一种反刍动物瘤胃调控用生物制剂及其制备方法与流程

faecium)培养得到。
6.优选的，所述酿酒酵母菌菌液的浓度≥108cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌菌液的浓度≥2*108cfu/ml；所述屎肠球菌菌液的浓度≥2*108cfu/ml。
7.本发明的第二方面，提供反刍动物瘤胃调控用生物制剂的制备方法，所述制备方法为：将豆渣-橘皮酶解物、酿酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液和屎肠球菌菌液混合均匀，即得反刍动物瘤胃调控用生物制剂；所述豆渣-橘皮酶解物由以下方法制备：（1）将新鲜的橘皮粉碎，与新鲜的豆渣混合均匀，于室温下静置得到混合物；（2）向步骤（1）得到的混合物中加入胃蛋白酶和纤维素酶进行酶解，酶解完毕进行灭酶，然后离心、取上清液进行浓缩得到豆渣-橘皮酶解物。
8.优选的，步骤（1）中，所述豆渣的含水率为50~70wt%；所述橘皮的含水率为15~25wt%；优选的，所述豆渣和橘皮的质量比为（1~9）：1。
9.优选的，步骤（1）中，所述静置的时间为6~12h。
10.优选的，步骤（2）中，所述胃蛋白酶和纤维素酶的质量比为1：1；所述胃蛋白酶的加入量占豆渣和橘皮总质量的3~7wt%。
11.优选的，步骤（2）中，所述酶解的温度为30~40℃，酶解时间为24~48h。
12.优选的，步骤（2）中，所述浓缩至：50℃下测，相对密度为1.15~1.25。
13.本发明的第三方面，提供反刍动物瘤胃调控用生物制剂在如下1）~ 3）至少一项中的应用：1）促进瘤胃氨态氮代谢；2）提高丙酸含量；3）提高产奶量和产奶质量。本发明的有益效果：（1）本发明采用廉价的豆渣和橘皮原料进行发酵，无需添加价格昂贵或提取过程复杂的的植物提取物或试剂，利用胃蛋白酶和纤维素酶进行酶解制备酶解产物，可以显著提高酿酒酵母调控反刍动物瘤胃发酵水平，且进一步提高了反刍动物的产奶量和产奶质量。
14.（2）本发明的生物制剂无毒副作用，制备方法简单，成本低，可长期使用；可以促进瘤胃氨态氮代谢、提高丙酸含量、提高产奶量和产奶质量。
具体实施方式
15.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
16.正如

背景技术：
部分介绍的，由于酵母菌价格低廉易得，提高荷斯坦泌乳奶牛的产奶量和产奶质量，但酿酒酵母在调控反刍动物瘤胃的应用中效果不稳定，有正效应的报道，也有无效应的报道。
17.基于此，本发明的目的是提供一种反刍动物瘤胃调控用生物制剂及其制备方法。本发明在研究前期，单独使用酿酒酵母效果不稳定，添加枯草芽孢杆菌和屎肠球菌后其效
果有了一定提升，为了降低成本通过试验了多种廉价的原料，如豆渣、玉米芯、麦麸等，对其进行酶解后与酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌配合使用，但效果均没有提升太多。在试验过程中，发明人误将橘皮碎渣落和静置处理的豆渣原料混合，对豆渣进行酶解处理时才发现，后将橘皮去除，继续试验，意外发现对于调控反刍动物瘤胃的效果有了提升，荷斯坦泌乳奶牛的产奶量也有提升。所以发明人以豆渣和橘皮为原料，不断改进制备方法，最终得到的生物制剂可以显著促进瘤胃氨态氮代谢、提高丙酸含量、提高产奶量和产奶质量。
18.在发明中，豆渣和橘皮混合后静置的时间不能太长，时间过长，豆渣的蛋白质会变质，只能用于作物的肥料使用。经后续研究发现，静置时间需控制在6~12h，由于橘皮也是酸性的，橘皮与豆渣混合静置会进行自然发酵，所以静置的时间需要严格控制，时间过长则无法制备本发明的生物制剂，不仅豆渣容易过度发酵，橘皮也容易长毛。本发明将豆渣与橘皮混合静置几小时，两者不仅能自然发酵得到较多有益菌，还能形成酸性环境，然后再添加胃蛋白酶和纤维素酶，在这种酸性环境下进酶解，豆渣与橘皮酶解后得到的有效成分可以显著提高酿酒酵母调控反刍动物瘤胃的能力，并且由于豆渣和橘皮都是废弃物，可以大大降低生物制剂的成本，使废弃物得到有效利用。
