一种M2型巨噬细胞靶向的纳米药物制剂及其应用

一种m2型巨噬细胞靶向的纳米药物制剂及其应用
技术领域
1.本发明属于医药化工药物制剂技术领域，具体涉及一种m2型巨噬细胞靶向的纳米药物制剂及其应用。


背景技术：

2.巨噬细胞是固有免疫的重要成员，在机体防御病原微生物感染、肿瘤、过敏性疾病、代谢类疾病、组织损伤修复等发生发展过程中发挥着极其重要的作用。在微环境，尤其是多种细胞因子的影响下，巨噬细胞极化成m1/m2型巨噬细胞，表达相应的特异性基因，行使不同的功能。m1型巨噬细胞主要发挥促炎、杀菌及呈递抗原的功能，m2型巨噬细胞主要起抑炎和组织修复的作用。其中m2型巨噬细胞在多种疾病的发生发展中起重要作用，例如：1)哮喘和过敏性变态反应性哮喘是肺部最常见的慢性炎症性疾病，炎症反应是由th2淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞向肺的聚集所致，并与巨噬细胞的m2极化有关。巨噬细胞是过敏性哮喘的重要调节因子，也是肺损伤、纤维化和杯状细胞增生相关炎症反应的启动因子；2)慢性炎症是心血管疾病的主要病因，最终导致动脉粥样硬化。巨噬细胞凋亡是动脉硬化发展各个阶段的一个重要特征，在疾病进展过程中，主要通过m2巨噬细胞，通过内膜吞噬细胞来解决细胞凋亡及其不良影响。此外，m1和m2巨噬细胞的炎症表型并不稳定，这可能反映了单核细胞衍生细胞对微环境变化的可塑性；3)类风湿关节炎是一种慢性自身免疫性疾病,可引起关节炎症和残疾。类风湿关节炎炎症早期阶段，滑膜衬里层巨噬细胞数量增加，滑膜巨噬细胞浸润程度与关节破坏程度相关。m1型巨噬细胞通过抗原递呈激活t细胞，同时还分泌多种炎性细胞因子，募集更多免疫细胞，激活成纤维样滑膜细胞，促进炎性反应。类风湿关节炎炎症消退阶段，m2型巨噬细胞发挥抑制炎性作用。4)结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，结核分枝杆菌可能抑制巨噬细胞以避免细胞毒性功能和逃避细胞免疫反应，或使m1极化的巨噬细胞向m2表型转移。尽管在预防、诊断和治疗方面取得了进展，但结核病仍然是世界上最致命的传染病之一；5)肿瘤是目前全球性健康问题，其中浸润到肿瘤内的巨噬细胞在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，m1型巨噬细胞具有杀伤肿瘤细胞的作用，而m2型巨噬细胞则表现为促进肿瘤生长。巨噬细胞的极化与肿瘤微环境密切相关，在长期肿瘤微环境的作用下，巨噬细胞主要表现为m2型，与肿瘤生长、发展、侵袭和转移密切相关。巨噬细胞向m1型和m2型的极化具有可逆性和可调节性。在肿瘤的各阶段，m1型和m2型巨噬细胞均存在，早期以m1型为主，中晚期以m2型为主。随着肿瘤的进展，m1型逐渐向m2型极化，m2型数量的增多也提示着预后不良。因此，以m2型巨噬细胞为治疗靶点在多种疾病治疗中具有重大价值。
3.目前，靶向m2型巨噬细胞的手段极少，多数以合成靶向多肽修饰的纳米给药系统包括脂质体、微球、纳米粒等，或者以抗体药物偶联物(adc)为主。但是复杂的合成工艺和高昂成成本，限制其向临床的转化的可行性。因此，目前以m2型巨噬细胞为靶点的治疗因为没有合适的靶向药物而陷入瓶颈。
4.cd163是一种仅存在于巨噬细胞及其祖细胞中的表面受体，并且在m2型巨噬细胞
中过表达。人体内游离血红蛋白的清除机制是血红蛋白内源性地与血液中结合珠蛋白结合，其复合体可特异性地靶向结合肝脏、脾脏部位的m2型巨噬细胞的cd163受体，从而清除出体内。因此血红蛋白是一种很有潜力的m2型巨噬细胞靶向分子。目前，尚无有关以血红蛋白为靶向修饰的纳米剂型用于炎症疾病治疗的报道。


技术实现要素：

5.本发明通过大量的检索和创造性实验，一种m2型巨噬细胞靶向的纳米药物制剂；该药物制剂具有粒径小、载药量高等特性，可精准靶向发病部位(如结核病、肿瘤)的m2型巨噬细胞，实现药物的靶向递送；然后通过调控m2型巨噬细胞调控发病部位免疫微环境，从而达到治疗炎症相关疾病的效果。
6.本发明提供的一种m2型巨噬细胞靶向的纳米药物制剂，包括药物活性成分和纳米载体；其中，所述纳米载体的表面键接有血红蛋白冠。
7.其中，所述血红蛋白冠以直接方式键接在纳米载体表面上。
8.所述血红蛋白冠采用如下方式键接在纳米载体上：血红蛋白通过表面的巯基基团与纳米载体表面的马来酰亚胺进行迈克尔加成反应，形成血红蛋白冠。
9.具体的：纳米载体的表面修饰有马来酰亚胺官能基团，血红蛋白可以通过表面的巯基基团与纳米载体表面的马来酰亚胺进行迈克尔加成反应，特异性键合在纳米载体的表面，在纳米载体表面形成一层血红蛋白的外冠，从而能够与血液内内源性结合珠蛋白特异性结合，靶向炎症部位的m2型巨噬细胞。
10.其中，所述纳米载体的粒径为50～200nm。
11.其中，所述纳米载体为键接有血红蛋白冠的脂质体、胶束、纳米囊泡、外泌体、纳米微球、固体脂质纳米粒或纳米凝胶等药物载体输送系统。即为修饰有血红蛋白的脂质体、胶束、纳米囊泡、外泌体、纳米微球、固体脂质纳米粒或纳米凝胶等
12.上述脂质体、胶束、纳米囊泡、外泌体、纳米微球、固体脂质纳米粒或纳米凝胶等药物载体输送系统可按照现有技术中报道过的任何一种方法制备。
13.优选的，制备所述脂质体的原料选自胆固醇、二油酰磷脂酰胆碱、磷脂磷脂酰胆碱、磷脂磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、n-羟基琥珀酰亚胺修饰磷脂-聚乙二醇、马来酰亚胺修饰磷脂-聚乙二醇、n-羟基琥珀酰亚胺修饰二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇、马来酰亚胺修饰二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇，或其衍生物中的一种或多种。
14.以脂质体为载体的纳米药物制剂的制备方法可采用如下方式制得：
15.1)将脂质材料分散在有机溶剂中，为体系a；将药物活性成分分散在有机溶剂中，为体系b；将血红蛋白溶于缓冲盐溶液溶液中(ph为7.0～7.6)，为体系c；
16.2)将体系a中加入体系b中，得到体系d；再将体系d通过旋转蒸发除去有机溶剂并在容器壁上形成薄膜；然后用超纯水，使用超声复乳技术，即可得载活性药物的脂质体药物制剂，获得体系e；
17.3)将体系c加入体系e中，在氩气保护状态下，冰浴中搅拌12h，得到体系f；然后将体系f通过葡聚糖凝胶g-250透析除去未键合的游离血红蛋白和未担载的药物，使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤，即得到纳米药物制剂(血红蛋白冠脂质体药物制剂)。
18.优选的，制备胶束(聚合物胶束)的原料选自n-羟基琥珀酰亚胺修饰聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸或马来酰亚胺修饰聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸、n-羟基琥珀酰亚胺修饰聚乙二醇-聚己内酯或马来酰亚胺修饰聚乙二醇-聚己内酯、n-羟基琥珀酰亚胺修饰聚乙二醇-聚碳酸酯或马来酰亚胺修饰聚乙二醇-聚碳酸酯中的一种或多种。
