产物检测方法：
48.样品灭酶处理后于12000r
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min-1
下离心5min，将上清取出并稀释至一定浓度，之后将样品用0.22μm的滤膜过滤。色谱条件：agilent 1200hplc色谱仪，agilent hi-plex ca，300
×
7.7mm色谱柱，agilent示差检测器，agilent自动进样器，流动相为纯水，柱温为80℃，流速为0.5ml
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min-1
。
49.实施例1：稀少糖的消化
50.分别配制25g
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l-1
的d-果糖、d-塔格糖和d-阿洛酮糖溶液，分别向其中加入终浓度为5g
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的干酵母溶液，于30℃，200r
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下震荡培养24h。消化完成后，取样并将样品煮沸10min灭活，之后于12000r
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min-1
下离心10min，将上清使用间苯二酚进行测定。结果如图1所示，d-果糖在消化后，吸光度显著降低，而d-塔格糖和d-阿洛酮糖消化后吸光度基本没变化，表明酵母能够消化d-果糖而对d-塔格糖和d-阿洛酮糖基本不具有消化能力。
51.实施例2：高通量筛选方法的建立
52.分别配制25g
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的d-果糖和25g
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的d-塔格糖溶液，并将二者按1:1混合，配制成含12.5g
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的d-果糖与12.5g
·
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的d-塔格糖的溶液。
53.酵母消化实验：分别取10ml上述溶液于锥形瓶内，并向其中加入50mg的活性干酵母，密封后于30℃，200r
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min-1
下震荡培养24h，期间每隔2h取样，并将样品煮沸10min灭活，之后于12000r
·
min-1
下离心10min，将上清进行液相检测。结果如图2所示，干酵母在12h内能够完全代谢d-果糖而对d-塔格糖基本不具有代谢能力，在d-果糖与d-塔格糖的混合体系中，d-果糖被完全代谢，而d-塔格糖浓度基本无明显变化，结果表明该方法能够在不影响d-塔格糖含量的情况下，除尽体系内的d-果糖。
54.d-塔格糖标准曲线的绘制：通过间苯二酚法对不同浓度的d-塔格糖进行测定，其结果如图4所示，在d-塔格糖浓度在0-30mmol
·
l-1
范围内，通过间苯二酚可以较为灵敏地测定d-塔格糖的浓度，且d-塔格糖浓度与吸光度之间线性关系较好。证明通过间苯二酚可以较为准确的测定d-塔格糖的含量，且该方法的灵敏度可用于高通量筛选。
55.d-阿洛酮糖标准曲线的绘制：通过间苯二酚法对不同浓度的d-阿洛酮糖进行测定，其结果如图3所示，在d-阿洛酮糖浓度在0-20mmol
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l-1
范围内，通过间苯二酚可以较为灵敏地测定其浓度，且浓度与吸光度之间线性关系较好。证明通过间苯二酚可以较为准确的测定d-阿洛酮糖的含量，且该方法的灵敏度可用于高通量筛选。
56.实施例3：塔格糖-4差向异构酶(t4e)突变文库的构建
57.鉴于t4e的晶体结构尚不清晰，因此通过易错pcr对t4e全序列进行随机突变。
58.1.随机突变
59.高通量筛选引物为：
60.正向引物f：atattttccggatctgaaaccggttaga；
61.反向引物r：tcattttgttccagtgttttaaacagtctttcttt；
62.通过megawhop构建突变体文库，反应体系及反应条件如下所示：
63.以pet-24a(+)-t4e(公司合成seq id no.2所示的t4e编码基因后，经bamhi及hindiii双酶切后连接载体)为模板，扩增t4e编码基因。pcr体系(50μl)：50ng模板，5μl 10
×
pcr buffer，0.5μl rtaq酶，1μl上下游引物(10μmol
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l-1
)，4μl dntp mix，终浓度为0.15mmol
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l-1
的mn
2+
，ddh2o补齐。扩增程序：98℃，3min；30个循环(98℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)，72℃，5min，4℃保温。之后将pcr产物进行核酸电泳，确认条带大小正确后，进行切胶回收。