19.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
20.说明：酿酒酵母菌（saccharomyces cerevisiae）的菌种保藏号为：cctcc no：m2016460，购自中国典型培养物保藏中心。
21.枯草芽孢杆菌的保藏号为cicc no：10732；屎肠球菌的保藏号为ciccno：20430，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
22.经试验发现，橘皮的品种对于试验结果影响不大，本发明所用橘皮为芦柑皮。
23.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
24.实施例1：菌液的制备酿酒酵母菌（接种量占pda培养基总质量的10%）通过pda培养基30℃、120r/min摇床培养至菌浓度为108cfu/ml，得到酿酒酵母菌菌液。
25.枯草芽孢杆菌（接种量占lb培养基总质量的15%）通过lb培养基37℃、165r/min震荡培养至菌浓度为2*108cfu/ml，得到枯草芽孢杆菌菌液。
26.屎肠球菌（接种量占mrs培养基总质量的15%）通过mrs培养基37℃静置培养至菌浓度为2*108cfu/ml，得到屎肠球菌菌液。
27.实施例2（1）将400g新鲜的橘皮（含水率为22wt%左右）粉碎至10~20目，将粉碎后的橘皮添加至2kg新鲜的豆渣（含水率为60wt%左右）中，混合均匀，室温下（25℃）静置9h，得到混合物。
28.（2）向混合物中加入120g胃蛋白酶和120g纤维素酶，35℃酶解36h，酶解完毕进行110℃灭酶2min，然后离心、取上清液进行浓缩至相对密度为1.20（50℃下测）得到豆渣-橘皮酶解物。
29.豆渣-橘皮酶解物、实施例1制备的酿酒酵母菌菌液、实施例1制备的枯草芽孢杆菌
菌液和实施例1制备的屎肠球菌菌液按30g：1ml：0.1 ml：0.1 ml混合均匀，得到反刍动物瘤胃调控用生物制剂。
30.实施例3（1）将1kg新鲜的橘皮（含水率为25wt%左右）粉碎，然后添加至2kg新鲜的豆渣（含水率为70wt%左右）中，混合均匀，室温下静置6h，得到混合物。
31.（2）向步骤（1）得到的混合物中加入90g胃蛋白酶和90g纤维素酶，37℃酶解24h，酶解完毕进行110℃灭酶2min，然后离心、取上清液进行浓缩至相对密度为1.15（50℃下测）得到豆渣-橘皮酶解物。
32.豆渣-橘皮酶解物、实施例1制备的酿酒酵母菌菌液、实施例1制备的枯草芽孢杆菌菌液和实施例1制备的屎肠球菌菌液按10g：1ml：0.1 ml：0.1 ml混合均匀，得到反刍动物瘤胃调控用生物制剂。
33.实施例4（1）将300g新鲜的橘皮（含水率为16wt%左右）粉碎，然后添加至2.7kg新鲜的豆渣（含水率为50wt%左右）中，混合均匀，室温下静置12h，得到混合物。
34.（2）向步骤（1）得到的混合物中加入210g胃蛋白酶和210g纤维素酶，32℃酶解48h，酶解完毕进行110℃灭酶2min，然后离心、取上清液进行浓缩至相对密度为1.25（50℃下测）得到豆渣-橘皮酶解物。
35.豆渣-橘皮酶解物、实施例1制备的酿酒酵母菌菌液、实施例1制备的枯草芽孢杆菌菌液和实施例1制备的屎肠球菌菌液按50g：1ml：0.1 ml：0.1 ml混合均匀，得到反刍动物瘤胃调控用生物制剂。
36.对比例1将实施例1制备的酿酒酵母菌菌液、实施例1制备的枯草芽孢杆菌菌液和实施例1制备的屎肠球菌菌液按1ml：0.1 ml：0.1 ml混合均匀，得到反刍动物瘤胃调控用生物制剂。