19.以胶束为载体的纳米药物制剂的制备方法可采用如下方式制得：
20.1)将聚合物材料分散在有机溶剂中，为体系ⅰ；将药物活性成分分散在有机溶剂中，为体系ⅱ；将血红蛋白溶于缓冲盐溶液溶液中(ph为7.0～7.6)，为体系ⅲ；
21.2)将体系ⅰ加入体系ⅱ中，得到体系ⅳ；将体系ⅳ逐滴加入到水溶液中，搅拌1小时后加入截留分子量3500的透析袋中，以水为透析介质进行透析，形成包裹疏水药物的聚合物药物制剂，获得体系
ⅴ
；
22.3)将体系ⅲ加入至体系
ⅴ
中，在氩气保护状态下，冰浴中搅拌12h，得到体系ⅵ；将体系ⅵ通过葡聚糖凝胶g-250透析除去未键合的游离血红蛋白和未担载的药物，使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤，即得到纳米药物制剂(血红蛋白冠聚合物胶束药物制剂)。
23.其中，所述药物活性成分包括但不限于为治疗炎症、肿瘤等药物；可以为化学药物，或中药提取物，或蛋白药物，或核酸药物。
24.所述药物活性成分为抗肿瘤药物、抗菌药物、关节炎药物、抗病毒药物或维生素。
25.具体的，所述药物活性成分选自甲氨蝶呤、来氟米特、羟氯喹、利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、阿霉素、紫杉醇、吉西他滨、奥沙利铂、多柔比星、柔红霉素、甲氨蝶呤、多西他赛、卡培他滨、胰岛素、pd-1抗体、ctla-4抗体、小干扰rna、核酸适配体、维生素c中的一种或多种。
26.其中，所述药物活性与所述纳米载体的重量比为1：4～15；优选的，所述药物活性成分与纳米载体原料的质量比为1:8；优选为1:6～10；更优选为1:8。
27.其中，所述血红蛋白为本领域常规的血红蛋白，如牛血红蛋白、小鼠血红蛋白、人血红蛋白；能够靶向炎症、肿瘤部位的m2型巨噬细胞。
28.本发明提供上述任一所述的m2型巨噬细胞靶向的纳米药物制剂在制备治疗炎症疾病上药物或试剂中的应用。
29.该炎症疾病包括病原微生物感染，如细菌、病毒、支原体等引起人体组织渗出、增生、坏死等炎性反应，包括结核病、阴道炎、前列腺炎、肺炎等。非感染性炎症指的是由于物理、化学因素导致的炎症反应，包括风湿性关节炎、狼疮性皮炎等；炎症相关性疾病包括癌症、脑卒中等。
30.即，所述药物或试剂具体为结核病、阴道炎、前列腺炎、肺炎、风湿性关节炎、狼疮性皮炎、癌症、脑卒药物或制剂。
31.本发明所述的m2型巨噬细胞靶向的纳米药物制剂的制备方法如下：将药物活性成分(治疗性药物)采用物理方式包封在纳米载体中，在将血红蛋白通过化学键合修饰在载药纳米载体表面，制备血红蛋白冠纳米药物制剂。
32.在实际应用中，将所制备的血红蛋白冠纳米药物制剂通过静脉注射到人体内，血液循环过程中，血液中结合珠蛋白与血红蛋白冠纳米药物制剂表面的血红蛋白特异性结合，呈现出新的抗原决定簌，可以特异性识别炎症部位的m2型巨噬细胞表面的cd163抗体，从而主动靶向定位到炎症部位，提高了炎症部位药物浓度，保障了药效的发挥。研究表明，
感染性炎症、非感染性炎症以及炎症相关性疾病如肺结核、癌症的发病部位均有大量m1型和m2型巨噬细胞募集，并且疾病的发生与发展与m2型巨噬细胞的炎症调控密切相关，因此利用修饰有血红蛋白冠的纳米药物制剂治疗炎症或炎症相关的疾病如结核病、癌症，可以靶向提高药物在病变部位的蓄积，从而提高药物的疗效，并降低脱靶风险，降低药物的毒副作用。综上所述，担载有治疗性药物的血红蛋白冠的纳米药物制剂，在内源性结合珠蛋白的作用下，可以将治疗性药物靶向递送到炎症相关疾病部位，进行疾病的靶向治疗，抑制疾病的发生和发展。
33.本发明所述的纳米载体可按照现有技术中报道过的任何一种方法制备。
34.本发明以血红蛋白冠修饰的纳米载体为递药载体，首先，纳米载体可以保护活性药物逃避网状内皮系统的清除，延长活性药物的循环半衰期，实现药物的可控释放，减少药物泄露所导致的毒副作用。其次，血红蛋白冠修饰的纳米载体可以与血液中结合珠蛋白特异性结合，从而特异性靶向炎症部位的m2型巨噬细胞，提高活性药物在炎症部位的浓度。第三，血红蛋白可以同时传输氧气、一氧化碳、一氧化氮等一种或多种治疗气体，能够在炎症高ros环境中响应性释放携带的气体，配合活性药物治疗炎症。因此，血红蛋白冠纳米载体可以起到内源特异性靶向递送，降低活性药物对正常细胞、组织毒副作用，与活性药物协同治疗炎症的作用。
35.与现有技术相比，本发明具有的优点如下：
36.1.本发明提供的血红蛋白冠修饰的纳米药物制剂，内源性与结合珠蛋白相结合，特异性靶向炎症部位的m2型巨噬细胞，成功解决了活性药物的对炎症部位m2型巨噬细胞的靶向性问题。
37.2.本发明所制备的血红蛋白冠修饰纳米药物制剂，利用纳米载体担载活性药物，保证了较高的载药量，实现对药物的可控释放，减少了活性药物对正常组织的毒副作用。
38.3.本发明所制备的血红蛋白冠修饰的纳米药物制剂，能够同时递送氧气、一氧化碳、一氧化氮等一种或多种治疗气体，因此能够协同活性药物提高炎症治疗效果。
39.4.本发明所使用的纳米载体均是被fda批准的已经在临床中应用的纳米载体，所使用的血红蛋白是人体内数量最多的功能蛋白，容易从患者体内获得，这使得本发明具备较高的临床开发应用价值。
附图说明
40.图1为负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂的dls图；
41.图2为负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂的tem图片；
42.图3为不同阿霉素/纳米载体投料比条件下的药物担载效率和载药量曲线图；
43.图4为负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂在37℃和4℃条件下pbs(ph7.4)中的稳定性；
44.图5为负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂在37℃条件下ph值7.4,，6.5，5.0pbs(10％fbs，0.01m)中的药物释放行为。
45.图6为小分子阿霉素，脂质体阿霉素(市售)和负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂的血液药代动力学曲线；
46.图7为小分子阿霉素，脂质体阿霉素(市售)和负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药
物制剂给药24h后主要脏器中药物浓度；
47.图8为小分子阿霉素，脂质体阿霉素(市售)和负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂给药24h后在肺、肝脏和肿瘤中巨噬细胞内的药物荧光强度；