64.以回收的目的片段为引物，以megawhop法进行pcr以扩增全质粒。pcr体系与上述体系相同，将上下游引物替换为胶回收片段，程序为：72℃，5min；98℃，3min；循环30(98℃，30s；55℃，30s；72℃，7min)；72℃，5min；4℃保存。
65.2.突变文库基因的转化
66.取10μl pcr产物，加入1μl dpn i酶和1μl buffer，37℃水浴2h，进行模板消化。消化模板后，将pcr产物转化至e.coli bl21(de3)，涂布在抗性平板上，在37℃下静置培养。
67.(1)待平板上的菌落大小数量合适后，挑取单菌落进行建库。
68.(2)向无菌96浅孔板每孔加入200μl的lb液体培养基(kan：30μg
·
ml-1
)，使用灭菌后的牙签将平板上的单菌落挑取至含有lb液体培养基的浅孔板每孔内，并分别设置空白对照和野生型对照。
69.(3)将96浅孔板密封后，于37℃，700r
·
min-1
下震荡培养10h左右。向浅孔板中剩余的菌液内加入50μl灭菌后的质量分数为60％的甘油，密封后保存在-80℃冰箱内备用。
70.3.突变文库菌株的发酵
71.(1)向灭菌后的96深孔板每孔加入1ml的tb培养基(kan：30μg
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ml-1
)，将浅孔板内的种子液以5％接种量转接至深孔板内，将深孔板使用纱布密封后转移至37℃、750r
·
min-1
振荡培养2h，之后将其转移至25℃、750r
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min-1
发酵诱导表达24h。
72.(2)深孔板发酵结束后，将其于4℃、4000r
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min-1
下离心15min，将离心后的发酵上清丢弃，剩余菌体保存在-20℃冰箱内备用。
73.实施例4：利用新型高通量筛选方法筛选d-果糖转化率提高的突变体
74.(1)向留有菌体的深孔板每孔内加入300μl的hepps缓冲液(含50mol
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d-果糖和1.5mmol
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的ni
2+
)，震荡混匀后，于60℃，750r
·
min-1
下反应2h。
75.(2)反应结束后，将深孔板于4000r
·
min-1
下离心15min，取200μl离心后的上清于浅孔板每孔中，并向其中加入20μl的干酵母溶液(干酵母浓度50g
·
l-1
)吹洗混匀密封后于30℃、750r
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min-1
下反应24h，进行酵母消化处理。
76.(3)将消化后的浅孔板于4000r
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min-1
下离心15min，取100μl离心上清于深孔板每孔中，并向每孔内加入100μl的seliwanoff试剂，密封后于沸水浴中精准反应10min，反应结束后冰浴冷却，随后取150μl于浅孔板中，使用酶标仪测定400nm处吸光度。
77.(4)选取吸光值高于野生型的突变体进行96孔板复筛，复筛方法与初筛基本一致，每组设置三个平行，重复以上筛选过程。
78.(5)摇瓶复筛：将96孔板复筛中表现较好的突变体，进行测序，将发生突变的突变体菌株以2
‰
量加入到lb培养基中(卡那霉素30μg
·
ml-1
)并于37℃、200r
·
min-1
下震荡培养10h左右。将培养完成后的菌液以5％量加入到tb培养基(卡那霉素30μg
·
ml-1
)中，并于37
℃、200r
·
min-1
下震荡培养2h，至od
600
为0.6左右，随后改变培养温度，于25℃、200r
·
min-1
下培养24h，进行诱导表达。发酵结束后，将获得的菌体重悬后，调整成50od，进行高压匀浆破壁，镍柱纯化，制备纯酶。
79.(6)蛋白纯化
80.a使用ph 8.5的hepps缓冲液将菌体重悬混匀，提前打开高压匀浆机进行预冷并清洗干净，将重悬后的菌液加入样品池并在800-900bar下对菌液进行破壁，每个样品破壁时间为3min。
81.b将破壁后的菌液于4℃、8000r
·
min-1
下离心20min收集上清液，将离心后的上清液使用0.22μm滤头进行过滤以除去杂质。
82.c先用100ml的去离子水冲洗镍柱除去残留的乙醇，然后用100ml的缓冲液a冲洗镍柱进行柱平衡，随后将粗酶液在低流速下挂柱，重复挂柱三次。
83.d用100ml的缓冲液a对镍柱进行冲洗以除去结合能力较弱的杂蛋白，随后分别用60ml 30mmol
·
l-1
的咪唑溶液、60ml 60mmol
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的咪唑溶液洗脱杂蛋白；然后分别用60ml 90mmol
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、60ml 150mmol
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l-1
的咪唑溶液洗脱目的蛋白。
84.e提前向10kda大小的超滤管中加入去离子水并于4℃、3500r
·
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下离心20min进行超滤清洗，然后将含有目的蛋白的洗脱液加入超滤管内进行超滤，超滤结束后，向超滤管内加入一定体积的hepps缓冲液进行超滤以置换缓冲液，超滤完成后，将酶液收集保存备用。