37.对比例2将2kg新鲜的豆渣（含水率为60wt%左右）至于室温下静置9h。加入100g胃蛋白酶和100g纤维素酶，35℃酶解36h，酶解完毕进行110℃灭酶2min，然后离心、取上清液进行浓缩至相对密度为1.20（50℃下测）得到豆渣酶解物。
38.豆渣酶解物、实施例1制备的酿酒酵母菌菌液、实施例1制备的枯草芽孢杆菌菌液和实施例1制备的屎肠球菌菌液按30g：1ml：0.1 ml：0.1 ml混合均匀，得到反刍动物瘤胃调控用生物制剂。
39.对比例3将400g新鲜的橘皮（含水率为22wt%左右）粉碎至10~20目，室温下（25℃）静置9h。加入20g胃蛋白酶和20g纤维素酶，35℃酶解36h，酶解完毕进行110℃灭酶2min，然后离心、取上清液进行浓缩至相对密度为1.20（50℃下测）得到橘皮酶解物。
40.橘皮酶解物、实施例1制备的酿酒酵母菌菌液、实施例1制备的枯草芽孢杆菌菌液和实施例1制备的屎肠球菌菌液按30g：1ml：0.1 ml：0.1 ml混合均匀，得到反刍动物瘤胃调控用生物制剂。
41.对比例4（1）向2kg新鲜的豆渣（含水率为60wt%左右）中加入100g胃蛋白酶和100g纤维素
酶，35℃酶解36h，酶解完毕进行110℃灭酶2min，然后离心、取上清液进行浓缩至相对密度为1.20（50℃下测）得到豆渣酶解物；将400g新鲜的橘皮（含水率为22wt%左右）粉碎至10~20目，加入20g胃蛋白酶和20g纤维素酶，35℃酶解36h，酶解完毕进行110℃灭酶2min，然后离心、取上清液进行浓缩至相对密度为1.20（50℃下测），得到橘皮酶解物。
42.（2）将豆渣酶解物和橘皮酶解物按5：1的质量比混合得到混合酶解物。混合酶解物、实施例1制备的酿酒酵母菌菌液、实施例1制备的枯草芽孢杆菌菌液和实施例1制备的屎肠球菌菌液按30g：1ml：0.1 ml：0.1 ml混合均匀，得到反刍动物瘤胃调控用生物制剂。
43.对比例5将400g晒干的橘皮（含水率为6wt%左右）粉碎至10~20目，将2kg烘干的豆渣（含水率为6wt%左右）中粉碎，混合均匀，得到豆渣-橘皮混合物。
44.豆渣-橘皮混合物、实施例1制备的酿酒酵母菌菌液、实施例1制备的枯草芽孢杆菌菌液和实施例1制备的屎肠球菌菌液按30g：1ml：0.1 ml：0.1 ml混合均匀，得到反刍动物瘤胃调控用生物制剂。
45.对比例6将大豆粉以80%乙醇回流提取2次，每次1.5h， 80%乙醇与大豆粉的料液比为16：1，提取液过滤后得到大豆提取物。
46.将橘皮粉碎至10~20目，加入蒸馏水（料液比10：1）进行加热至100℃进行提取2次，每次提取30mim，过滤后浓缩至相对密度为1.20（50℃下测），得到橘皮提取物。
47.将大豆提取物和橘皮提取物按5：1的质量比混合，得到混合提取物。混合提取物、实施例1制备的酿酒酵母菌菌液、实施例1制备的枯草芽孢杆菌菌液和实施例1制备的屎肠球菌菌液按30g：1ml：0.1 ml：0.1 ml混合均匀，得到反刍动物瘤胃调控用生物制剂。
48.试验例选择体重为600kg左右且泌乳期在60天左右的健康荷斯坦奶牛110只，随机分为11组，散养。空白组饲喂全混合日粮(日平均泌乳量为26.5
±
2.5kg)，对照组饲喂全混合日粮+酿酒酵母，实施例2~4和对比例1~6组分别饲喂全混合日粮（组成见表1）+各组制备的生物制剂，按200mg/kg进行添加。
49.表1 全混合日粮的组成和营养水平
注：每千克预混料中含有：va800000iu，vd700000iu，ve10000iu，fe 1600mg，cu 1500mg，zn 10000mg，mn 3500mg，se 80mg，i120mg，co 50mg。