48.图9为原位乳腺癌模型小鼠给药生理盐水，小分子阿霉素，脂质体阿霉素(市售)，携带氧气的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂和携带一氧化碳的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂肿瘤抑制曲线；
49.图10为原位乳腺癌模型小鼠给药小分子阿霉素，脂质体阿霉素(市售)，携带氧气的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂和携带一氧化碳的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂治疗后小鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的h&e切片；
50.图11为原位乳腺癌模型小鼠给药小分子阿霉素，脂质体阿霉素(市售)，携带氧气的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂和携带一氧化碳的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂治疗后小鼠生存曲线；
51.图12为负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂的dls图；
52.图13为负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂的tem图片；
53.图14为不同利福平/纳米载体投料比条件下的药物担载效率和载药量曲线图；
54.图15为负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂在37℃和4℃条件下pbs(ph 7.4)中的稳定性；
55.图16为负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂在37℃条件下ph值7.4，6.5，5.0pbs中的药物释放行为；
56.图17为小分子利福平，负载利福平的聚合物胶束制剂和负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂的血液药代动力学曲线；
57.图18为小分子利福平，负载利福平的聚合物胶束制剂和负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂给药24h后主要脏器中药物浓度；
58.图19为负载荧光探针的聚合物胶束制剂和负载荧光探针的血红蛋白冠聚合物胶束制剂给药24h后为肺结核结节切片中荧光染料(红色荧光)和cd163(绿色荧光)免疫荧光染色，荧光染料(红色荧光)和cd86(绿色荧光)免疫荧光染色；
59.图20为原位肺结核模型小鼠给药生理盐水，小分子利福平，负载利福平的聚合物胶束制剂和负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂给药后小鼠肺部荧光海分枝杆菌成像；
60.图21为原位肺结核模型小鼠给药生理盐水，小分子利福平，负载利福平的聚合物胶束制剂和负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂给药后小鼠肺部细菌平板图。
具体实施方式
61.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
62.如下血红蛋白采用如下方式进行分离和纯化：
63.收集小鼠血液：取50ml烧杯，加入溶有0.6g柠檬酸钠的10ml的生理盐水，再加入10ml的小鼠血液，搅拌。
64.红细胞的洗涤：转移5ml的小鼠血液稀释液到10ml离心管中，5000r/min离心5min，得到上层透明的黄色血浆和下层暗红色的红细胞液体；用胶头滴管吸出上层透明的黄色血
浆，把下层暗红色的红细胞液体转入10ml的烧杯，再加入5倍体积的生理盐水，轻轻搅拌10min，转入离心管中，5000r/min离心5min。如此再重复3次，直至上清液不显黄色为止，表明红细胞洗涤干净。
65.血红蛋白的释放：洗涤好的红细胞液约2ml.加入30ml的蒸馏水，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min，5000r/min离心8min；上清液为血红蛋白溶液，沉淀物为细胞碎片；用双层纱布过滤。得到含血红蛋白的滤液。
66.盐析分离血红蛋白：取2ml滤液，逐渐加入30ml的(nh4)2so4饱和溶液，边加边摇，溶液出现红色浑浊；转移10ml混浊液到离心管中，10000r/min离心10min.离心管下部沉淀的深红物质就是分离出来的血红蛋白。
67.实施例1
68.本实施例提供一种负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂(hb-lip@dox)，具体采用如下方式制备：
69.1、荷载阿霉素的马来酰亚胺修饰脂质体(lip@dox)的制备
70.利用薄膜水化法制备荷载阿霉素的马来酰亚胺修饰脂质体，制备步骤具体为：
71.1)将65mg溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(dotap)、40mg胆固醇(dc-chol)、35mg马来酰亚胺修饰磷脂-聚乙二醇(mal-dspe-peg2000)溶于30ml二氯甲烷。搅拌进行反应后旋转蒸发除去乙醇并在容器壁上形成薄膜。
72.2)25mg盐酸阿霉素溶于10ml磷酸盐缓冲液。将阿霉素溶液加入薄膜容器中，使薄膜水化脂质体，使用25khz超声分散，分别过0.45μm和0.22μm微孔滤膜，即可得载阿霉素脂质体药物制剂。
73.2、负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂(hb-lip@dox)的制备
74.1)向血红蛋白溶液(60mg/ml)中加入抗坏血酸0.5mg，搅拌10min，密封，使其转化为氧合态血红蛋白；向氧合态血红蛋白溶液(60mg/ml)中通一氧化碳气体20min，密封，使其转化为一氧化碳态血红蛋白；向氧合态血红蛋白溶液(60mg/ml)中通一氧化氮气体20min，密封，使其转化为一氧化氮态血红蛋白。
75.2)将1ml氧合态血红蛋白的溶液(60mg/ml)，加入至担载阿霉素的马来酰亚胺修饰脂质体溶液中，氩气或一氧化碳或一氧化氮保护状态下，冰浴中搅拌12h。
76.3)将反应后的溶液通过葡聚糖凝胶g-250透析除去游离阿霉素药物和未键合的游离血红蛋白，分别过0.45μm和0.22μm微孔滤膜，即得携带不同气体的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体递药系统，即携带氧气的血红蛋白冠脂质体递药系统(o2hb-lip@dox)、携带一氧化碳的血红蛋白冠脂质体递药系统(cohb-lip@dox)、携带一氧化氮的血红蛋白冠脂质体递药系统(nohb-lip@dox)。将制备的最终产物以氩气或一氧化碳或一氧化氮保护，4℃保存。实验评价：