85.酶活力的测定：将200μl等蛋白浓度的酶液加入到800μl含有50mmol
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d-果糖的hepps缓冲液(50mmol
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，ph 8.5，1.5mmol
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ni
2+
)中，缓冲液需提前预热，混匀后置于70℃下反应30min，之后沸水浴10min进行灭酶。
86.酶活力定义：每分钟内产生1μmol d-塔格糖所用的酶量为一个酶活单位(u)。
87.比活力定义：单位重量(mg)酶所具有的酶活力单位。
88.热稳定性测定：取一定量的t4e酶液置于70℃下进行孵育，间隔一定时间取样，按照上述所示方法测定残余酶活，定义反应0h时酶活为100％，计算不同样品的相对酶活。
89.筛选结果：共筛选t4e突变体菌株3000株，其中，d-塔格糖合成能力提升突变体菌株2株，结果如图6～7所示。其中i430p突变体于70℃下半衰期是野生型的1.83倍，d-塔格糖合成能力有一定提升。g90s/t272a/i430p突变体菌株比活力较野生型提高了21.4％，d-塔格糖合成能力也有一定的提升。
90.对比例1：
91.具体实施方式参考实施例4，区别在于，省略酵母消化步骤，结果表明经过酶促反应后，无法区分d-果糖及d-塔格糖，od
400nm
均为1.8左右，不能区分d-果糖和d-塔格糖，致使后续实验无法进行。
92.对比例2：
93.具体实施方式参考实施例4，区别在于，用商业化果糖检测试剂盒特异性检测d-果糖，通过对比酶促反应前后d-果糖浓度变化值以反映酶促反应速率，结果表明可以在一定程度上测定d-果糖，但由于商业化试剂盒高昂的价格(通常5000左右价格，检测100次)，限制了筛选应用，而本发明所用方法单次检测单个样品的成本不超过0.1元。
94.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技
术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种检测d-果糖与稀少糖混合体系中的稀少糖的方法，其特征在于，先利用酵母消化d-果糖，再对体系中剩余糖进行检测；所述稀少糖包括d-塔格糖和d-阿洛酮糖。2.利用权利要求1所述方法高通量筛选稀少糖制备关键酶的方法，其特征在于，所述关键酶能够利用d-果糖，所述方法包括以下步骤：(1)向关键酶的酶液中加入含d-果糖的缓冲液；(2)向步骤(1)所得产物中加入酵母；(3)用间苯二酚试剂对体系中剩余糖进行检测。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述关键酶包括d-阿洛酮糖3-差向异构酶、d-塔格糖3-差向异构酶或d-塔格糖4-差向异构酶；当所述关键酶是d-阿洛酮糖3-差向异构酶或d-塔格糖3-差向异构酶时，所述剩余糖是d-阿洛酮糖；当所述关键酶是d-塔格糖4-差向异构酶时，所述剩余糖是d-塔格糖。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述酵母为酿酒酵母或毕赤酵母，终浓度为0.1-50g
·
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。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将步骤(2)所得产物于25-40℃、200-800r
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min-1
下反应12-36h。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述含d-果糖的缓冲液中包括5-500mmol
·
l-1
d-果糖。7.权利要求1所述方法在高通量筛选稀少糖制备关键酶中的应用。8.权利要求2～6任一所述方法筛选得到的d-塔格糖4-差向异构酶突变体，其特征在于，将seq id no.1所示的氨基酸序列进行以下任一突变：(1)将第430位的异亮氨酸突变为脯氨酸；(2)将第90位的甘氨酸突变为丝氨酸，将第272位的苏氨酸突变为丙氨酸，并将第430位的异亮氨酸突变为脯氨酸。9.表达权利要求8所述突变体的宿主细胞。10.权利要求8所述突变体，或权利要求9所述宿主细胞在制备d-塔格糖或含d-塔格糖的产品方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种D-果糖及稀少糖的高通量检测方法，属于生物技术领域。本专利聚焦于D-果糖到D-阿洛酮糖或D-塔格糖生物合成过程中产生的混合糖体系，通过活性干酵母特异性的代谢消耗D-果糖，进而通过间苯二酚法测定反应体系中的D-阿洛酮糖或D-塔格糖。本专利的检测方法便捷高效，并且成本低。将上述方法应用于高通量筛选稀少糖制备关键酶，筛选出热稳定性和比活力提高的D-塔格糖4-差向异构酶突变体，与野生型相比，突变体I430P的热稳定性提高了1.83倍，G90S/T272A/I430P突变体比活力提高了21.4％。21.4％。21.4％。


技术研发人员：刘展志 吴敬 郭雪红
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/4