50.预试期10d，试验期20d，自由采食，每天记录产奶量，计算平均值；每天去各组所产牛奶，用milkyway-3快速乳成分分析仪检测牛奶的乳脂率(％)、乳蛋白质(％)。设定所测的牛奶的瞬时温度是在20-30℃之间，每个样本检测三次取平均值；再计算平均每天所产牛奶的乳脂率(％)、乳蛋白质(％)。所得结果见表2。
51.表2 奶牛产奶情况统计氨态氮和挥发性脂肪酸的试验参照《日粮中添加不同酵母培养物对泌乳中后期奶牛生产性能、血液生化指标及瘤胃发酵的影响》（闫碧川，2018）中3.3测定方法中规定的方
法进行试验：试验最后一天，禁食8h后，从口腔插入倒胃管采集瘤胃液内容物200ml。使用四层纱布进行过滤采集到的瘤胃液，过滤后的瘤胃液在4000r/min离心15min，然后取1ml上清液加入到样品瓶里，再将4.5ml0.2molhcl添加到样品瓶中，将上述溶液混匀用来测定铵态氮。同时使用移液枪移取4ml离心后的上清液于样品瓶中，然后向样品瓶中添加lml25%偏磷酸混匀，在-20℃下保存用于测定挥发性脂肪酸(vfa)。
52.将在-20℃下保存的样品放置室温进行融化，融化后的样品使用移液抢移取0.4ml混合溶液于10ml试管中，然后向试管中依次添加2mla液、2mlb液，摇匀，静置10分钟，用722分光光度计在波长700nm条件下进行比色。
53.标准曲线的制作：准确称取0.382g氯化氨，用0.2m的盐酸溶液溶解，定容至100ml，作为保存液，含氮量为lmg/ml。取10ml保存液用蒸馏水稀释至100ml，作为工作液即为含氮量为10mg/100ml的溶液。依次取工作液0，1，2，4，6ml分别置于50ml容量瓶中，分别加入蒸馏水10，9，8，6，4ml，再用0.2m盐酸定容，取0.4ml各溶液于l0ml试管中，依次加入a液、b液进行比色。用吸光度做自变量，溶液含氮量做因变量做标准曲线，求出回归公式。
54.a液；称取0.089g的亚硝基铁氰化钠，溶解于100ml14％的水杨酸钠溶液中。
55.b液：称取1.2g氢氧化钠溶解于100ml蒸馏水中，即为0.3m的氢氧化钠溶液，再加入2ml次氯酸钠溶液。
56.试验采用内标法测定挥发性脂肪酸，试验所用内标物为巴豆酸。取瘤胃液20ml在4000r/min离心15min，向25%偏磷酸与甲酸按3:l配制混合液1ml中加入4ml瘤胃上清液，混匀静置40min后，然后取1ml混合液并加入2g酸性的吸附剂(na2so4：50%h2s04：硅藻土为30:1:20)和40ml巴豆酸溶液(溶液为ch3cl3)，摇匀，静置至澄清后上机测定。使用日本岛津gc-7a气相色谱仪进行测定。色谱柱为内3mm，长2m不锈钢柱；柱温150℃，汽化室温度为230℃，气压力为0.35kg/cm，流量为140ml/min，氢气压力为1.2kg/cm2，流量为14ml/min。n2(载体)流量55ml/min，进样量lμl。所得结果见表3。
57.表3瘤胃内酸含量和氨态氮含量统计
由表2~3可以看出，实施例1~3组的生物制剂不仅可以有效降低奶牛瘤胃中的氨态氮，还能有效调整挥发性脂肪酸含量，乙酸/丙酸比显著下降。并且产奶量和产奶质量显著上升。说明本发明通过先将豆渣与橘皮混合发酵，再进行酶解得到的酶解产物可以显著提高酿酒酵母调控瘤胃发酵水平的能力。
58.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种反刍动物瘤胃调控用生物制剂，其特征在于，包括以下原料：豆渣-橘皮酶解物、酿酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液和屎肠球菌菌液；所述豆渣-橘皮酶解物、酿酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液和屎肠球菌菌液的加入量之比为（10~50）g：1ml：0.1ml：0.1ml；所述豆渣-橘皮酶解物由胃蛋白酶和纤维素酶酶解豆渣和橘皮得到；所述酿酒酵母菌菌液由保藏号为cctccno：m2016460的酿酒酵母菌（saccharomycescerevisiae）培养得到；所述枯草芽孢杆菌菌液由保藏号为ciccno：10732的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）培养得到；所述屎肠球菌菌液由保藏号为ciccno：20430的屎肠球菌(enterococcusfaecium)培养得到。