77.1、负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂(hb-lip@dox)的粒径形貌检测
78.将制备的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂通过动态光散射(dls)纳米粒度分析仪(nanobrook 90plus zeta)测定粒径分布，结果如图1所示，结果显示，携带不同气体的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂粒径分布在50～250nm。将负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂进行透射电镜观察。结果如图2的tem图片所示，得到的携带不同气体的负载阿
霉素的血红蛋白冠脂质体制剂粒径呈球形，粒径在50-250nm之间，分散均匀。
79.2、负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(hb-lip@dox)的载药量检测
80.将制备的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂使用二氯甲烷进行超声破乳，萃取出包裹的药物。使用高效液相色谱(hplc)对药物进行定量。阿霉素检测条件：色谱柱：c18柱(150
×
4.6mm)。流动相：正磷酸(5mol/l)：甲醇：乙腈：异丙醇＝5:3:8:4(v/v)，流速1.0ml/min，荧光检测激发波长450nm，样品进样体积20μl。
81.实验结果：如图3所示(不同阿霉素/纳米载体原料投料比(投料质量比)条件下的药物担载效率和载药量曲线图)，改变阿霉素/纳米载体原料投料比(阿霉素/血红蛋白+溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(dotap)+胆固醇+马来酰亚胺修饰磷脂-聚乙二醇)1:15，1:10，1:8，1:6，1:4，药物担载效率在26％～100％之间，可以控制载药量在2.5％～6％，当阿霉素/纳米载体原料投料比为1：8时，药物担载效率为48.2％，载药量为5.68％。因此，优选阿霉素/纳米载体原料＝1：8作为最优投药量(即，药物活性成分与血红蛋白修饰脂质体的质量比最优为1:8)。
82.其中，载药量＝负载阿霉素血红蛋白冠脂质体制剂内的阿霉素质量/负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂总质量
83.药物担载效率＝负载阿霉素血红蛋白冠脂质体制剂内的阿霉素质量/阿霉素投药质量
84.3、负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂(hb-lip@dox)的稳定性
85.将制备的负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂在37℃条件下ph值7.4的pbs(10％fbs，0.01m)中孵育24h，分别在1h，3h，6h，12h和24h通过动态光散射测定制备的负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂的粒径和pdi指数；将制备的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体递药系统在4℃条件下ph值7.4的pbs中孵育7天，分别在1天，2天，3天，4天，5天，6天和7天通过动态光散射测定血红蛋白修饰脂质体药物制剂的粒径和pdi指数。如图4所示，得到的制备的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂在37℃和4℃储存条件下粒径和pdi均保持稳定。
86.4、负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂(hb-lip@dox)的药物释放
87.负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂在不同ph(7.4、6.5、5.0)的pbs(0.01m、1ml)中溶解，包装在透析管中(mwco＝3500)。然后将试管浸泡在20ml pbs(ph：7.4、6.5或5.0)中，以80rpm连续摇晃。在不同时间间隔抽出1ml透析液，换上新鲜的pbs溶液。采用高效液相色谱法测定阿霉素的含量。计算阿霉素的相对释放率随时间的变化。实验结果显示负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体递药系统在生理环境(ph7.4，0.01m，37℃)中表现出较高的稳定性，48h内只释放了9％的阿霉素；在较低ph 6.5(肿瘤微环境ph),48h内释放了32％的阿霉素；ph 5.0(细胞内/溶酶体ph)条件下，48h内释放了57％以上的阿霉素。图5为血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂在37℃条件下ph值7.4，6.5，5.0pbs(0.01m)中的药物释放行为。
88.5、药代动力学检测
89.取balb/c雌性小鼠，体重16-18g，静脉注射小分子药物，脂质体阿霉素(市售)和负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂(hb-lip@dox)，给药量：阿霉素5mg/kg。再给药1min，5min，10min，20min，30min，1h，2h，4h，8h，12h后，通过眼眶取血得到小鼠血液，放于抗
凝管中。
90.3000r/min离心5min，取最上层血浆。
91.使用氯仿对血浆进行萃取，氯仿-甲醇(4:1)萃取液2ml混匀，高速离心(3000rpm，10min)后将下层有机层全部转移至另一试管中，重复萃取三次。将萃取液用氮气吹干，残渣加100μl甲醇溶解，精密吸取20μl通过hplc进行分析。
92.实验结果：通过单室模型计算，小分子阿霉素的血液半衰期为1.3h，脂质体阿霉素(市售)的血液半衰期为8.1h，负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体药物制剂(hb-lip@dox)半衰期为6.7h，图6为小分子阿霉素、脂质体阿霉素(市售)和负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂(hb-lip@dox)的血液药代动力学曲线。
93.6、负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂(hb-lip@dox)的原位乳腺癌模型小鼠的相对摄取率和靶向效率。
94.一).原位乳腺癌模型小鼠建立：