2.根据权利要求1所述的生物制剂，其特征在于，所述酿酒酵母菌菌液的浓度≥108cfu/ml；所述枯草芽孢杆菌菌液的浓度≥2*108cfu/ml；所述屎肠球菌菌液的浓度≥2*108cfu/ml。3.权利要求1或2所述的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将豆渣-橘皮酶解物、酿酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液和屎肠球菌菌液混合均匀，即得反刍动物瘤胃调控用生物制剂；所述豆渣-橘皮酶解物由以下方法制备：（1）将新鲜的橘皮粉碎，与新鲜的豆渣混合均匀，于室温下静置得到混合物；（2）向步骤（1）得到的混合物中加入胃蛋白酶和纤维素酶进行酶解，酶解完毕进行灭酶，然后离心、取上清液进行浓缩得到豆渣-橘皮酶解物。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述豆渣的含水率为50~70wt%；所述橘皮的含水率为15~25wt%。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述豆渣和橘皮的质量比为（1~9）：1。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述静置的时间为6~12h。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述胃蛋白酶和纤维素酶的质量比为1：1；所述胃蛋白酶的加入量占豆渣和橘皮总质量的3~7wt%。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述酶解的温度为30~40℃，酶解时间为24~48h。9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，浓缩至50℃下测，相对密度为1.15~1.25。10. 权利要求1或2所述的反刍动物瘤胃调控用生物制剂在如下1）~3）至少一项中的应用：1）促进瘤胃氨态氮代谢；2）提高丙酸含量；3）提高产奶量和产奶质量。

技术总结
本发明公开了一种反刍动物瘤胃调控用生物制剂及其制备方法，属于生物工程技术领域。生物制剂由豆渣-橘皮酶解物、酿酒酵母菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液和屎肠球菌菌液按（10~50）g：1mL：0.1 mL：0.1 mL混合得到；豆渣-橘皮酶解物的制备方法为：将新鲜的橘皮粉碎，与新鲜的豆渣混合均匀，于室温下静置得到混合物；向混合物中加入胃蛋白酶和纤维素酶进行酶解，酶解完毕进行灭酶，然后离心、取上清液进行浓缩得到豆渣-橘皮酶解物。本发明以废弃物豆渣和橘皮原料进行酶解，得到的酶解产物可以显著提高酿酒酵母调控反刍动物瘤胃发酵水平，且进一步提高了反刍动物的产奶量和产奶质量。高了反刍动物的产奶量和产奶质量。


技术研发人员：王诚 王玲 孙华 王杰 王峰 仉弦 徐吉荣 王宁 周磊
受保护的技术使用者：山东健源生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/4