95.消化收集4t1小鼠乳腺癌细胞，以106个/ml的密度，接种0.1ml细胞到雌性balb/c小鼠乳房垫下，8天左右形成80mm3大小肿瘤块，12天左右形成200～300mm3大小肿瘤块。
96.二)肿瘤模型药物分布检测：
97.1)荷瘤balb/c小鼠24只。在肿瘤体积长到200～300mm3时，静脉注射小分子药物，脂质体阿霉素(市售)，负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(hb-lip@dox)。给药量：阿霉素5mg/kg，分别在1h，12h，24h和48h取小鼠心、肝、脾、肺、肾及肿瘤。
98.将各组织高速剪切得到组织匀浆液，再加入氯仿-甲醇(4:1)萃取液2ml混匀，高速离心(3000rpm，10min)后将下层有机层全部转移至另一试管中，重复萃取三次。将萃取液用氮气吹干。残渣加100μl甲醇溶解，精密吸取20μl通过hplc进行分析。
99.实验结果如图7所示：负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂给药组比小分子阿霉素给药组和脂质体阿霉素(市售)给药组在肿瘤中蓄积更多，滞留时间更长。小分子阿霉素给药后24h药物在肿瘤的蓄积量为1.97μg dox/g组织，脂质体阿霉素(市售)给药后24h药物在肿瘤的蓄积量为4.81μg dox/g组织，负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(hb-lip@dox)给药后24h药物在肿瘤的蓄积量为8.89μg dox/g组织。
100.三)m2型肿瘤巨噬细胞靶向性检测：
101.比较肝脏、肺组织中和肿瘤中m1型和m2型巨噬细胞在给药后24h对阿霉素的摄取
102.方法：流式细胞仪测定细胞中阿霉素的摄取情况(荧光强度)。
103.切除肝脏组织、肾脏组织和肿瘤组织，转移到培养皿中，切成小块(小于1mm3)。将片段悬浮在1ml消化液中(rpmi1640培养基中ⅰ型胶原酶400μg/ml，iv型胶原酶100μg/ml)，37℃持续搅拌0.5h。然后以1500rpm离心5min收集细胞。
104.用200目筛过滤。用红细胞裂解液消化细胞2min，收集细胞到5ml流式管内，350g，5min离心去上清。
105.加入200μl预冷的pbs重悬细胞，并摇匀，再次350g，5min离心去上清；
106.再加入200μl的pbs重悬细胞，立即上机检测。
107.测定激发波长480nm和发射波长590nm处的平均荧光强度mfi。
108.实验结果如图7所示：小分子阿霉素给药后24h药物在肿瘤m1型巨噬细胞中的流式荧光强度mfi：154，m2型巨噬细胞中的流式荧光强度mfi：132；脂质体阿霉素(市售)给药后
24h药物在m1型巨噬细胞中的流式荧光强度mfi：440，m2型巨噬细胞中的流式荧光强度mfi：339。负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(hb-lip@dox)给药后24h药物在m1型巨噬细胞中的流式荧光强度mfi：259，m2型巨噬细胞中的流式荧光强度mfi：1033。
109.小分子阿霉素给药组和脂质体阿霉素(市售)给药组中，药物在肝脏和肺中巨噬细胞内的蓄积较多，在肿瘤中m1型巨噬细胞内和m2型巨噬细胞内的比例接近，没有对m2型肿瘤相关巨噬细胞的特异靶向性。负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(hb-lip@dox)给药组中，药物在肝脏和肿瘤中巨噬细胞内的蓄积增加，特别是在肿瘤中的m2型巨噬细胞内蓄积更多，在m1型巨噬细胞内蓄积较少，证明负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(hb-lip@dox)对m2型肿瘤相关巨噬细胞有特异的靶向性。
110.7、负载阿霉素的血红蛋白冠修饰的脂质体药物制剂(hb-lip@dox)的原位乳腺癌模型小鼠药效学评价
111.荷瘤小鼠30只，在肿瘤增长到成80mm3大小时，随机分成5组，每组6只，分别为生理盐水组、小分子阿霉素组、脂质体阿霉素(市售)、携带氧气的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(o2hb-lip@dox)和携带一氧化碳的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(cohb-lip@dox)。给药剂量均为5mg dox/kg。所有动物分别在0、3、6天给药，共给药3次。每两天对小鼠肿瘤的直径进行测量，肿瘤体积的计算公式为：体积＝长
×
宽
×
宽/2。绘制小鼠肿瘤生长曲线，结果见图9。由图9可见，小分子阿霉素组和脂质体阿霉素(市售)仅能一定程度上抑制肿瘤的生长，12天后小鼠肿瘤体积增长至810mm3和630mm3左右，而携带氧气的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(o2hb-lip@dox)和携带一氧化碳的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(cohb-lip@dox)则能够很好的抑制肿瘤的生长，12天后小鼠肿瘤体积增长至350mm3和240mm3左右。证明本发明所制备的携带不同气体的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂有效的抑制肿瘤生长，并且负载不通气体能够起到不同的抑制效果。
112.小鼠生理生化指标测试：抑瘤实验结束后，将小鼠的血液通过促凝管进行收集。静置30min后，3000rpm离心5min，取上清进行生化指标测试，包括：alt(谷丙转氨酶)，ast(谷草转氨酶)，creat(肌酐)和bun(尿素氮)。
113.表1抑瘤实验结束后，将小鼠的血液生化指标
[0114][0115]
血液生化结果显示，与生理盐水组相比，各给药组的生化指标与肝功能相关的ast，alt以及与肾功能相关的各种指标包括creat和bun均在正常波动范围内，说明各药物在当前剂量下的长期毒性较小。
[0116]
病理分析：抑瘤实验结束后，将小鼠各器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤，用生理盐水清理干净后，用4％的多聚甲醛溶液固定，进行组织脱水，石蜡包埋。石蜡切片机上切取2μm厚的组织切片后，进行h&e染色。使用显微镜观察切片。结果见图10。由图10可见，各给药组小鼠的心，肝，脾，肺器官均没有受到任何影响，没有观察到病变的发生。而小分子dox给药组中肾组织均有一定的损伤，其肾小球发生了变小或融合，肾小球的壁有些消失，其他各给药组的肾组织相对正常，并没有发现明显的病变。生理盐水给药组中的肿瘤组织的核几乎完好，没有出现大片的坏死区域，而其他给药组肿瘤组织均出现大量的坏死区域，尤其是携带一氧化碳的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(cohb-lip@dox)组的坏死区域最为明显，进一步说明携带一氧化碳的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂(cohb-lip@dox)在对其他器官没有毒副作用的同时，对肿瘤造成最有效的杀伤。
[0117]
生存率考察：以肿瘤增长到成80mm3大小时记为第0天，记录各组小鼠的生存时间，绘制生存期曲线，结果见图11。由图11可见，携带不同气体的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂组能够显著延皮下荷瘤模型小鼠的生存时间。证明本发明所制备的携带不同气体的负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体制剂有效的抑制肿瘤的发生及发展。
[0118]
实施例2本实施例提供一种负载利福平的血红蛋白冠修饰的胶束药物制剂，具体采用如下方式制得：
[0119]
一、负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂(hb-micel@rif)的制备1.荷载利福平的马来酰亚胺修饰聚合物胶束的制备，利用溶剂沉淀法制备荷载利福平的马来酰亚胺修饰聚合物胶束，制备步骤具体为：
[0120]
1)将140mg n-羟基琥珀酰亚胺修饰聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸(mal-peg-plga)溶于8ml二甲基亚砜(dmso)中，获得含有马来酰亚胺修饰聚合物胶束的溶液。
[0121]
2)在上述溶液中，加入1ml含25mg/ml利福平的dmso溶液，获得聚合物/药物混合溶液。
[0122]
3)将聚合物/药物混合溶液缓慢滴加入30ml去离子水，室温下搅拌1h。
[0123]
4)去离子水透析48h，除去未担载的游离利福平药物，分别过0.45μm和0.22μm微孔滤膜，即可得载利福平的聚合物药物制剂。
[0124]
2.负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂(hb-micel@rif)的制备
[0125]
1)向血红蛋白溶液(60mg/ml)中加入抗坏血酸0.5mg，搅拌10min，密封，使其转化为氧合态血红蛋白。
[0126]
2)将1ml氧合态血红蛋白的溶液(60mg/ml)，加入至担载利福平的马来酰亚胺修饰聚合物胶束溶液中，氩气保护状态下，冰浴中搅拌12h。
[0127]
3)将反应后的溶液通过葡聚糖凝胶g-250透析除去游离利福平药物和未键合的游离血红蛋白，分别过0.45μm和0.22μm微孔滤膜，即得负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂(hb-micel@rif)。将制备的最终产物以氩气保护，4℃保存。
[0128]
二、负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂(hb-micel@rif)的粒径形貌检测
[0129]
将制备的负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂通过动态光散射(dls)纳米粒度分析仪(nanobrook 90plus zeta)测定粒径分布，结果如图12所示，结果显示，负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂粒径分布在50-200nm。将负载阿霉素的血红蛋白冠脂质体递药系统进行透射电镜观察。结果如图13的tem图片所示，得到的携带不同气体的负载阿霉
素的血红蛋白冠脂质体递药系统粒径呈球形，粒径在50-200nm之间，分散均匀。
[0130]
三.负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂(hb-micel@rif)的载药量检测
[0131]
将制备的负载利福平的血红蛋白修饰聚合物胶束制剂使用二氯甲烷进行超声破乳，萃取出包裹的药物。使用高效液相色谱(hplc)对药物进行定量。
[0132]
利福平监测条件：色谱柱：c18柱(150
×
4.6mm)。流动相：甲醇：0.02mol/l磷酸二氢钾＝75:25(v/v)；流速1.0ml/min；荧光检测激发波长280nm，柱温：室温；样品进样体积20μl。
[0133]
实验结果：如图14所示(不同利福平/纳米载体投料比条件下的药物担载效率和载药量曲线图)，改变利福平/纳米载体原料投料比(即，利福平/血红蛋白+聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸的质量比)1:15，1:10，1:8，1:6，1:4，药物担载效率在35％～100％之间，可以控制载药量在2％～8％，当利福平/纳米载体原料投料比为1:8时，药物担载效率为60.7％，载药量为7.05％。因此，优选利福平/纳米载体原料＝1：8作为最优投药量(图12)(即，药物活性成分与血红蛋白修饰聚合物胶束的质量比最优为1:8)。
[0134]
其中，载药量＝负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂内的利福平质量/负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂总质量
[0135]
药物担载效率＝负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂内的利福平质量/利福平投药质量
[0136]
四、负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂(hb-micel@rif)的稳定性
[0137]
将制备的负载利福平的血红蛋白修饰聚合物胶束制剂在37℃条件下ph值7.4pbs(10％fbs，0.01m)中孵育24h，分别在1h，3h，6h，12h和24h通过动态光散射测定血红蛋白修饰聚合物药物制剂的粒径和pdi指数；将制备的负载利福平的血红蛋白修饰聚合物胶束制剂在4℃条件下ph值7.4pbs(0.01m)中孵育7天，分别在1天，2天，3天，4天，5天，6天和7天通过动态光散射测定负载利福平的血红蛋白修饰聚合物胶束制剂的粒径和pdi指数(聚合物分散性指数，用于描述聚合物分子量分布，pdi越大，分子量分布越宽；pdi越小，分子量分布越均匀)。如图15所示负载利福平的血红蛋白修饰聚合物胶束制剂在37℃条件下，ph值7.4pbs(10％fbs，0.01m)中，和在4℃条件下ph值7.4pbs(10％fbs，0.01m)中的稳定性。结果显示，得到的负载利福平的血红蛋白修饰聚合物胶束制剂在37℃和4℃储存条件下粒径和pdi均保持稳定。
[0138]
五、负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂(hb-micel@rif)的药物释放
[0139]
负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂在不同ph(7.4、6.5、5.0)的pbs(0.01m、1ml)中溶解，包装在透析管中(mwco＝3500)。然后将试管浸泡在20ml pbs(ph：7.4、6.5或5.0)中，以80rpm连续摇晃。在不同时间间隔抽出1ml透析液，换上新鲜的pbs溶液。采用高效液相色谱法测定利福平的含量。计算利福平的相对释放率随时间的变化。实验结果显示负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂在生理环境(ph7.4，0.01m，37℃)中表现出较高的稳定性，48h内只释放了11％的利福平；在较低ph6.5(肺结核结节微环境ph),48h内释放了37％的阿霉素；ph5.0(细胞内/溶酶体ph)条件下，48h内释放了61％以上的阿霉素。图16为负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂在37℃条件下ph值7.4，6.5，5.0pbs(0.01m)中的药物释放行为。
[0140]
六、药代动力学检测
[0141]
1)取c57雌性小鼠，体重16-18g，静脉注射小分子利福平、负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)和负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂，给药量：利福平5mg/kg。再给药1min，5min，10min，20min，30min，1h，2h，4h，8h，12h后，通过眼眶取血得到小鼠血液，放于抗凝管中。
[0142]
2)3000r/min离心5min，取最上层血浆。
[0143]
3)使用氯仿对血浆进行萃取，氯仿-甲醇(4:1)萃取液2ml混匀，高速离心(3000rpm，10min)后将下层有机层全部转移至另一试管中，重复萃取三次。将萃取液用氮气吹干，残渣加100μl甲醇溶解，精密吸取20μl通过hplc进行分析。
[0144]
实验结果：通过单室模型计算，小分子利福平的血液半衰期0.91h，负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)半衰期为9.4h，负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂半衰期为7.7h。如图17所示，为小分子利福平，负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)和负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂的血液药代动力学曲线。
[0145]
七、负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂(hb-micel@rif)的原位肺结核模型小鼠的相对摄取率和靶向效率。
[0146]
1、原位肺结核模型小鼠建立：
[0147]
取适量海分枝杆菌菌液，加入到7h9肉汤培养基中，在37℃细菌摇动培养箱中培养15-30天。当达到对数生长期时(od600＝0.8
±
0.2)，通过离心收集细菌，在pbs中洗涤两次，并用pbs稀释至最终浓度为2
×
108cfu/ml。通过静脉注射到雌性c57bl/6小鼠体内(100ul/只)。21天后通过h&e和抗酸染色证实，原位肺结核小鼠模型建立。
[0148]
2、肺结核模型药物分布检测
[0149]
c57小鼠24只，肺部灌注海分枝杆菌后2周静脉注射小分子利福平，负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)，负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂，给药量：利福平5mg/kg，分别在1，12，24和48小时取小鼠心、肝、脾、肺、肾。
[0150]
将各组织高速剪切得到组织匀浆液，再加入氯仿-甲醇(4:1)萃取液2ml混匀，高速离心(3000rpm，10min)后将下层有机层全部转移至另一试管中，重复萃取三次。将萃取液用氮气吹干,残渣
[0151]
加100μl甲醇溶解，精密吸取20μl通过hplc进行分析。
[0152]
实验结果：负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂给药组比小分子利福平给药组和负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)在m2型巨噬细胞数量较多的肝脏和肺中蓄积更多，滞留时间更长。小分子利福平给药后24h药物在肺的蓄积量为2.02μg利福平/g组织，负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)给药后24h药物在肺的蓄积量为3.22μg利福平/g组织，负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂给药后24h药物在肺的蓄积量为6.79μg利福平/g组织(如图17所示，小分子利福平、负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)和负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂给药24h后主要脏器中药物浓度)。
[0153]
3、考察结核结节在给药后24h对负载荧光探针的血红蛋白冠聚合物胶束制剂的摄取
[0154]
c57小鼠肺部灌注海分枝杆菌后2周静脉注射负载荧光探针的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)，负载荧光探针的血红蛋白冠聚合物胶束制剂，给药24h后，肺组织切片中
荧光探针(红色荧光)和cd163(m2型巨噬细胞，绿色荧光)、荧光探针(红色荧光)和cd86(m1型巨噬细胞，绿色荧光)免疫荧光染色。
[0155]
方法：收集肺组织标本，用冰冻仪制作6mm厚的冰冻切片。切片风干至少1h，然后在20℃的丙酮中固定10min，用20％的小鼠血清封闭后，分别与抗cd163的单抗，抗cd86的单抗在4℃孵育过夜，然后与二抗孵育1h。dapi染色10min后，用pbs洗涤两次，在激光共聚焦显微镜下观察。肺结核结节中制剂荧光探针(红色荧光)和cd163(绿色荧光)，制剂荧光探针(红色荧光)和cd86(绿色荧光)免疫荧光染色。
[0156]
实验结果：负载荧光探针的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)给药组中，制剂荧光探针红色荧光与cd163绿色荧光，与cd86绿色荧光均高度重合，因此判断负载荧光探针的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)对m2型巨噬细胞和m1型巨噬细胞没有选择性。负载荧光探针的血红蛋白冠聚合物胶束制剂给药组中，制剂荧光探针红色荧光与cd163绿色荧光高度重合，制剂荧光探针红色荧光与cd86绿色荧光重合性差，因此判断负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂能够靶向结核结节内cd163高表达的m2型巨噬细胞(如图18所示)。八、负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂(hb-micel@rif)的原位肺结核模型小鼠药效学评价
[0157]
c57小鼠48只，c57小鼠肺部灌注荧光转染的海分枝杆菌后2周随机分成4组，每组12只，分别为生理盐水组、小分子利福平组、负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)和负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂。给药剂量均为5mg利福平/kg。所有动物分别在0、3、6、9、12、15天给药，共给药6次。每7天每组处死3只小鼠，取肺部进行荧光成像，检测肺结核发展情况，结果见图19。由图19可见，小分子利福平和负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)仅能一定程度上抑制肺结核的发展，3周后小鼠肺部仍然具有强的菌荧光强度，存在大量海分枝杆菌。而负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂则能够很好的抑制结核的发展，3周后小鼠肺部荧光基本消失，海分枝杆菌基本被清除。证明本发明所制备的负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂有效的抑制肺结核发展。
[0158]
小鼠肺部cfu涂板：抗结核实验结束后，处死小鼠，取出小鼠肺组织，将器官和组织用组织研磨器研磨，过滤取滤液，连续稀释并在lb固体培养基上涂布。平板置于37℃培养箱中培养。培养1天后，记录菌落数，结果如图9所示。与对照组(生理盐水组)相比，小分子rif和负载利福平的聚合物胶束制剂(未修饰血红蛋白冠)均能在一定程度上杀伤海分枝结核杆菌，而负载利福平的血红蛋白冠聚合物胶束制剂的则能有效的杀伤海分枝结核杆菌，基本实现了完全抑制。
[0159]
小鼠生理生化指标测试：抗结核实验结束后，将小鼠的血液通过促凝管进行收集。静置30min后，3000rpm离心5min，取上清进行生化指标测试，包括：ast(谷草转氨酶)，alt(谷丙转氨酶)，urea(尿素)，crea(肌酐)和ua(尿酸)。
[0160]
表2抗结核实验结束后小鼠血液生化指标
[0161]
[0162][0163]
血液生化结果显示，与生理盐水组相比，各给药组的生化指标与肝功能相关的ast，alt以及与肾功能相关的各种指标包括creat和bun均在正常波动范围内，说明各药物在当前剂量下的长期毒性较小。
[0164]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种m2型巨噬细胞靶向的纳米药物制剂，其特征在于，包括药物活性成分和纳米载体；其中，所述纳米载体的表面键接有血红蛋白冠。2.根据权利要求1所述的纳米药物制剂，其特征在于，血红蛋白修饰纳米药物制剂的粒径为50～200nm。3.根据权利要求1或2所述的纳米药物制剂，其特征在于，血红蛋白冠采用如下方式键接在纳米载体上：血红蛋白通过表面的巯基基团与纳米载体表面的马来酰亚胺进行迈克尔加成反应，形成血红蛋白冠。4.根据权利要求1或2所述的纳米药物制剂，其特征在于，所述纳米载体为键接有血红蛋白冠的脂质体、胶束、纳米囊泡、外泌体、纳米微球、固体脂质纳米粒或纳米凝胶等药物载体输送系统。5.根据权利要求4所述的纳米药物制剂，其特征在于，制备所述脂质体的原料选自胆固醇、二油酰磷脂酰胆碱、磷脂磷脂酰胆碱、磷脂磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、n-羟基琥珀酰亚胺修饰磷脂-聚乙二醇、马来酰亚胺修饰磷脂-聚乙二醇、n-羟基琥珀酰亚胺修饰二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇、马来酰亚胺修饰二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇，或其衍生物中的一种或多种。6.根据权利要求4所述的纳米药物制剂，其特征在于，制备胶束的原料选自n-羟基琥珀酰亚胺修饰聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸或马来酰亚胺修饰聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸、n-羟基琥珀酰亚胺修饰聚乙二醇-聚己内酯或马来酰亚胺修饰聚乙二醇-聚己内酯、n-羟基琥珀酰亚胺修饰聚乙二醇-聚碳酸酯或马来酰亚胺修饰聚乙二醇-聚碳酸酯中的一种或多种。7.根据权利要求1～6任一项所述的纳米药物制剂，其特征在于，所述药物活性成分选自甲氨蝶呤、来氟米特、羟氯喹、利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、阿霉素、紫杉醇、吉西他滨、奥沙利铂、多柔比星、氟尿嘧啶、柔红霉素、甲氨蝶呤、多西他赛、卡培他滨、胰岛素、pd-1抗体、ctla-4抗体、小干扰rna、核酸适配体、维生素c中的一种或多种。8.根据权利要求7所述的纳米药物制剂，其特征在于，所述药物活性与所述纳米载体的重量比为1：4～15；优选的，所述药物活性成分与纳米载体原料的质量比为1:8；优选为1:6～10；更优选为1:8。9.权利要求1～8任一项所述的纳米药物制剂在用于制备治疗炎症疾病上药物或试剂上的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物或试剂具体为结核病、阴道炎、前列腺炎、肺炎、风湿性关节炎、狼疮性皮炎、癌症、脑卒药物或制剂。

技术总结
本发明涉及一种M2型巨噬细胞靶向的纳米药物制剂及其应用，所述纳米药物制剂包括药物活性成分和纳米载体；其中，所述纳米载体的表面键接有血红蛋白冠。本发明通过血红蛋白修饰含有传统药物活性成分的药物载体，可以起到靶向M2型巨噬细胞，递送氧气或一氧化碳的作用，能够有效的靶向炎症病发部位，提高药物在炎症部位的浓度，达到治疗炎症疾病效果。到达炎症部位的血红蛋白冠纳米药物制剂在炎症微环境的刺激下，快速解体，有利于将所负载的药物快速释放到靶部位，提高治疗效果，降低毒副作用。降低毒副作用。降低毒副作用。


技术研发人员：周东方 白晓春 王玉鹏 梁小玲 王伟
受保护的技术使用者：南方医科大学
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/4